Avaliação das condições de maturação oocitária e do efeito do reprodutor na produção in vitro de embriões bovinos

Evaluation of oocyte maturation conditions and bull effect on the in vitro bovine embryo production

Avaliação das condições de maturação oocitária e do efeito do reprodutor na produção in vitro de embriões bovinos^*

Evaluation of oocyte maturation conditions and bull effect on the in vitro bovine embryo production

Lia de Alencar COELHO¹; Cesar Roberto ESPER²; Joaquim Mansano GARCIA²; Roberta VANTINI²; Izaltino Rocha SILVA FILHO²; Ivo Luis ALMEIDA Jr.²

Correspondência para:

Lia de Alencar Coelho

Departamento de Zootecnia

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da USP

Rua Duque de Caxias Norte, 225 – Caixa Postal 23

13630-970 – Pirassununga – SP

e-mail: [e-mail]

RESUMO

Avaliaram-se as condições de cultura para maturação dos oócitos (Exp. I) e o efeito do reprodutor (Exp. II) sobre as taxas de clivagem (TC) e de mórulas e blastocistos (MO/BL) produzidos in vitro. Oócitos imaturos foram submetidos a maturação in vitro sob diferentes condições: meio B-199, acrescido de 5% de soro de vaca em estro (SVE), 5% de soro fetal bovino (SFB) e células da granulosa (T₁/Exp. I) ou meio B-199, acrescido de 10% de SFB, 14 UI/ml de PMSG e 7 UI/ml de hCG (T₂/Exp I). Após 24 h de cultura, os oócitos maturos foram inseminados com sêmen descongelado de dois reprodutores (R₁ e R₂ /Exp. II) e, após 48 h de incubação, os embriões de 2 e 4 células foram transferidos para placas de cultivo in vitro, onde permaneceram em cultura por mais 9 dias. No Exp. I, os oócitos de T₁ e T₂ foram inseminados com sêmen do R₁/Exp. II. No Exp. II, os oócitos do T₁/Exp. I foram inseminados com sêmen de R₁ e R₂/Exp. II. No Exp. I, a TC foi superior (p<0,01) para T₂, quando comparado com T₁. A produção de MO/BL não foi diferente (p>0,05) entre tratamentos. No Exp. II, a TC e a taxa de MO/BL diferiram (p<0,05) para cada reprodutor. A adição de hormônios no meio de maturação, embora não tenha interferido na produção de embriões, parece ser um procedimento mais prático que o uso de células da granulosa. A utilização de sêmen de diferentes reprodutores afetou o subseqüente desenvolvimento embrionário in vitro.

UNITERMOS: Maturação; Fertilização; In vitro; Oócitos; Bovinos.

INTRODUÇÃO

A produção de embriões in vitro (PIV) é uma técnica que vem se estabelecendo, sendo largamente utilizada para estudos da fisiologia da maturação e fecundação dos oócitos, capacitação espermática, cultivo de embriões, clonagem, transferência de genes, microinjeção, sexagem, congelação/descongelação de oócitos e embriões. O aprimoramento das técnicas de maturação in vitro, desenvolvimento embrionário em sistemas de co-cultura^7,14 e a aspiração de oócitos de vacas por via transvaginal com auxílio do ultra-som¹¹ vislumbram a aplicação comercial dessa técnica em programas de transferência de embriões na espécie bovina. Entretanto, existe uma grande variação com relação à taxa de clivagem e produção de mórulas e blastocistos oriundos do sistema PIV^3,9. Essas diferenças são determinadas por vários fatores decorrentes das etapas que constituem esse sistema, entre eles as condições de cultura para maturação dos oócitos e a variação individual entre reprodutores.

Apesar do estabelecimento de gestações¹³, e obtenção de bezerros¹², a partir do sistema PIV, as taxas de clivagem e de mórulas e blastocistos ainda são baixas, havendo necessidade de maximização da quantidade e da qualidade dos embriões produzidos por esse sistema.

