O futuro da epidemiologia genética de características complexas

Future of genetic epidemiology in complex traits

ARTIGO ARTICLE Mary F. Feitosa¹
Henrique Krieger²

O futuro da epidemiologia genética de características complexas

Future of genetic epidemiology in complex traits

Abstract Genetic epidemiology has advanced from its early focus on rare mendelian diseases to the genetic dissection of complex traits. With the advent of the complete genome map of humans and other organisms, more than ever genetic epidemiology has an important role in ascertaining the relative importance of genetic and environment causative factors of complex traits. The main methodology strategies (familial resemblance, segregation analysis, association and linkage analysis and meta-analysis) in the study of complex traits are outlined and its advantages and shortcomings are discussed. The importance of sampling and the use of appropriate phenotypes and genetic markers are stressed and an example on the study of BMI (Body Mass Index), showing the role of a major genetic factor located at chromosome 7 illustrates some of the above strategies. It is suggested that in the future, although recognizing that multiplex families will still be the mainstay of linkage studies, new and efficient types of sampling (unrelated controls, for instance) utilizing pooled DNA samples will be universally employed. The recognition of genetic heterogeneity between studies and its interpretation will be one of the proeminent features in the forthcoming complex traits studies.

Key words Familial resemblance, Segregation analysis, Association and linkage analysis, Meta-analysis, Complex traits

Resumo A epidemiologia genética evoluiu de um enfoque em estudos sobre doenças mendelianas raras para a análise genética de características complexas. Com o advento de informações sobre a completa seqüência de genes ao longo do genoma humano e de outros organismos, o interesse da epidemiologia genética em desvendar a natureza dos fatores que influenciam essas características se tornou primordial. São apresentados os principais métodos empregados no estudo de doenças complexas bem como suas principais vantagens e desvantagens. Discute-se a importância na determinação da amostra e o uso de fenótipos e marcadores genéticos apropriados. Como exemplo das estratégias citadas tomamos o estudo de índice de massa corporal (BMI) para ilustrar um fator genético principal localizado no cromossomo 7. Em uma discussão sobre tendências no estudo de ligação, embora reconhecendo que famílias e genealogias continuarão sendo o foco principal das amostras, discute-se alguns novos e eficientes tipos de amostragem (como por exemplo, controles não-relacionados) em que amostras de conjunto de DNA serão universalmente empregadas. O reconhecimento da heterogeneidade genética entre estudos e sua interpretação será uma das mais importantes características no futuro das análises de características complexas.

Palavras-chave Agregação familial, Análise de segregação, Associação, Análise de ligação, Meta-análise, Características complexas

A epidemiologia genética progrediu de sua abordagem inicial em estudos sobre doenças mendelianas raras para a análise de características complexas, ou seja, aquelas que são influenciadas por um grande número de fatores, a maioria dos quais de difícil identificação. Doenças cardiovasculares, pressão arterial, doenças infecciosas e certas neoplasias são exemplos de características complexas. Com a aquisição de informações precisas sobre a seqüência de genes ao longo do genoma humano e de outros organismos, o interesse da epidemiologia genética em desvendar a natureza dos fatores que influenciam essas características se tornou primordial.

Entretanto, essas características têm-se mostrado muito mais desafiadoras e as esperanças de grandes avanços foram frustradas, principalmente devido ao pequeno efeito de cada uma de suas múltiplas causas e pelo fato de que os métodos planejados para detectar genes com efeitos significativos (genes principais) terem se mostrado insuficientes. Contudo, apesar de os efeitos individuais dos genes serem relativamente pequenos, as interações entre esses genes e outros genes e o meio ambiente podem contribuir significativamente para o desvendamento dessas características. As dificuldades existentes na detecção dessas interações geralmente redundam na impossibilidade de detectar genes desse tipo.

Para a detecção dos efeitos dos genes várias condições precisam ser satisfeitas. Em primeiro lugar, obviamente, é necessário o conhecimento adequado da natureza da característica e da sua biologia, história, distribuição etc. Também fundamentais para esse tipo de estudo são o planejamento do estudo apropriado, amostras robustas e o emprego de metodologia adequada.

