Efeitos da estimulação elétrica neuromuscular no músculo sóleo de ratos: análise morfométrica e metabólica

Resumos

The aim of this work was to evaluate the effect of phasic neuromuscular electric stimulation (ES) on morphometric and metabolic parameters of rats' soleus muscles for 3, 7and 15 days. Wistar rats were divided into four groups (n=5): control (C), ES for 3 days (ES-3), ES for 7 days (ES-7) and ES for 15 days (ES-15). Glycogen content, muscle mass, fibers area and area fraction of the intramuscular connective tissue were assessed. The statistical analysis was performed by ANOVA and Tukey (p<0.05). Regarding muscle mass, there was a significant increase in ES-15 (11.55%) compared to C. The glycogen content didn't show significant changes in ES-3 when compared to C. ES-7 and ES-15 showed the significant increase of 74.19% and 80.64%, respectively, compared to C. In the morphometric analysis, a significant increase in ES-15 (16.23%) compared to C was found. The area fraction of the intramuscular connective tissue didn't present significant changes in all groups submitted to ES when compared to C. The ES fostered an increase of the glycogen content in 7 and 15 days, as well as increased muscle mass, fibers area and glycogen content in 15 days.

Electric stimulation therapy; Rats Wistar; Morphology; Metabolism; Physiotherapy

ARTIGO ORIGINAL

Efeitos da estimulação elétrica neuromuscular no músculo sóleo de ratos: análise morfométrica e metabólica

João Luiz Quagliotti Durigan^I; Karina Maria Cancelliero^II; Rinaldo Roberto de Jesus Guirro^III; Carlos Alberto da Silva^III; Maria Luiza Ozores Polacow^III

^IProfessor Doutor do Departamento de Fisioterapia da Universidade Federal da Paraíba

^IIProfessora Doutora do Departamento de Fisioterapia da Faculdade Anhanguera de Piracicaba

^IIIProfessor Doutor PPG da Universidade Metodista de Piracicaba

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da estimulação elétrica neuromuscular (EE) fásica sobre os parâmetros morfométrico e metabólico do músculo sóleo de ratos, nos períodos de 3, 7 e 15 dias. Ratos Wistar foram divididos em 4 grupos (n=5): controle (C), EE por 3 dias (EE-3), 7 dias (EE-7) e 15 dias (EE-15). Foram analisado o conteúdo de glicogênio, massa muscular, área das fibras e densidade de área do tecido conjuntivo intramuscular. A análise estatística foi realizada pela ANOVA e Tukey (p<0,05). Com relação à massa muscular, ocorreu aumento significativo no EE-15 de 11,55% comparado ao C. O conteúdo de glicogênio muscular não apresentou alterações significativas no EE-3 quando comparado ao C. Já o EE-7 e EE-15 demonstraram aumento significativo de 74,19% e 80,64%, respectivamente, comparados ao C. Na análise morfométrica, ocorreu aumento significativo no EE-15 de 16,23% em relação ao C. A densidade do tecido conjuntivo intramuscular não apresentou alterações significativas em todos os grupos submetidos à EE quando comparados com o C. A EE promoveu aumento das reservas de glicogênio nos períodos de 7 e 15 dias, bem como aumento na massa muscular, área das fibras e nas reservas de glicogênio no período de 15 dias.

Descritores: Terapia por estimulação elétrica; Ratos Wistar; Morfologia ; Metabolismo; Fisioterapia.

INTRODUÇÃO

Os programas de fortalecimento muscular são procedimentos importantes e muito utilizados na clínica fisioterapêutica. Além da reabilitação, há outros objetivos para se produzir hipertrofia muscular, como o fator estético, bem como para se ter um melhor rendimento esportivo.

A estimulação elétrica neuromuscular (EE) tornou-se um importante recurso para a produção de hipertrofia muscular, especialmente após os relatos do médico russo Yakov Kots em 1977 apud Kramer et al.⁽¹⁾ que a EE podia produzir ganhos de força em atletas de elite em valores de 30 a 40% maiores do que aqueles produzidos pela contração voluntária máxima do músculo

Embora os seus protocolos experimentais não fossem bem documentados e seus resultados nunca puderam ser reproduzidos no ocidente, seus relatos contribuíram para ampliar os estudos da relação entre a EE e o fortalecimento muscular. Desde então, os estudos desenvolvidos parecem dar suporte à afirmação que esse recurso pode fortalecer músculos tanto de indivíduos sadios^(2,3) quanto aos submetidos à condição de desuso muscular^(3,4).

No âmbito da experimentação com animais, a maioria dos estudos envolvendo a EE utilizou protocolos crônicos, ou seja, por longos períodos, além de eletrodos implantados. Esses estudos demonstraram que o recurso predispõe mudança das fibras rápidas (IIB) para lenta (IIA e I), aumento da resistência à fadiga com redução da sua tensão tetânica, aumento da densidade dos capilares e perfusão, além do aumento do conteúdo de mioglobinas e das células satélites^(5,6).

