O Zoledronato no tratamento da osteoporose umeral em ratas: estudo prospectivo e randomizado

Resumos

OBJECTIVE: To evaluate the clinical, biomechanical and histomorphometric effects of zoledronate in the humerus of ovariectomized rats. METHODS: Forty female rats (Rattus norvegicus albinus) were prospectively evaluated. Within 60 days, animals were randomized into two groups: ovariectomy (O) (n=20) or sham surgery (P) (n=20). Within 90 days, groups "O" and "P" were subdivided into four groups, according to the administration of zoledronate (AZ) or deionized water (AD): OAZ (n=10), OAD (n=10), PAZ (n=10) and PAD (n=10). Within 15 months, animals were sacrificed. Body weight was used for clinical study, axial compression tests for the biomechanical study and cancellous bone area for the histomorphometric study. RESULTS: Ovariectomized groups had greater body weight gain than the sham groups (p=0.005). Zoledronate groups had greater body weight gain compared to the deionized water groups (p=0.68). Maximum load support was greater in the groups treated with zoledronate (p=0.02). An increase in cancellous bone area was noted in the groups treated with zoledronate (p=0.001). A positive correlation was shown in the evaluation of cancellous area and maximum load (p=0.04; r=0.95). CONCLUSIONS: Zoledronate had no effect on animals' body weight. Groups treated with zoledronate had increased maximum load support and cancellous bone area.

Osteoporosis; Menopause; Therapeutics; Biomechanics

ARTIGO ORIGINAL

O Zoledronato no tratamento da osteoporose umeral em ratas. Estudo prospectivo e randomizado

Evandro Pereira Palacio^I; Eduardo Martinelli Jacob^I; Thiago Balthazar Campi^I; Sérgio Swain Müller^II

^IDepartamento de Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Medicina de Marília/Famema - Marília. SP

^IIDepartamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina de Botucatu/Unesp - Botucatu. SP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Investigar as repercussões clínicas, biomecânicas e histomorfométricas do zoledronato no tratamento da osteoporose umeral em ratas osteoporóticas.

MÉTODOS: Analisou-se, prospectivamente, 40 ratas (Rattus novergicus albinus). Com 60 dias de vida, foram aleatorizadas em dois grupos de acordo com o procedimento cirúrgico: ooforectomia bilateral (O) (n=20) e pseudo-cirurgia (P) (n=20). Após trinta dias, os animais foram novamente randomizados, de acordo com a administração de 0,1mg/kg de zoledronato (AZ) ou água destilada (AD): OAZ (n=10), OAD (n=10), PAZ (n=10) e PAD (n=10). Após doze meses, os animais foram eutanasiados e seus úmeros retirados. Clinicamente considerou-se o peso dos animais; biomecanicamente foram realizados ensaios compressivos e histomorfometricamente foi determinada a área trabecular óssea.

RESULTADOS: Os grupos "O" tiveram um aumento de peso maior que os grupos "P" (p=0,005). Os grupos com zoledronato suportaram maior carga máxima que os grupos com água destilada (p=0,02). Nos grupos com zoledronato verificou-se o aumento da área trabecular óssea quando comparados aos grupos com água destilada (p=0,001). Houve correlação positiva entre a área trabecular e a carga máxima (p=0,04; r=0,95).

CONCLUSÃO: O zoledronato não influiu no peso dos animais. Os resultados mostraram o aumento da resistência óssea umeral e da área trabecular óssea.

Descritores: Osteoporose. Menopausa. Terapêutica. Biomecânica.

INTRODUÇÃO

A osteoporose é definida como uma desordem do tecido ósseo, caracterizada pelo comprometimento de sua resistência física. Trata-se, na realidade, de uma doença metabólica, em que ocorre perda gradual da massa óssea, com conseqüente deterioração de sua microarquitetura,¹ aumentando o risco de fraturas.