Seria muito ambicioso pretender, nesse trabalho, fazer uma completa revisão sobre epidemiologia genética. O intuito do presente trabalho é o de dar uma visão geral da área no desvendamento de fatores atuantes em características complexas com ênfase na importância de um delineamento experimental apropriado, no emprego de metodologia correta e nas nuances de interpretação que essas análises podem propiciar. Algumas reflexões sobre a relevância de estudos genético-epidemiológicos em países em desenvolvimento, nesse começo de milênio, quando o grande enigma do mapeamento do genoma humano está concretizado, serão também apresentados.

Delineamento experimental

A excelência do delineamento do estudo é de vital importância para o mapeamento de genes associados a doenças complexas (Rao, 2001; Gu & Rao, 2001). Uma abordagem comum para ampliar o poder de um estudo é a utilização de grandes amostras. No entanto, planejamentos simplistas podem conduzir a coleta de amostras enormes que são extremamente difíceis de serem obtidas ou de custo elevadíssimo. Dessa forma, um delineamento criativo é necessário para detectar e ampliar um sinal fraco, porém real.

Estudos multiinstitucionais têm um papel importante na obtenção de grandes amostras coletadas de maneira uniforme pela utilização de protocolos amostrais únicos. Nesse sentido, alguns estudos multiinstitucionais têm proporcionado importantes contribuições científicas em diversas áreas da pesquisa biomédica. Exemplos desse tipo de delineamento são o National Heart, Lung, and Blood Institute Family Heart Study (NHLBI-FHS), estudo multiinstitucional que avalia os determinantes genéticos e não-genéticos que atuam em doenças cardiovasculares (Higgins et al., 1996) e o Heritage Family Study, projeto multiinstitucional planejado para estudar o papel de mecanismos genéticos existentes nos fatores de riscos para doenças cardiovasculares e diabetes (Bouchard et al., 1995), ambos nos EUA. Entre nós, um estudo exemplar, que utiliza desse tipo de abordagem, é o Estudo Colaborativo Latino Americano de Malformações Congênitas (ECLAMC) que é um programa clínico e epidemiológico do tipo caso-controle (Prado, 1992).

Os fatores que determinam o conteúdo informativo de um delineamento, que por sua vez regula o poder de decisão de um estudo, podem ser classificados em algumas categorias: 1) fatores associados à fenotipagem e genotipagem; 2) fatores associados à amostragem; 3) procedimentos analíticos; e 4) argumentos associados a custo-benefício.

Os fenótipos precisam ser claramente definidos. Para evitar que a detecção de um determinado fenótipo seja minimizada, isto é, que a freqüência do fenótipo não seja substancialmente subestimada, a característica em estudo deve ser altamente reproduzível. Medidas múltiplas e/ou o uso de informações suplementares (por exemplo, idade do aparecimento da característica, gravidade da doença, história familial etc.) podem contribuir para o refinamento do critério da escolha do fenótipo e podem ser decisivos na melhoria do poder analítico (Rice et al., 2001).

Apesar da constante melhoria tecnológica dos processos automáticos de genotipagem em grande escala, erros na genotipagem ainda existem. Esse fato, acompanhado de possíveis erros na identificação de indivíduos em uma família, pode produzir ruído suficiente para diminuir o poder analítico de um estudo. Portanto, alta qualidade da genotipagem e grande densidade de marcadores ao longo do genoma são fundamentais para o poder de resolução de um estudo. A escolha do tipo de amostragem (grandes genealogias, famílias nucleares, pares de irmãos, caso-controle, isolados populacionais, mistura de populações) e o tamanho da amostra devem ser cuidadosamente escolhidos a fim de conduzir a uma otimização do quociente sinal/ruído. As características complexas possuem provavelmente mecanismos genéticos distintos em populações diferentes (Krieger & Feitosa 1999) e a escolha da população "apropriada" pode potencializar a qualidade de um estudo (Gu & Rao, 2001).

Os procedimentos analíticos (segregação, ligação, associação, varredura genômica etc.) devem ser escolhidos por ocasião do planejamento da coleta de dados. Dessa forma, a metodologia torna-se parte do delineamento, possibilitando uma antecipação do poder do estudo. Contudo, se os dados já tiverem sido coletados, um esforço deve ser feito no sentido de escolher o método estatístico mais poderoso visando à otimização dos resultados.

