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Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science

versão impressa ISSN 1413-9596versão On-line ISSN 1678-4456

Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci. v.35 n.4 São Paulo  1998

http://dx.doi.org/10.1590/S1413-95961998000400003 

Fagotipagem de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a antibióticos, isoladas de leite

Phage typing strains of Staphylococcus aureus resistant to antibiotics, isolated from milk

 

Wanderley Pereira de ARAÚJO1

 

Correspondência para:
Wanderley Pereira de Araújo
Departamento de Clínica Médica
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP
Cidade Universitária Armando de Salles Oliveira
Av. Orlando Marques de Paiva, 87
05508-000 – São Paulo – SP
e-mail: wparaujo@usp.br

 

 

RESUMO

A partir de amostras de leite cru foram isoladas 201 cepas de S. aureus, as quais foram submetidas a provas de resistência a antibióticos pelo método dos discos impregnados com os seguintes antibacterianos: amicacina, ampicilina, cefalotina, cefoxitina, cloranfenicol, clindamicina, oxacilina, penicilina, tetraciclina, tobramicina e vancomicina. Com exceção de 88 (43,8%), 90 (44,8%), 24 (11,9%) e 40 (19,9%) cepas resistentes à penicilina, ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina, respectivamente, a maioria das 201 cepas (95% ou mais) foi sensível aos antibióticos utilizados. As cepas resistentes a estes quatro antibióticos foram fagotipadas, empregando-se os Conjuntos Básicos Internacionais de bacteriófagos para cepas de origem humana e bovina, verificando-se que houve predomínio de cepas sensíveis a fagos dos grupos III e III/NC do conjunto básico humano e a fagos dos grupos III, IV e da associação III/IV do conjunto bovino.

UNITERMOS: Tipagem de bacteriófagos; S. aureus; Leite; Testes de sensibilidade microbiana.

 

 

INTRODUÇÃO

A mastite bovina, doença responsável por graves prejuízos à pecuária leiteira em inúmeros países, é freqüentemente determinada pelo Staphylococcus aureus, bactéria resistente a diversos antibióticos utilizados rotineiramente para o tratamento da doença. No Estado de São Paulo, através de fagotipagem, alguns pesquisadores identificaram diferentes cepas dessa bactéria isoladas de leite de vacas com mastite15, 18; da pele da mama e tetos de animais sadios1 ou, ainda, de amostras de leite colhidas de latões2.

A verificação da sensibilidade do S. aureus aos diferentes antibióticos empregados no tratamento da mastite bovina tem grande importância para o clínico veterinário, pois visa fornecer subsídios para a terapia do animal acometido, bem como para todos os animais do rebanho submetidos às mesmas condições de manejo de ordenha e, portanto, com os mesmos riscos de infecção. Deve-se ressaltar a possibilidade da transmissão da bactéria entre o homem e animais, pois já foi relatada a ocorrência de cepas de S. aureus isoladas de leite associadas a casos de infecção humana pelo fagótipo 80/81, muitos dos quais resistentes a vários antibióticos20.

Em países como Espanha12; Inglaterra11 e Índia21, verificaram-se elevadas percentagens de cepas de S. aureus isoladas do leite de vacas com mastite resistentes à penicilina. No Brasil, particularmente no Estado de São Paulo, alguns investigadores têm evidenciado diferentes percentagens de resistência do S. aureus a antibióticos15,7.

Quanto à fagotipagem, trata-se de um processo de identificação bacteriana através do qual se podem reconhecer linhagens distintas, denominadas fagótipos, de uma mesma espécie de bactéria, fator importante em estudos epidemiológicos, pois permite, não raramente, identificar a fonte de infecção e vias de transmissão e, assim sendo, adequar as medidas de prevenção. A este respeito, Williams et al.25 referiram que a fagotipagem de S. aureus era utilizada em investigações epidemiológicas relacionadas, principalmente, a surtos de intoxicação alimentar e a casos de infecção hospitalar. Em medicina veterinária, através da fagotipagem de S. aureus isolados dos bovinos e do homem e, também, de equipamentos utilizados para a ordenha, pertencentes a 40 propriedades leiteiras nos Estados Unidos10, concluiu-se que a pele dos tetos, as ordenhadeiras mecânicas e a pele das mãos dos ordenhadores constituíam importantes fontes para contaminação intramamária e, conseqüentemente, para o desenvolvimento de mastite.