O presente trabalho teve como objetivo avaliar algumas variáveis que interferem no sistema PIV, como as condições de cultura para maturação dos oócitos (Experimento I) e o efeito do reprodutor (Experimento II) sobre a taxa de clivagem (TC) e a produção de mórulas e blastocistos (MO/BL).

MATERIAL E MÉTODO

Os ovários de vacas provenientes de abatedouro foram transportados para o laboratório à temperatura ambiente e dentro de frascos contendo solução tampão-salina-fosfato (PBS), acrescida de sulfato de gentamicina (50µg/ml). No laboratório, os ovários foram lavados (2X) com solução PBS e mantidos em banho-maria, a 34-35ºC. Os oócitos imaturos, aspirados de folículos de 3-8 mm, foram colocados em placas de Petri (100 mm), contendo meio TCM 199, suplementado com Hepes (25 mM), sulfato de kanamicina (75µg/ml) e 10% de soro fetal bovino (SFB) (meio H-199). Sob estéreo microscópio (aumento de 10 a 60X), complexos cumulus-oócitos (COCs) foram visualizados, lavados duas vezes em meio H-199 e colocados em cultura por 24 h, a 38,5ºC em atmosfera com 5% de CO₂, em meio de maturação.

O meio básico de maturação foi constituído de meio TCM 199, suplementado com aditivos (1 µg/ml de vitamina B₁₂, 10 µg/ml de insulina, 500 µg/ml de álcool polivinil, 75 µg/ml de ácido ascórbico, 5 µg/ml de inositol, 100 µg/ml de acetato de sódio e glicosamina), Hepes (16,79 mM), bicarbonato de sódio (28,57 mM), piruvato de sódio (2,73 mM) e sulfato de kanamicina (75 µg/ml) (meio B-199).

Para obtenção das células da granulosa, um folículo grande (8 - 10 mm) foi dissecado, perfurado, invertido e, após sucessivas lavagens em meio H-199, procedia-se à raspagem das células em 3 ml de meio B-199. A placa de maturação continha 1 ml de suspensão de células da granulosa e 2 ml de meio B-199.

A fração móvel do sêmen descongelado foi separada por gradiente descontínuo de Percoll. O gradiente foi constituído por soluções a 55% e a 90% de Percoll a 100%. Para formar o gradiente, no fundo de um tubo de centrífuga contendo previamente a solução de Percoll a 55%, adicionou-se a solução de Percoll a 90% e, sobre as duas soluções, a amostra do sêmen (1 palheta de 0,50 ml) foi depositada delicadamente. Todo o conjunto foi centrifugado a 200 g durante 25 minutos. Após duplas lavagens meio TALP sem cálcio e glicose, suplementado com cafeína e adicionado de sulfato de gentamicina (TALP-SPERM)¹, para retirada do Percoll (130 g/10 minutos), o sedimento foi ressuspenso em meio TALP-SPERM contendo heparina a 100 µg/ml e incubado a 38,5ºC em atmosfera com 5% de CO₂. Após 15 minutos, a suspensão de sêmen foi diluída em meio TALP contendo cálcio, glicose, hipotaurina e epinefrina (TALP-FIV)¹, de modo que a concentração espermática fosse ajustada para 10 x 10⁶ espermatozóides/ml e a concentração de heparina para 10 µg/ml. A inseminação foi realizada em placas com microgotas de 100 m l de suspensão de sêmen, contendo aproximadamente 25 oócitos por gota, e cobertas com óleo de silicone. Após 48 h de incubação a 38,5°C em atmosfera com 5% de CO₂, os embriões de 2 e 4 células foram lavados e transferidos para placas, contendo microgotas compostas por 90 µl de meio B-199 e 2 µl de suspensão de células epiteliais do oviduto bovino (BOEC), as quais permaneceram em cultura por 9 dias.