A homeostase óssea é o principal mecanismo de balanço e renovação deste tecido. Na fase de crescimento, o balanço desta renovação é positivo, equilibra-se na maturidade e, após os 40 anos, em média, passa a ser negativo. A perpetuação deste balanço negativo aos longos dos anos é o principal responsável pela osteoporose primária. O advento da menopausa acelera esta reciclagem metabólica negativa, causando a chamada osteoporose pós-menopáusica. Em média, aos 65 anos, a mulher já perdeu cerca de 25% da massa óssea.^2,3 Estudos estimam que, nos Estados Unidos, os custos gerados por fraturas decorrentes da osteoporose giram em torno de 12,6 bilhões de dólares/ano.⁴

Como em todas as áreas médicas, o tratamento da osteoporose apresenta uma característica muito mais preventiva que curativa, através, principalmente, de mudança de hábitos de vida e de atividade física. Contudo, anualmente, a indústria farmacêutica oferece grandes variedades de medicamentos para o tratamento desta enfermidade, como os bisfosfonatos, substâncias que aumentam a massa óssea, ou antes, diminuem sua reabsorção. Muitos também são os efeitos adversos causados pela administração contínua destes fármacos, o que diminui, em grande escala, a adesão dos pacientes ao tratamento.

Com base em tais informações, objetivou-se com este estudo, analisar os efeitos do zoledronato, uma nova e poderosa droga anti-reabsortiva, em dose única anual, em úmeros de ratas ooforectomizadas, através de estudos clínicos, biomecânicos e histomorfométricos.

MÉTODOS

Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal sob o nº 622/2007. Foram utilizadas 40 ratas (Rattus novergicus albinus), linhagem Wistar, sexualmente maduras e virgens, procedentes do Biotério Central da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" (UNESP) - Campus de Botucatu.

Os animais, à recepção, depois de clinicamente avaliados e pesados, foram alojados em grupos de cinco, em oito gaiolas de polipropileno com tampa de grade de metal e forradas com maravalha de pinho autoclavada. Estas eram limpas diariamente e mantidas em local seco e arejado, com temperatura ambiente controlada em 24º C e ciclo de luz claro/escuro de 12 horas. Foi oferecido aos animais ração para roedores (Labina^®, Nestlé Purina PetCare Company^©) e água ad libitum.

Aos 60 dias de vida, após atingirem a maturidade sexual, foram identificados, através de perfurações na região auricular direita e esquerda, e aleatorizados, pelo método de sorteio de envelopes opacos lacrados, em dois grupos de acordo com o procedimento cirúrgico a que seriam submetidos: grupo ooforectomia (O) (n=20) e grupo pseudo-cirurgia ("sham") (P) (n=20).

O procedimento de castração foi realizado após anestesia, intraperitoneal, com 30 mg/kg de pentobarbital sódico 3%, e tricotomia, bilateral, logo abaixo da última costela, dorso-lateralmente. Foram submetidos à assepsia com água e sabão, anti-sepsia com polivinilpirrolidona-iodo tintura (PVPI-tintura) e posicionados em mesa cirúrgica, em decúbito lateral. Após a colocação de campo estéril ocular, foi realizada uma incisão transversal na pele de, aproximadamente, 1,5 centímetros de comprimento, entre a última costela e a articulação coxofemoral. Com auxílio de uma pinça, a cavidade peritoneal foi exposta, ultrapassando o plano muscular por divulsão, permitindo acesso ao ovário envolto em tecido adiposo. (Figura 1)

Procedeu-se à ligadura do ovário com fio de algodão 3.0 e secção do mesmo distalmente à ligadura. A musculatura e a pele foram aproximadas com fio de nylon 4.0, repetindo-se os mesmos procedimentos no lado contralateral para retirada do outro ovário. Os animais do grupo P foram submetidos aos mesmos procedimentos cirúrgicos descritos, com exceção do tempo cirúrgico de ligadura e secção dos ovários.