Problemas de custo-benefício devem ser enfrentados no sentido de estabelecer um equilíbrio entre poder e sensibilidade (Gu & Rao, 2001). Um orçamento fixo e limitações práticas irão provavelmente determinar o tipo de estudo, independentemente das ambições dos pesquisadores. O balanço entre custo e eficiência deve ser muito bem estudado antes de se começar um projeto, principalmente em países em desenvolvimento, onde as fontes de financiamento são limitadas e, em geral, parcas.

Procedimentos analíticos

Os métodos analíticos vêm recebendo contínua atenção no estudo de características complexas e sua importância para esse tipo de estudo é medida pela inovação metodológica observada nos últimos anos. Aceita-se como fato inquestionável a interdependência absoluta entre técnicas moleculares e métodos estatístico-epidemiológicos, na solução de problemas biológicos relacionados a fenótipos mais ou menos distantes de uma correlação absoluta com um determinado genótipo. Aqui, procuraremos dar uma visão simplificada de alguns métodos da epidemiologia genética empregados na atualidade.

Agregação familial

A detecção e a avaliação da extensão da agregação familial são os primeiros passos na análise genética de qualquer característica. É sabido que esta agregação significa o compartilhamento, entre indivíduos da mesma família, de genes e de fatores do ambiente. A existência dessa agregação é evidenciada pela maior semelhança fenotípica entre pares de parentes do que entre dois indivíduos não-aparentados (Elston, 2000, Rice & Borecki, 2001). A magnitude da agregação familial pode ser medida pela correlação fenotípica entre pares de indivíduos (ex.: pares de irmãos, pai-filho, cônjuges etc.). Os diversos modelos genético-epidemiológicos utilizam essas diversas correlações e a interpretação biológica depende da magnitude e significância dessas correlações.

Vários programas aplicativos encontram-se à disposição do pesquisador para o estudo da agregação familial. Esses programas baseiam-se fundamentalmente na aderência de modelos a um conjunto de correlações obtido diretamente dos dados, admitindo-se normalidade (no sentido estatístico) multivariada (Hopper & Mattews, 1982). A estimação dos parâmetros do modelo é feita por verossimilhança máxima. Em geral, uma determinada característica é analisada individualmente (análise univariada). Entretanto, alguns estudos podem ser feitos utilizando-se mais de uma característica fenotípica (Coletto et al., 1981). Existem programas altamente eficientes e práticos para trabalhar essas correlações (ex. SEGPATH; Province & Rao, 1995). Em famílias nucleares, o modelo mais simples reconhece a existência de quatro tipos de indivíduos (pais, mães, filhos e filhas), conduzindo a oito tipos de correlações fenotípicas entre indivíduos (pai-mãe, pai-filho, mãe-filho, pai-filho, mãe-filho, filho-filho, filho-filha e filha-filha). No caso de simplificar o modelo, admitindo a inexistência de diferenças sexuais ou etárias, esse se reduz a três correlações (cônjuges, progenitores-descendentes, irmãos). O modelo bivariado completo, que contempla duas características em cada um dos componentes da família nuclear, trabalha com 34 correlações enquanto que o modelo simplificado, sem diferenças sexuais ou etária, reduz-se a dez correlações diferentes. A validade dessas e outras simplificações ou a existência de determinados fatores causais podem ser checadas pelo teste da razão de verossimilhança máxima (RVM) entre o modelo reduzido e um modelo mais geral. As RVM são, assintoticamente, distribuídas como um c² com um número de graus de liberdade igual a diferença do número de parâmetros estudados nos dois modelos.

Convém salientar que os estudos de agregação familial vêm de longa data, sendo pioneiros os estudos de S. Wright e R. A. Fisher na primeira metade do século passado, em conjunto com numerosas contribuições dos melhoristas, que atestaram pelo caráter clássico desse tipo de estudo e não como sendo devido a modismos tecnológicos.

A correta avaliação da magnitude da contribuição genética à característica fenotípica estudada é fundamental para um delineamento apropriado de estudos que dependem de grandes amostras e técnicas caras de genotipagem.