Além disso, o aumento da atividade contrátil quer seja pela atividade física constante ou pela EE, promove a translocação de uma população de transportadores (GLUT4) insensíveis à insulina até a membrana melhorando a captação da glicose pelos músculos⁽⁷⁾.

Apesar dos diversos trabalhos que abordaram a EE aplicada de forma crônica, a literatura é escassa com relação à sua aplicação em curtos períodos (fásica). Nesse contexto, Noronha et al.⁽⁸⁾ não observaram transformações no tipo de fibra, bem como hipertrofia no músculo tibial anterior de ratos estimulados em dias alternados com eletrodos de superfície (6 minutos, 3x/semana, 8 semana). Por outro lado, foi demonstrado aumento significativo na síntese de proteínas miofibrilares e sarcoplasmáticas avaliadas após 3 horas de estimulação (100 Hz, T_ON: 3s, T_OFF: 10s, eletrodos implantados, durante 20 minutos) no músculo sóleo e extensor longo dos dedos de ratos⁽⁹⁾.

Embora existam alguns estudos em animais indicando que a EE pode produzir fortalecimento, hipertrofia muscular e alterações metabólicas, a forma de estimulação empregada pode ser um problema clínico, inviabilizando sua aplicação em humanos, uma vez que estes trabalhos utilizaram protocolos de EE crônicos (semanas e até meses) e/ou eletrodos implantados.

Pautado na observação que são escassos os trabalhos com animas que indiquem transformação estrutural e metabólica por meio da EE, mimetizando os parâmetros que são utilizados em humanos, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da EE fásica sobre os parâmetros morfométrico e metabólico no músculo sóleo de ratos, nos períodos de 3, 7 e 15 dias.

MATERIAIS E MÉTODOS

Ratos Wistar (3 a 4 meses, 250-300g) foram mantidos sob condições controladas de biotério, recebendo água e ração ad libitum e tratados segundo recomendações do Guide for Care Use of Laboratory Animals⁽¹⁰⁾. O trabalho foi aprovado pelo comitê de ética em experimentação animal da Universidade Federal de São Carlos (protocolo 010/2006).

Os animais foram divididos em 4 grupos (n=5): controle (C), estimulação elétrica durante 3 dias (EE-3), 7 dias (EE-7) e 15 dias (EE-15).

Após anestesia com pentobarbital sódico (50 mg/Kg peso), o membro posterior esquerdo foi tricotomizado e a EE foi realizada em sessão diária de 20 minutos, por um período de 3, 7 e 15 dias. Um eletrodo foi colocado na região inguinal e o outro sobre o músculo tríceps sural. Os parâmetros da estimulação elétrica foram: freqüência de 10 Hz, fase de 0,4 ms e pulso quadrático bifásico. A intensidade da corrente foi padronizada em 5.0 mA, a partir da visualização da contração muscular, sendo acrescida de 1.0 mA a cada 5 minutos, com objetivo de manter uma contração efetiva durante todo o período da sessão. Os eletrodos de silicone-carbono apresentavam área de 1cm² cada.

Após o período experimental, as análises realizadas foram: conteúdo de glicogênio do músculo sóleo, além da massa, área das fibras e densidade de área do tecido conjuntivo intramuscular.

Para a determinação do glicogênio muscular seguiu-se a proposta descrita por Lo et al.⁽¹¹⁾, que consta da digestão das amostras musculares em KOH 30% a 100ºC e o glicogênio precipitado a partir da passagem por etanol. Entre uma fase e outra da precipitação, a amostra foi centrifugada a 3000 rpm (rotação por minuto) durante 15 minutos e o glicogênio precipitado foi submetido à hidrólise ácida na presença de fenol. Os valores foram expressos em mg/100mg de peso úmido.

Para a análise morfométrica do músculo sóleo, o seu segmento ventral foi fixado em solução tamponada de formalina e o material foi processado em parafina obtendo-se vários cortes transversais não seriados de 7μm de espessura, que foram corados pela Hematoxilina-Eosina (HE). Foi utilizado um sistema de análise de imagens constituído de um software Image Pró-plus 4.0 (Media Cybernects), câmera digital (JVC) acoplada a um microscópio (Zeiss) com integração a um microcomputador. Todas as imagens foram captadas com objetiva de 10x. Foram analisadas as áreas de 375 fibras por animal, assim escolhidos: 15 fibras por área, sendo 5 áreas por corte, num total de 5 cortes por animal. Utilizou-se de um retículo quadriculado para a escolha de 15 fibras por corte, aleatoriamente, que coincidiam com as interseções de retas.