Aos 90 dias de vida e após nova aleatorização, os grupos "O" e "P", foram subdivididos em quatro subgrupos de acordo com a administração, intraperitoneal, de 0,1mg/kg^5,6 de zoledronato (AZ) (Aclasta^TM, Novartis^® Biociências S.A.) ou água destilada (AD), assim: OAZ (n=10), OAD (n=10), PAZ (n=10) e PAD (n=10). Para administração das substâncias utilizou-se seringa estéril para insulina, com agulha fixa, marca Injex Stilly Line^® (1ml/cc, agulha 12,7mm x 0,30 - 30G 1/2'').

Doze meses após a administração do zoledronato ou água destilada, os animais foram eutanasiados, com dose letal, intraperitoneal, de 80mg/kg de pentobarbital sódico 3%.

Após a eutanásia, os úmeros dos animais foram desarticulados na região proximal (ombro) e distal (cotovelo), com a retirada das partes moles (músculos, tendões e ligamentos). Para o ensaio biomecânico, os úmeros direitos foram embalados em papel alumínio, identificados e congelados por 24 horas, em refrigerador doméstico, à temperatura de -20ºC. Os úmeros esquerdos foram acondicionados em recipientes de vidro, limpos e devidamente identificados, e fixados em solução de formaldeído 10%, para a realização do estudo histomorfométrico.

Estudo clínico

O estudo clínico foi realizado através da análise da massa corpórea dos animais (g). As medições foram realizadas mensalmente e sempre no mesmo dia, durante todo o experimento, utilizando-se balança digital com capacidade de seis quilogramas-força e variação de cinco gramas. A aferição da balança era realizada trimestralmente por pessoal técnico.

Estudo biomecânico

Para determinação das propriedades mecânicas dos úmeros, foram realizados ensaios de compressão axial, utilizando-se a Máquina Universal de Ensaios Mecânicos EMIC, modelo DL 10.000, com precisão de (0,018 + F/3700)KN, apurada dentro das especificações das normas ABTN, NBR6156 e NBR6674. A máquina, que opera em conjunto com computador sob o sistema operacional Windows^TM 2000, utiliza o programa Mtest versão 1.00 para aferição dos resultados. Doze horas antes do ensaio biomecânico, os úmeros direitos foram descongelados e mantidos em compressas embebidas em soro fisiológico 0,9%.

As extremidades distais dos úmeros foram fixadas verticalmente, em recipientes de plástico, com capacidade de 35 ml, contendo 25 ml de resina acrílica auto-polimerizante (Jet^®). Após 2 horas, as peças foram enviadas para os testes biomecânicos. O cutelo, cuja extremidade é côncava, foi posicionado axialmente ao úmero, ajustando-se, perfeitamente, à sua cabeça. (Figura 2) Para determinação da carga máxima suportada pelo corpo, o cutelo foi posto em movimento a uma velocidade de 30mm/min^7,8 O cálculo da carga máxima foi realizado automaticamente pelo programa. (Figura 3)

Estudo histomorfométrico

Os úmeros esquerdos, após descalcificação, desidratação, diafanização e inclusão em parafina, foram cortados transversalmente na área metafisária proximal (colo cirúrgico) e corados por Hematoxilina-Eosina (HE).⁹ As lâminas foram colocadas em microscópio (Laica^®) acoplado a monitor de vídeo com resolução de 1024x768 pixels, que enviava as imagens digitais a um computador. A área de osso trabecular (µm²) foi calculada utilizando-se a objetiva de 5X e o programa de análise de imagens Image Pro plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA), em dois campos padrões da região central do colo cirúrgico umeral, após delimitação manual do perímetro das trabéculas. (Figura 4) O cálculo da área total foi realizado automaticamente pelo programa.¹⁰