Análise de segregação

A análise de segregação é, teoricamente, um método para estudar dados familiares com a finalidade de estabelecer o modo de herança de uma determinada característica, quando o efeito de um gene não pode ser medido diretamente. Mendel, no século XIX, foi o pioneiro nesse tipo de análise, que o conduziu à descoberta das leis básicas da hereditariedade. A história da análise de segregação pode, para fins de um melhor entendimento, ser dividida em duas fases: a clássica e a complexa (Morton et al., 1983). Os métodos clássicos de análise de segregação de fenótipos mendelianos estão fundamentados na estimação e teste de razões de segregação (Rao et al., 1974) que são determinados, em grande parte, pelos efeitos de um único gene.

Modelos mais abrangentes de análise de segregação foram desenvolvidos para abordar os problemas gerados por fenótipos complexos (Elston & Steward, 1971; Morton & MacClean, 1974; Lalouel et al., 1983; Bonney, 1984; Hasstedt, 1982; Blangero & Konigsberg, 1991). Todos esses diferentes tratamentos metodológicos, apesar de diferirem em alguns pormenores, possuem características comuns que podem ser assim resumidas.

Admite-se que o fenótipo seja influenciado pela contribuição independente e aditiva de um gene principal, um componente poligênico/multifatorial e um resíduo ambiental não-transmissível. O efeito do gene principal resulta da segregação, em um único locus gênico, de dois alelos (A e a) e os genótipos são distribuídos nas proporções esperadas pelo princípio de Hardy-Weinberg. Os parâmetros desses modelos são a média (µ), a variância (s), a freqüência genética (q), o grau de dominância do gene (d), a herdabilidade (H) e as taxas de transmissão entre duas gerações (t).

A análise da segregação tem-se mostrado de grande interesse no estudo de várias características influenciadas por um gene principal ou por um pequeno número de genes (oligogenes) (ex. Blangero et al., 1996; Borecki et al., 1998a; Feitosa et al., 1995, 1996, 1999, 2000a, b, 2002, Olson et al., 2001).

Com as informações de mapas genéticos, modelos de análise de segregação mais reais que incorporem os efeitos de marcadores alojados ou associados (chamados de modelos combinados) serão mais e mais necessários. Certamente, a análise da segregação no futuro próximo utilizará dados sobre marcadores genéticos.

Alguns programas de análise se segregação podem ser obtidos pela internet: POINTER/ COMDS:www.hgmp.mrc.ac.uk/registered/help/comds; PAP (Pedigree Analysis Package):www.well.ox.ac.uk/docs/indez.html.solar; SOLAR (Sequential Oligogenic Linkage Analysis Routines):http://canag.cit.mih.gov/lserver/solar.htm, e SAGE (Statistical Analysis for Genetic Epidemiology):http://darwin.cwru.edu/pub/sage.html

Análise de ligação

Diz-se que há ligação, quando existe uma proximidade mensurável entre genes ao longo do cromossomo. A análise de ligação, em termos de epidemiologia genética, verifica a co-segregação, dentro de uma família, de um gene marcador e um fenótipo para estabelecer se o marcador e a característica estão fisicamente ligados. A análise da ligação tem sido o método principal para mapear doenças mendelianas e também tem exercido um papel importante nas tentativas de mapear aquelas doenças complexas, que supostamente possuem um mecanismo mendeliano, com efeito, significativo sobre a característica.

Independentemente do tipo de dados à disposição do pesquisador (desde pares de irmãos até extensas genealogias), a análise de ligação pode ser realizada por intermédio de técnicas baseadas em modelo (model-based) ou independentes de modelos (model-free). Deve-se frisar que todas as análises estatísticas admitem um modelo probabilístico, no qual parâmetros são estimados e hipóteses sobre parâmetros podem ser testadas.

Nas análises baseadas em modelo (ABM), também chamadas de lod-score ou análise paramétrica, admite-se que todos os aspectos do modelo estatístico, exceto a taxa de recombinação (q), são conhecidos. Morton (1955) fez uma contribuição fundamental para a genética humana, ao trabalhar o conceito de lod-score (lod), ou seja, o logaritmo na base 10 de uma razão de verossimilhança (RV). A RV é a probabilidade de se observar um quadro da distribuição de genótipos em uma família, dada a existência da ligação com um valor q da recombinação versus a mesma probabilidade estimada para segregação independente (q = 0,5).