Para a análise da densidade do tecido conjuntivo intramuscular foi utilizado o sistema de planimetria por contagem de pontos⁽¹²⁾ e a quantificação foi realizada por meio de um retículo com quadrados de 2500μm² contendo 56 intersecções de reta. Foram contados os pontos coincidentes no endomísio e perímisio, em 5 áreas por corte, sendo 5 cortes por animal, perfazendo um total de 1400 pontos por animal. A área relativa do tecido conjuntivo (densidade de área) foi calculada dividindo-se a soma do número de pontos coincidentes nas intersecções de reta sobre o tecido conjuntivo (endomísio e perimísio) pelo número total de pontos.

A análise estatística foi realizada inicialmente pelo teste de normalidade Kolmogorov-Smirnov e pelo teste de homocedasticidade (critério de Bartlett). Após a observação que as variáveis contemplaram a metodologia paramétrica, foi utilizado a ANOVA e teste F sendo que, quando a diferença apresentada foi significante, aplicou-se o teste de Tukey HSD para as comparações múltiplas. Para todos os cálculos, foi estabelecido um nível de significância de 5%.

RESULTADOS

Com relação a massa, não foi observado alteração significativa nos grupos EE-3 e EE-7 quando comparados ao C, porém ocorreu aumento (p<0,05) no EE-15 de 11,55% comparado ao C. Além disso, EE-15 apresentou aumento (p<0,05) em relação ao EE-3, bem como ao EE-7, de 9,53% e 8,93%, respectivamente, sendo que o EE-3 não se diferiu significativamente do EE-7.

O conteúdo de glicogênio muscular não apresentou alterações significativas no EE-3 quando comparado ao C. Já o EE-7 e EE-15 demonstraram aumento (p<0,05) de 74,19% e 80,64%, respectivamente, comparados ao C, destacando que os mesmos não se diferiram significativamente.

Na análise morfométrica, os grupos EE-3 e EE-7 não apresentaram alterações significativas na área das fibras musculares quando comparados ao C, sendo que no EE-15 ocorreu aumento (p<0,05) de 16,23% em relação ao C. Além disso, o EE-15 apresentou aumento (p<0,05) de 20,78% quando comparado ao EE-3 e de 14,94% ao EE-7, destacando que o EE-3 não demonstrou diferença significativa ao EE-7.

A densidade do tecido conjuntivo intramuscular não apresentou alterações significativas em todos os grupos submetidos à EE quando comparados com o C, bem como aos grupos submetidos à intervenção. Todos os valores podem ser observados na Tabela 1 e Figura 1.

DISCUSSÃO

Vários trabalhos foram realizados demonstrando a eficácia da EE em promover alterações no sistema músculo esquelético, tais como transição das fibras musculares, aumento da resistência à fadiga, da densidade e perfusão dos capilares, conteúdo de mioglobinas, células satélites, da captação da glicose, bem como redução da sua tensão tetânica^(5,6). Entretanto, a forma de estimulação nesses estudos não mimetiza a prática clínica, já que foram utilizados protocolos com eletrodos implantados por um período de semanas e até meses, inviabilizando sua aplicação em humanos.

No presente trabalho, o protocolo com curtos períodos de aplicação e eletrodos de superfície contempla a prática clinica. Nessa condição experimental, foi observado que a EE promoveu aumento do conteúdo de glicogênio no músculo sóleo no sétimo dia, além do aumento da sua massa, área das fibras e glicogênio no décimo quinto dia. Tal fato demonstra a inter-relação da atividade contrátil com a homeostasia energética e a morfologia da fibra muscular, apontando para o quadro de hipertrofia muscular.

Alguns trabalhos demonstraram resultantes semelhantes, porém com utilização de estimulação crônica e ou uso de eletrodos implantados. Egginton e Hudlick⁽¹³⁾ utilizaram a EE (10 Hz, 8 horas/dia) durante 3 dias em ratos, aplicada com eletrodo implantado no nervo fibular, observaram aumento de 12% na massa do músculo tibial anterior, além de aumento do fluxo sanguíneo.

Na mesma linha, Atherton et al.⁽⁹⁾ demonstraram que o recurso, utilizado com freqüência de 100 Hz, T_ON 3s, T_OFF 10s, durante 20 minutos, com eletrodos implantados, promoveu aumento significativo da síntese de proteínas miofibrilares e sarcoplasmáticas avaliadas após 3 horas de estimulação nos músculos sóleo e extensor longo dos dedos de ratos.

Apesar da escassez de trabalhos sobre a EE com curtos períodos, bem como eletrodos de superfície, Noronha et al.⁽¹²⁾ analisaram os efeitos da EE no músculo tibial anterior de ratos (freqüência 52 Hz, T_ON 10s, T_OFF 10s e subida de 2s), após 8 semanas, 3 vezes por semana, com 20 contrações em cada sessão, em dias alternados, respeitando os finais de semana. Os autores não observaram hipertrofia muscular ou transformações no tipo de fibra.