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada através de análise de variância (paramétrica ou não-paramétrica), no modelo inteiramente casualizado, complementada com os respectivos testes de comparações múltiplas, utilizando-se, para tanto, os programas SigmaStat^® versão 3.5 (Systat Software Inc., 2006) e Minitab^® versão 15 (Minitab Inc., 2007). A opção paramétrica acontecia quando a variável apresentava comportamento gaussiano (teste t de Student, teste ANOVA associado ao teste de comparações múltiplas de Holm-Sidak, e o teste de correlação de Pearson), caso contrário, indicava-se a opção não-paramétrica (teste U de Mann-Whitney e o teste de Kruskal-Wallis associado ao teste de comparações múltiplas de Dunn). Para todos os cálculos foram utilizados nível de significância de 5%.

RESULTADOS

Análise clínica

No geral, todos os grupos aumentaram a massa corpórea independente da substância administrada sem, contudo, diferença significante (p=0,05). (Figura 5) O aumento da massa corpórea foi significativamente maior nos animais ooforectomizados (p=0,005). (Figura 6)

Levando-se em consideração a substância administrada, verificou-se, dentro do grupo O, que o grupo que recebeu zoledronato (OAZ) aumentou mais a massa corpórea que o grupo que recebeu água destilada (OAD), não havendo, contudo, diferença estatística (p=0,47). (Figura 7) O mesmo se deu em relação ao grupo pseudo-cirurgia (P) (p=0,68). (Figura 8)

Análise biomecânica

Ao se comparar os quatro grupos, observou-se que aqueles que fizeram uso do zoledronato suportaram força de compressão estatisticamente maior que os que não o utilizaram (p=0,02). (Figura 9)

A média da carga máxima suportada do grupo OAD (133,9N ±14,2) foi estatisticamente menor que a do grupo OAZ (156,5N ±14,9) (p=0,005). (Figura 10) Quando se comparou a média da carga máxima nos grupos OAD (133,9 ±15,4) e PAD (149,7 ±10,3), verificou-se diferença significativa entre as mesmas (p=0,01) (Figura 11). Por outro lado, a média da carga máxima suportada pelo grupo OAZ (156,5 ±14,9) foi, estatisticamente, a mesma do grupo PAD (149,6 ±9,8) (p=0,25). (Figura 12)

Análise histomorfométrica

Ao se comparar os quatro grupos, verificou-se o aumento significativo da mediana da área óssea trabecular nos grupos que fizeram uso do zoledronato (p=0,001). (Figura 13)

Houve diferença significante ao se comparar a área trabecular média umeral dos grupos OAD (202448 µm² ±86247) e OAZ (334785,2 µm² ±111205) (p=0,01). (Figura 14) Ao se comparar as medianas dos grupos OAD (175978,5) e PAD (304468), verificou-se diferença significativa entre as mesmas (p=0,01) (Figura 15), paralelamente, verificou-se que o valor mediano da carga máxima suportada pelo grupo OAZ (290925) foi, estatisticamente, o mesmo do grupo PAD (304468) (p=0,71). (Figura 16)

Análise de regressão linear

O coeficiente de Pearson mostrou haver correlação positiva entre a área trabecular óssea e a carga máxima suportada pelo corpo de prova (p=0,04; r=0,95). (Figura 17)

DISCUSSÃO

A grande maioria das fraturas do úmero proximal ocorre em mulheres (3:1) após o climatério ou acima de 60 anos.¹¹ Estas correspondem ainda à quarta fratura mais freqüente na vigência de osteoporose, respondendo por 12% de todas as fraturas.^12,13 Segundo Maravic et al.¹⁴, na França, cada fratura de úmero, de origem osteoporótica, gera custos anuais individuais em torno de US$4.000.

O zoledronato, que age inibindo a ação osteoclástica e, conseqüentemente, diminuindo a reabsorção óssea,¹⁵ pode ser utilizado na profilaxia das fraturas causadas pela osteoporose.