No experimento I, avaliou-se o efeito das condições de maturação sobre a taxa de clivagem (TC) e a produção de mórulas e blastocistos (MO/BL). O meio de maturação (B-199) foi acrescido de 5% de soro de vaca em estro (SVE), 5% de soro fetal bovino (SFB) e células da granulosa (T₁) ou acrescido de 10% de SFB, 14 UI/ml de PMSG e 7 UI/ml de hCG (T₂). Para inseminação dos oócitos, foi utilizado sêmen do Reprodutor 1 (R₁) do Experimento II.

No Experimento II, avaliou-se o efeito do reprodutor sobre a TC e a produção de MO/BL a partir de oócitos maturados de acordo com o T₁ do Experimento I. Para este experimento, foram utilizados dois reprodutores (R₁ e R₂).

A taxa de clivagem (TC) e a produção de MO/BL, para ambos os experimentos, foram avaliadas pelo teste do Qui-quadrado (c ²).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

No experimento I, a TC foi significativamente superior (p<0,01) para T₂ (hormônios), quando comparado com o T₁ (células da granulosa). Com relação à produção de MO/BL, não houve diferença entre os tratamentos (Tab. 1). Esses resultados não estão de acordo com os obtidos por Fukui; Ono⁵, que encontraram efeito significativo da adição de células da granulosa ao meio de maturação sobre a produção de blastocistos. Esses autores utilizaram altas concentrações de células da granulosa (5 x 10⁶/ml), enquanto neste experimento essa concentração não foi determinada. Isso provavelmente pode ter sido uma das razões pela qual esse tratamento não melhorou a taxa de clivagem. A adição de células da granulosa parece favorecer a aquisição de competência de desenvolvimento embrionário; entretanto, a concentração de células não deve ser inferior a 1 x 10⁶/ml². De acordo com Ireland; Roche⁸, folículos saudáveis e ativos (com secreção de estrógenos) apresentaram grande quantidade de células da granulosa (8,5-8,6 x 10⁶/ml) em relação a folículos inativos (sem secreção de estrógenos) (3 x 10⁶/ml). Isso ressalta a importância de selecionar folículos ativos para a retirada de células da granulosa. Como a competência de desenvolvimento embrionário é traduzida pela habilidade do oócito maturado e fecundado in vitro se desenvolver até os estádios de mórula ou blastocisto, e não somente pela taxa de clivagem, a utilização de qualquer um dos tratamentos pode ser recomendada, porém a adição de hormônios apresenta vantagens. Além de ser uma técnica simples e prática, não apresenta o inconveniente da adição de células da granulosa, cujo procedimento é trabalhoso e propenso a contaminação bacteriana e/ou fúngica, fato indesejável no sistema PIV. Provavelmente o tratamento hormonal tenha influenciado a capacidade fecundante dos oócitos, não tendo sido, entretanto, capaz de melhorar a competência de desenvolvimento embrionário.

Tabela 1

Taxas de clivagem e de mórulas/blastocistos (MO/BL), a partir da fecundação de oócitos bovinos in vitro, submetidos a diferentes condições de maturação in vitro1. UNESP, Jaboticabal-1996.

** (p<0,01) = diferiram significativamente ao nível de 1%; NS (p>0,05) = não diferiram significativamente; T1 = meio B-199 + 5% de soro de vaca em estro (SVE) + 5% de soro fetal bovino (SFB) + células da granulosa; T2 = meio B-199 + 10% de + SFB + 14 UI/ml de PMSG + 7 UI/ml de hCG; 1 Experimento realizado no DRA da FCAVJ-UNESP - Jaboticabal-SP durante o período de outubro de 1995 a março de 1996.

A utilização de hormônios para maturação de oócitos in vitro tem provocado alguns resultados contraditórios. Enquanto alguns trabalhos têm demonstrado que a adição de gonadotrofinas e estradiol ao meio de maturação melhora tanto a capacidade fecundante como a competência de desenvolvimento dos oócitos bovinos¹⁵, outros demonstraram que a suplementação hormonal não surtiu efeito positivo⁵. Provavelmente as doses hormonais e as condições de cultura (tipo de soro, temperatura) sejam os fatores que mais contribuíram para essas contradições.