Dessa forma, o quociente da verossimilhança ao valor alternativo (0 £ q < 0,5) pelo da mesma ao valor q = 0,5 possui poder de decisão. Um valor maior que três indica que a hipótese alternativa tem uma verossimilhança mil vezes maior que a hipótese nula com q = 0,5, e é indicativo da existência da ligação entre o marcador e o fenótipo estudado. Valores de lod-scores maiores que 1,5 e menores que três sugerem a existência de ligação, enquanto valores iguais ou menores que -2 indicam a inexistência de ligação. Elston & Stewart (1971) produziram um algoritmo para o cálculo de verossimilhança em genealogias complicadas, enquanto Ott (1974) desenvolveu um programa de computador voltado ao usuário para estimar lod-scores nas mais variadas genealogias. Os lod-scores têm também sido usados com bastante sucesso, no mapeamento de doenças mendelianas em que são consideradas situações complicadas (penetrância incompleta, dominância, fenocópias, aparecimento tardio, entre outras).

Tendo em vista que a inexistência de um modelo simples de herança para características complexas e, sobretudo, que a mesma pode depender de co-variáveis (idade de aparecimento, sexo etc.), é muito difícil ou até mesmo impossível obter genealogias multigeracionais informativas sem uma avaliação inicial que possibilite simplificar a análise dessas genealogias. Dessa forma, o método de pares de irmãos (Penrose, 1935) foi revivido para utilizar os padrões de compartilhamento de alelos no estudo de ligação. A atualização tecnológica do método de pares de irmãos foi ampliada, o que permitiu também a utilização de pares de parentes mais afastados, bem como a análise de determinadas genealogias (Weeks & Lange, 1988; Curtis & Sham, 1994; Kruglyak et al., 1996; Almasy & Blangero, 1998).

O conceito de identidade por ascendência (IBD, Identity by descent) é de vital importância nos estudos de ligação, pois quantifica a semelhança genética entre pares de indivíduos. Um par de indivíduos aparentados possui um alelo IBD se esse alelo tem origem comum em um ancestral. Dessa forma, um par de irmãos pode possuir zero, um ou dois alelos IBD com as respectivas probabilidades de 1/4, 1/2 e 1/4. Algoritmos para estimar as probabilidades de IBD múltiplos marcadores genéticos constituíram um importante avanço nas pesquisas sobre etiologias complexas (Lander & Green, 1987; Sobel & Lange, 1996; Kruglyak & Lander, 1998).

Ao contrário do método dependente do modelo, os métodos independentes de modelo não dependem de uma especificação a priori do tipo de herança da característica. Nesses modelos, não é necessário estabelecer-se, a priori, freqüências gênicas e penetrâncias, tendo em vista que funções dessas variáveis e a taxa de recombinação (q) podem ser estimadas simultaneamente.

Para características descontínuas, os métodos independentes do modelo contemplam pares de irmãos afetados ou irmandades com pelo menos dois irmãos afetados. Nos estudos com grupos de dois irmãos afetados, o problema de penetrância incompleta é evitado, uma vez que não entram na amostra tanto os indivíduos não-portadores do mecanismo genético como aqueles que possuem a predisposição genética, porém não tendo manifestado a característica.

Se um determinado marcador e uma característica estiveram ligados geneticamente, as proporções de alelos IBD compartilhado (p) excedem o valor esperado. Muitas análises estatísticas foram desenvolvidas para testar essa hipótese (Blackwelder & Elston, 1985; Risch, 1990; Kruglyak et al., 1996). Para características contínuas, a semelhança fenotípica pode ser observada diretamente sem a necessidade de escolher irmandades. Sob a hipótese de ligação, irmãos que compartilham uma proporção maior de alelos IBD terão fenótipos mais parecidos, enquanto que sob a hipótese nula (sem ligação) os fenótipos dos pares serão independentes do compartilhamento de alelos, no gene marcador. Várias propostas diferentes foram feitas para estudar esses pares de irmãos e verificar a existência de genes principais influenciando características quantitativas (QTL, Quantitative Trait Locus) e o valor de p pode ser estimado através de várias técnicas (Hasemam & Elston, 1972; Amos, 1994; Almasy & Blangero, 1998; Province et al., 2001). Excelentes revisões recentes sobre ligação e características complexas podem ser encontradas em Olson et al. (1999), Elston (2000), e Borecki & Suarez (2001).