Para a realização deste estudo, o rato foi escolhido por possuir características próximas às dos seres humanos, no que se refere aos sistemas músculo-esquelético e hormonal, além da facilidade de manuseio, disponibilidade em biotério e baixo custo.¹⁶

Em se tratando da massa corporal, os animais com privação de hormônio, ou seja, ooforectomizados (grupo O), apresentaram maior ganho de massa corporal que o grupo pseudo-cirurgia ("sham") (grupo P) (p=0,005). Achados semelhantes foram obtidos por diversos autores.^17,18 Após o climatério, em função da alteração não apenas da distribuição de tecido adiposo, causado pela deficiência de estrógenos, mas também pelo acúmulo periférico de gordura, ocorre alteração do perfil lipídico e aumento da massa corporal.¹⁹ Não verificamos, neste estudo, a influência do zoledronato no aumento da massa corporal dos animais. Conclui-se, portanto, que o aumento da massa corpórea foi causado pela retirada dos ovários (ooforectomia) e não pelas substâncias administradas.

Com relação à análise biomecânica, ao se comparar a carga máxima suportada pelos úmeros nos quatro grupos, observou-se que os grupos que fizeram uso do zoledronato apresentaram carga significativamente maior no momento de fratura, que os que não o utilizaram (p=0,02), mostrando que o zoledronato aumentou a resistência física do osso à fratura.^6,20 Tais resultados se repetiram durante a análise dos grupos OAD e OAZ (p=0,005). A ausência de diferença significante entre as cargas máximas dos grupos OAZ e PAD, reforça a tese de que o zoledronato agiu aumentando a resistência óssea à fratura, em nível superior ao do grupo não-castrado.

Histomorfometricamente, ao se comparar a área trabecular óssea nos quatro grupos, pôde-se observar que os grupos que fizeram uso do zoledronato apresentaram área óssea trabecular significativamente maior (p=0,001) que os que não o utilizaram. Analisando-se a área trabecular óssea dos grupos OAD e OAZ, verificou-se que a presença do zoledronato aumentou significativamente a área trabecular (p=0,01). Pathas et al.¹⁰ analisaram o efeito da ooforectomia na diáfise, metáfise e epífise óssea de ratas, observando a diminuição das trabéculas apenas na região metafisária. Concluíram que a ooforectomia exerce mudanças significativas no osso trabecular de ossos longos, principalmente nas extremidades e, em menor monta, na região média. O zoledronato, no presente estudo, proporcionou a manutenção das trabéculas ósseas na região umeral metafisária. Da mesma forma que no estudo biomecânico, o zoledronato manteve a área óssea trabecular no grupo castrado (OAZ) em nível estatisticamente igual ao do grupo não-castrado (PAD).

A análise de dispersão entre a área trabecular óssea e a carga máxima suportada pelo corpo, mostrou que estas são grandezas que se correlacionam positivamente, ou seja, a carga máxima suportada pelo úmero variou, proporcionalmente, à sua área trabecular. Portanto, a quantidade e a qualidade das trabéculas ósseas podem ser consideradas fatores preditivos para fraturas decorrentes da osteoporose.

CONCLUSÕES

O zoledronato não teve influência significativa na massa corpórea dos animais. A análise dos resultados mostrou que o zoledronato aumentou significativamente a resistência óssea do úmero proximal e a área trabecular óssea na região metafisária do úmero em ratas osteoporóticas. Outros estudos se fazem necessários para se evidenciar a eficácia do zoledronato em outras regiões umerais.

Trabalho recebido em 06/11/08 Aprovado em 26/04/09

Trabalho realizado no Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina de Botucatu. UNESP. Botucatu.SP

Todos os autores declaram não haver nenhum potencial conflito de interesses referente a este artigo.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Abr 2010
• Data do Fascículo
  2010

Histórico

• Recebido
  06 Nov 2008
• Aceito
  26 Abr 2009