Os resultados apresentados no presente estudo diferem dos encontrados por Noronha et al.⁽¹²⁾, apesar dos dois trabalhos utilizarem a EE por curtos períodos e eletrodos de superfície. Esse fato se justifica pela diferença nos parâmetros da corrente, bem como no tipo de contração eliciada eletricamente. Possivelmente, o grande número de contrações não tetânicas (12000 por sessão) foi suficiente para promover alterações morfológicas e metabólicas no músculo sóleo, fato não observado no trabalho citado, que utilizou um total de 480 contrações tetânicas de 10 segundos cada. Outra diferença está na freqüência utilizada, já que a freqüência de 10 Hz despolariza seletivamente os motoneurônios das fibras musculares do tipo I.

A hipertrofia muscular observada nesse estudo, caracterizada pelo aumento da massa muscular e área das fibras do sóleo durante 15 dias de EE, pode ser explicada pelo fato de que esse estímulo ativa uma cascata de eventos que se caracteriza na transdução de um sinal ainda desconhecido, que regulam a expressão de fatores específicos do crescimento do músculo tais como IGF-1, fator de crescimento mecânico (MGF), bem como a miostatina. Dessa forma, alguns trabalhos demonstraram que a EE promove aumento da síntese de proteínas intramusculares, resultando em hipertrofia muscular^(9,14,15).

A importância dos estudos que avaliam o conteúdo muscular de glicogênio se fundamenta nas relações diretas entre estas reservas e a capacidade aeróbia ou de desempenho do organismo, de forma que as alterações no perfil enzimático e nas reservas glicogênicas são responsáveis pela redução da eficiência muscular, assim como o desenvolvimento do estado de exaustão⁽¹⁶⁾.

Nesse contexto, a EE também promoveu elevação nas reservas de glicogênio nos períodos de 7 e 15 dias. Tal fato pode ser justificado pela maior captação de glicose pela população de GLUT4, insensível à insulina, que são externalizados, e decorre, ainda, da ativação dos sistemas enzimáticos citosólicos na glicogênese⁽¹⁷⁾. Certamente, a EE promove elevação na atividade contrátil das fibras musculares, desse modo a dinâmica de captação e metabolismo da glicose e a atividade das vias metabólicas celulares são aumentadas⁽¹⁸⁾.

Etgen et al.⁽⁷⁾ avaliaram o conteúdo de GLUT4 no músculo plantar de ratos após EE crônica, e verificaram aumento de 82% em seu conteúdo. Períodos maiores de EE, 30 a 40 e 60 a 90 dias, mostraram somente tendência ao aumento no conteúdo do GLUT4, atingindo um platô em torno de 30 a 40 dias. Um resultado importante do estudo de Hamada et al.⁽¹⁹⁾ foi que a captação de glicose corporal em ratos é agudamente aumentada em resposta a 20 minutos de EE e este aumento perdura por pelo menos 90 minutos após a finalização da utilização do recurso.

Apesar das análises desse estudo demonstrar alterações tanto morfológicas, como metabólicas, não foram realizadas avaliações funcionais no músculo sóleo, como por exemplo, da força muscular, para observar se houve alguma alteração no padrão de recrutamento das unidades motoras que por sua vez também apresenta influência na força contrátil.

Além disso, considerações devem ser feitas com relação às diversas pesquisas que demonstram falhas na descrição dos parâmetros metodológicos utilizados na EE. Para Robison e Snyder⁽²⁰⁾, existem falhas nas descrições dos métodos, já que muitos estudos não registram completamente detalhes experimentais importantes, tais como parâmetros de treinamento e características físicas da corrente. Porém, nos últimos anos tem ocorrido um maior controle de variáveis e uma maior uniformidade dos métodos de pesquisa. Dessa forma, torna-se extremamente importante a padronização dos estudos que envolvem a EE para possibilitar a reprodutividade, bem como comparações entre os diversos trabalhos.

CONCLUSÃO

A EE promoveu aumento das reservas de glicogênio no músculo sóleo de ratos durante 7 dias, bem como aumento na sua massa muscular, área das fibras, e nas reservas de glicogênio no período de 15 dias. Desse modo, destaca-se a importância da intervenção utilizando-se da EE, com objetivo de promover hipertrofia muscular, demonstrando a inter-relação da atividade contrátil com a homeostasia energética, bem como com a morfologia da fibra.

Artigo recebido em 13/08/07

aprovado em 24/01/08

Trabalho realizado na Universidade Metodista de Piracicaba, SP - Brasil.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Nov 2008
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Aceito
  24 Jan 2008
• Recebido
  13 Ago 2007