Análise de associação

A análise de ligação pode ser usada em uma ampla procura por todo o genoma pela existência do locus responsável pela característica, por intermédio de sua localização cromossômica, enquanto que a análise de associação é mais útil para a confirmação de suspeita da participação de um determinado alelo na manifestação de uma certa característica ou de um alelo existente em um locus próximo ao locus responsável pela característica. Em outras palavras, a associação pode existir por duas razões: a) por causa do efeito direto do gene em uma característica em estudo ou, b) quando o marcador estiver em desequilíbrio de ligação com o gene principal responsável pela característica estudada. No primeiro caso, o genótipo pode ser determinado imunologicamente, por métodos eletroforéticos ou diretamente no DNA, sendo que seu efeito pode ser medido na característica estudada. Esse tipo foi chamado por Boerwinkle et al. (1986) de "genótipo medido". No segundo caso, genes anônimos ao invés de marcadores funcionais estão presentes, e dessa forma o teste de associação requer a existência de desequilíbrio de ligação entre a característica e o marcador. Quando ocorre uma mutação causadora de uma doença, a mesma tem lugar em um determinado cromossomo e forma um conjunto haplotípico com os loci adjacentes nesse cromossomo. Na geração seguinte, a tendência é que esse alelo mutante ocorra no mesmo haplótipo original, excetuando-se os casos de recombinação. Chama-se desequilíbrio de ligação, a ocorrência, na população, de uma freqüência maior de uma determinada combinação entre dois genes, do que a esperada pelo produto de suas freqüências individuais. Como visto no exemplo acima, o desequilíbrio da ligação é dependente da taxa de recombinação (q) e quanto maior a taxa de recombinação, mais rápida será a aproximação do equilíbrio entre os dois loci.

Apesar de forças evolutivas outras que a mutação (e. g. deriva genética e fluxo gênico) atuarem para alterar o equilíbrio entre loci, é interessante notar que quanto mais antigo for o aparecimento da mutação, mais próxima a população vai estar no equilíbrio.

Existem várias maneiras de testar a existência de associação entre um gene marcador e uma determinada característica. O clássico caso-controle, na sua forma mais simples, é uma tabela de contingência 2 x 2. A hipótese nula a ser testada é o risco de um indivíduo apresentar a característica independente do marcador. Alguns fatores podem simular uma associação intrínseca e, na verdade, ela ser devida a fatores alheios à associação propriamente dita. Isso pode acontecer, por exemplo, no estudo de uma população estratificada e equivocadamente olhamos a mesma como sendo uniforme. Nesse caso a associação pode resultar da estratificação e não da biologia do processo. Dessa forma, se pudermos separar os diversos segmentos (estratos) da população e a associação for espúria, verificaremos que não existirá associação dentro de cada segmento, apenas no total da população. Uma das formas de se evitar uma associação devida à heterogeneidade da população é a utilização de tipos de controles familiais. Falk & Rubinstein (1987) propuseram um método para avaliar riscos relativos em estudos que usam controles familiais, embora uma década antes, Krieger & Barbosa (1979) tenham estudado os riscos relativos e as propriedades dependentes das freqüências do marcador em pares de irmãos.

Vários testes estatísticos têm sido sugeridos para esse tipo de estudo, como o risco relativo haplotípico (Falk & Rubinstein, 1987; Terwilliger & Ott 1992), controles familiais afetados (Schaid & Summer, 1994) e o Teste de Desequilíbrio de Transmissão – TDT (Spielman et al., 1993).

O TDT tem recebido atenção particular, pois se baseia tanto em informação de ligação como no desequilíbrio, que são subjacentes à associação. A análise molecular do marcador é importante para esse método, uma vez que visa a uma análise de alta sensibilidade de marcador. Tomam-se amostras de pessoas com uma determinada característica (casos) e estuda-se o marcador neles e em seus progenitores. Para o teste ser informativo, pelo menos um dos progenitores tem que ser heterozigoto para o locus marcador. O TDT usa um teste c² de Mc Nermar (1947) para verificar a hipótese nula em que o alelo tido como associado à característica é transmitido em 50% das vezes pelo progenitor heterozigoto.