Para a fagotipagem do S. aureus tem sido utilizado um conjunto básico de bacteriófagos, padronizado internacionalmente em 1974 na Checoslováquia, ao qual as cepas isoladas dessa bactéria devem ser submetidas23. Entretanto, embora as cepas de S. aureus isoladas de bovinos possam ser lisadas por fagos utilizados para cepas de origem humana, alguns autores sugeriram o uso de conjunto de fagos obtidos de estafilococos isolados de bovinos, a fim de aumentar o índice de tipificação8,9,17,19,22.

Foi observado que S. aureus isolados de leite eram lisados com maior freqüência pelos fagos 42A, 42D, 83A e 81 do conjunto internacional e pelos fagos S2 e S5 da série proposta para cepas bovinas por Seto; Wilson22, aumentando o índice de tipificação de 77 para 87%, quando se incluíam os dois últimos fagos9. Em casos de mastite, observou-se que S. aureus produtores de b -hemolisina eram lisados pelo bacteriófago 42D, relacionado a cepas de origem bovina16. Utilizando-se o conjunto de fagos para S. aureus de origem humana, de 41 cepas isoladas do leite de vacas com mastite, apenas 12 (22,26%) puderam ser fagotipadas21.

O objetivo da presente investigação é verificar a resistência a diferentes antibióticos de cepas de S. aureus isoladas de amostras de leite, relacionando-a com as características obtidas através da fagotipagem.

 

MATERIAL E MÉTODO

Colheita das amostras de leite, isolamento e identificação das cepas de S. aureus

Foram colhidas 100 amostras de leite a partir de latões em 53 propriedades leiteiras localizadas nos municípios de Descalvado, Taquari, Analândia e Pirassununga no Estado de São Paulo2. Tais amostras, colhidas ao acaso em tubos esterilizados, foram colocadas em caixa de material isotérmico contendo cubos de gelo e transportadas ao laboratório, onde eram mantidas em refrigerador (4ºC) até a realização dos exames microbiológicos, realizados no prazo máximo de 24 horas. No laboratório, as amostras de leite foram semeadas em placas de ágar Baird-Parker, as quais eram incubadas a 37ºC, por 24 a 48 horas13. Após a incubação, efetuava-se o isolamento de 1 a 5 colônias de cor negra, brilhantes, com zona de precipitação circundada por halo claro3, semeando-as em tubos de ágar simples inclinado, incubados a 37ºC por 24 horas. Comprovando-se a presença de cultura pura de cocos Gram-positivos agrupados em forma de cachos em cada um dos tubos de ágar simples inclinado, realizava-se a identificação bioquímica das cepas de S. aureus, através das provas da catalase4, oxidação-fermentação da glicose24, coagulase livre26 e termonuclease14.

Pesquisa da sensibilidade a antibióticos das cepas de S. aureus

Realizou-se a prova da sensibilidade das cepas de S. aureus isoladas das amostras de leite pelo método dos discos impregnados com antibióticos5. Inicialmente, as cepas de S. aureus foram semeadas em tubos contendo caldo Mueller-Hinton e incubadas a 37ºC durante 4 a 6 horas. Após a incubação, quando necessário, adicionava-se ao caldo de cultura, assepticamente, o próprio meio de cultura estéril e comparava-se a uma solução padrão de sulfato de bário, para se atingir a turbidez equivalente à concentração de 1,5 x 108 microrganismos/mililitro, recomendada para a prova de sensibilidade*. A seguir, umedecia-se um cotonete esterilizado no caldo cultivado e semeavam-se placas de Petri contendo ágar Muller-Hinton, esfregando-se o cotonete em várias direções sobre o ágar para se obter uma distribuição uniforme da bactéria. Depois, com auxílio de uma pinça, os discos impregnados com antibióticos** eram depositados e levemente pressionados sobre a superfície do meio inoculado na placa de Petri, mantendo-se, entre um disco e outro, a distância de, aproximadamente, 3 centímetros.