No experimento II, a TC e a produção de MO/BL diferiram (p<0,01) para cada reprodutor (Tab. 2).

Tabela 2

Taxas de clivagem (TC) e de mórulas/blastocistos (MO/BL), a partir de oócitos bovinos maturados in vitro e fecundados in vitro com sêmen de diferentes reprodutores (R1.e R2)1. UNESP, Jaboticabal-1996.

* (p<0,05) = diferiram significativamente ao nível de 5%; 1 Experimento realizado no DRA da FCAVJ-UNESP – Jaboticabal-SP durante o período de outubro de 1995 a março de 1996.

Diversas evidências têm mostrado a importância do reprodutor no sistema de produção in vitro de embriões^4,12. As diferenças existentes entre touros são manifestadas, tanto na capacidade fecundante como na competência de desenvolvimento, mesmo quando algumas variáveis (concentração espermática e de heparina) são padronizadas. Em um mesmo touro, as concentrações espermática e de heparina determinam diferenças na taxa de fertilização e na produção de embriões^4,6,10. Portanto, para cada reprodutor utilizado no sistema PIV, alguns ensaios devem ser previamente desenvolvidos para ajustar a concentração espermática e a dosagem de heparina com a finalidade de maximizar ambos, capacidade fecundante e competência de desenvolvimento embrionário.

CONCLUSÕES

Baseado nos resultados deste trabalho, pode-se concluir que:

a) a adição de hormônios ao meio de maturação parece não interferir de maneira decisiva na produção de embriões, entretanto mostrou ser um procedimento mais prático em comparação às células da granulosa;

b) a utilização de sêmen de dois reprodutores resultou em diferentes taxas de desenvolvimento embrionário in vitro, ressaltando a importância da seleção de touros para utilização em sistema de produção de embriões in vitro.

SUMMARY

The conditions of in vitro maturation of bovine oocytes (Exp. I) and bull effect (Exp. II) on cleavage (CR) and the in vitro morulae and blastocysts (MO/BL) rates were evaluated. Imatured oocytes were matured in vitro under different conditions: B-199 medium with 5% estrous cow serum (ECS), 5% fetal calf serum (FCS) and granulosa cells (T₁/Exp. I) or B-199 medium with 10% FCS, 14 IU/ml PMSG and 7 IU/ml hCG (T₂/Exp I). After 24 h culture, the mature oocytes were inseminated with frozen-thawed semen from two bulls (R₁ and R₂/Exp. II). In the Exp. I, the T₁ and T₂ oocytes were inseminated with semen from R₁/Exp. II and in the exp. II the semen from both bulls inseminated T₁/Exp. I oocytes. After 48 h, the 2-4 cells embryos were transferred into embryo culture droplets and were further cultured for 9 days. The CR of T₂/Exp I was higher (p<0.01) than T₁/Exp. I. There was a significant difference (p<0.05) between bulls on CR and Mo/Bl production. The use of hormones in a maturation medium has no effect on embryo production, however the procedure seems to be simpler than with granulosa cells. The use of semen from different bulls for in vitro fertilization has affected the subsequent in vitro production of embryos.

UNITERMS: Maturation; Fertilization; In vitro; Oocytes; Bovine.

Recebido para publicação: 30/08/1996

Aprovado para publicação: 23/09/1997

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*

Projeto financiado pela FAPESP.

¹ Instituto de Zootecnia de Nova Odessa - SP

² Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP, Campus de Jaboticabal, Jaboticabal - SP

¹

Pharmacia, Uppsala, Suécia.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Ago 2000
• Data do Fascículo
  1998

Histórico

• Aceito
  23 Set 1997
• Recebido
  30 Ago 1996