O método TDT foi modificado para lidar com situações mais complicadas, como marcadores multialélicos (Sham & Curtis, 1995; Bickeboller & Clérget-Darpoux, 1995; Rice et al., 1995), quando apenas um progenitor é testado (Sun et al., 1999) ou quando ambos os progenitores não podem ser testados, como por exemplo, características de aparecimento tardio (Spielman & Ewens, 1998; Hovarth & Laird, 1998; Boehnke & Langefeld, 1998). Nesse caso, a utilização de irmãos não-afetados fornece informação a respeito dos alelos que não é passada aos irmãos afetados.

Recentemente, foram também desenvolvidos métodos que abordam o problema de características quantitativas, utilizando modelos de componentes de variância por intermédio da similaridade familial residual (Boerwinkle et al., 1987; Almasy & Blangero, 1998; Province et al., 2001). O método TDT original foi também ampliado para ser utilizado em características contínuas (Allison, 1997), em situações mais complexas como irmandades com mais de dois indivíduos, alelos múltiplos e em casos que não se referem a hipóteses paramétricas sobre a distribuição da característica (Rabinowitz, 1997). Alternativas que permitem uma abordagem através de regressão em dados genealógicos (George et al., 1999) e vários graus de desequilíbrio de ligação entre o marcador e o locus responsável pela característica (Xiong, 1998) também foram propostas.

Em resumo, como o desequilíbrio de ligação deve persistir na maioria das populações humanas para genes ligados com uma taxa de recombinação menor que 1%, só em situações peculiares é que se tem a sorte de escolher um marcador que preencha esse requisito. Por outro lado, estudos de associação ainda que sabidamente com excesso de resultados falsos positivos, podem fornecer informações importantes, uma vez que a "história" de recombinação é, de certa forma, utilizada nas análises, tendo em vista que o TDT resolve de maneira satisfatória os problemas causados por falsos positivos devido ao fluxo gênico.

Considerando o acima exposto, sugerimos que a procura de genes responsáveis por características complexas seja feita em primeiro plano com um estudo de ligação, com varredura genômica não muito sensível com a finalidade de se identificar as regiões cromossômicas potencialmente candidatas para alojar o gene condicionador das características. Após essa identificação deve se utilizar uma análise mais fina nas regiões promissoras usando densos mapas de polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP).

Com essa abordagem, a utilização da informação sobre desequilíbrio de ligação na presença de uma associação positiva pode ser considerada um instrumento para mapeamento fino (Olson et al., 1999, Borecki & Suarez, 2001 e Baron, 2001).

Meta-análise

Meta-análise pode ser entendida como sendo a utilização de toda a informação existente sobre a possível identificação de um gene principal oriundo de vários estudos. Sabidamente, características complexas são identificadas pela existência de interações entre genes e ambiente, portanto o efeito de um gene em particular deve ser relativamente pequeno. Assim, a meta-análise se propõe a juntar sinais relativamente fracos de estudos particulares, em um conjunto mais robusto de evidências sobre efeitos genéticos, bem como permitindo um arcabouço quantitativo para modelar a variabilidade entre estudos. A aplicação desse tipo de análise, utilizando várias abordagens estatísticas (Olkin, 1995), tem sido relativamente freqüente nos últimos anos (Li & Rao, 1996, Rice, 1998).

Diferentes estudos de características complexas variam entre si por numerosas razões: definições fenotípicas diferentes; averiguação e escolha tanto dos marcadores genéticos como da metodologia estatística. Dessa forma, diferentes conclusões a respeito de ligação podem ser devidas tanto ao delineamento do estudo, como pela presença de diferentes fatores genéticos.

Contudo, se um esforço for despendido em rever todos os estudos e os artefatos forem cautelosamente identificados, a meta-análise dos estudos disponíveis pode resultar em um conjunto poderoso para a detecção de genes com pequenos efeitos individuais.

É de especial interesse o estudo de meta-análise de resultado de ligação levada adiante por Gu et al. (1998), apresentando métodos para agregar resultados em uma análise de dados de pares de irmãos, usando a proporção de alelos que compartilham IBD no locus marcador e do efeito comum do possível locus. Efeitos aleatórios foram incluídos no modelo para caracterizar a variabilidade entre amostras, enquanto que outras estimativas (por quadrados mínimos, no caso) foram usadas para avaliar os prováveis efeitos do gene principal. Vários resultados suplementares puderam ser obtidos incorporando variáveis específicas em análises com co-variáveis que pudessem explicar a variabilidade entre estudos (Gu et al., 1999, 2001).

Uma indicação de importância desse tipo de abordagem pode ser avaliada pelo interesse de firmas independentes em se associar a esse esforço. Existe uma firma dedicada à varredura genômica (Genoma Search Meta-Analysis/ GSMA) que permite a agregação de novos dados a estruturas já existentes para integrar os novos dados a bancos de dados já atuantes (Wise et al., 1999). Pormenores sobre meta-análise podem ser vistos em um recente trabalho de Gu et al., (2001).

Exemplos à guisa de ilustração

Alguns estudos evidenciaram a existência de um possível locus influenciando diversos fenótipos complexos (Comuzzie et al., 2001; Baron, 2001) e nessa revisão, tomamos como exemplo o fenótipo Índice de Massa Corporal (BMI – Body Mass Index, que é o clássico índice gerado pelo quociente do peso corporal pelo quadrado da altura). O BMI é a influência de vários fatores causais, uma vez que representa a quantidade de massa corporal, a composição corporal e proporções, sendo certamente efeito de vários processos metabólicos, de efeitos hormonais, de comportamento e de interações entre esses fatores etiológicos de amplo espectro.

A maioria dos estudos estimou a herdabilidade do BMI como estando entre 40-55% (Bouchard et al., 1998, Borecki et al., 1998b e Rice et al., 1999). Contudo, convém salientar que herdabilidades acima de 80% foram descritas em estudos de gêmeos. Apesar do BMI ser uma característica complexa, os estudos de segregação têm sugerido evidência de um ou dois genes controlando a sua variabilidade em diferentes populações/amostras (Province et al., 1990; Hasstedt et al., 1997, Borecki et al., 1998b).

Uma varredura genômica usando componentes de variância baseados em uma análise de ligação multilócica para BMI indicou fortemente a existência de ligação no cromossomo 7q32.3 (lod = 4,9, p < 10 ^-5) no estudo familial NHLBI – Family Heart Study (Feitosa et al., 2002b). Prévios estudos já haviam sugerido evidência de ligação na região cromossômica do locus LEP com algumas características de medidas de obesidade (Duggirala et al., 1996; Clément et al., 1996; Roth et al., 1997; Lapsys et al., 1997; bray et al., 1999). Deve-se também salientar que uma meta-análise baseada em cinco estudos levada a cabo por Allison e Heo (1998) demonstrou forte evidência de ligação e associação do BMI à região LEP (p=1.5 x 10 ^-5). Não se deve perder de vista, porém, que alguns estudos indicaram associações do BMI com loci pertencentes a outros cromossomos (Pérusse et al., 2001).

O futuro da epidemiologia genética

É claro que o delineamento de estudos ainda será o fator primordial dos estudos futuros e, é claro, também que dados familiais continuarão sendo o melhor arsenal para estudos nessa área.

Contudo, alguma substituição de amostras com controles familiais poderá ser necessária para cobrir lacunas na literatura. Estudos de caso-controle de indivíduos não-relacionados, especialmente para análises de dados com marcadores de DNA, poderão fornecer robustas evidências para estudos de ligação.

A heterogeneidade genética pode ser uma das facetas proeminentes dos estudos sobre características complexas. A amostragem de famílias de procedências étnicas diferentes serão de grande importância para desvendar mecanismos causais e também na identificação de fatores modificadores tanto genéticos como do ambiente. Neste particular, estudos em populações tri-híbridas brasileiras poderão desempenhar papel importante na elucidação de muitos problemas persistentes em várias características complexas.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Jul 2007
• Data do Fascículo
  2002