As placas eram incubadas a 37ºC por 18 horas e, após, com uma régua, realizava-se a leitura dos halos de inibição, anotando-se o diâmetro. Os resultados eram interpretados como resistente (R), sensibilidade intermediária (I) e sensível (S), de acordo com tabela fornecida pelo fabricante dos discos de sensibilidade. Foram utilizados os seguintes antibióticos: amicacina, ampicilina, cefalotina, cefoxitina, clindamicina, cloranfenicol, eritromicina, gentamicina, kanamicina, oxacilina, penicilina, tetraciclina, tobramicina e vancomicina.

Fagotipagem das cepas de S. aureus isoladas

A fagotipagem das cepas de S. aureus foi realizada na Seção de Fagotipagem do Laboratório de Estreptococos e Estafilococos, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo, por gentileza do Prof. Dr. Carlos Solé-Vernin, sendo utilizados 2 conjuntos de fagos, um composto por 23 fagos, adotado pelo Centro Internacional de Fagotipagem, com sede em Colindale, Inglaterra, constituindo o conjunto básico para classificação de S. aureus de origem humana e, o outro, composto por 16 fagos, adotado pelo Subcomitê Internacional de Fagotipagem, pertencentes ao conjunto básico para cepas de origem bovina, conforme Quadros 1 e 2, a seguir:

 

Quadro 1

Conjunto Básico Internacional de Bacteriófagos para
Fagotipagem de cepas de S. aureus de origem humana.

 

 

Quadro 2

Conjunto Básico Internacional de Bacteriófagos para
Fagotipagem de cepas de S. aureus de origem bovina.

 

Nas provas de fagotipagem, empregou-se uma técnica6 pela qual, inicialmente, submetiam-se as cepas aos diferentes fagos dos 2 conjuntos, na concentração de 1 x RTD (Routine Test Dilution), simultaneamente, numa mesma placa. Posteriormente, as cepas que não eram lisadas frente a 1 x RTD, eram submetidas a teste com 100 x RTD dos mesmos fagos. Na composição do fagótipo, para cada cepa, levou-se inicialmente em consideração o resultado da fagotipagem frente à diluição 1 x RTD para os dois conjuntos de bacteriófagos. O fagótipo foi composto considerando-se o conjunto de fagos, humanos e/ou bovinos, que reagiram, sobretudo naquela diluição. Caso não houvesse nenhum fago dos dois conjuntos reagentes a 1 x RTD, o fagótipo era então constituído a partir dos resultados frente a 100 x RTD. Foram consideradas não-tipáveis (NT) as cepas que não reagiram, em qualquer uma das duas diluições, a nenhum dos fagos dos conjuntos humano ou bovino.

 

RESULTADOS

Das cem amostras de leite analisadas, cinqüenta revelaram-se positivas para S. aureus, das quais foram isoladas 201 cepas, que foram submetidas às provas de sensibilidade a antibióticos e de fagotipagem.

Na Tab. 1, são apresentados os resultados da prova de sensibilidade a antibióticos das cepas de S. aureus e, nas Tab. 2 e 3, os resultados da prova de fagotipagem das cepas resistentes à penicilina, ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina, com o conjunto básico humano e bovino, respectivamente.

 

Tabela 1

Distribuição das 201 cepas de S. aureus isoladas de leite,
segundo a sensibilidade a antibióticos. São Paulo, 1996.

 

 

Tabela 2

Distribuição das cepas de S. aureus resistentes à
penicilina, ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina, segundo
os grupos de fagos do conjunto básico humano.
São Paulo, 1996.

 

 

Tabela 3

Distribuição das cepas de S. aureus resistentes à penicilina,
ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina, segundo os grupos de
fagos do conjunto básico bovino. São Paulo, 1996.

 

Consultando-se as tabelas, verifica-se que a maioria das cepas de S. aureus (95% ou mais) foi sensível aos antibióticos empregados, exceto à penicilina, ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina, aos quais houve 88 (43,8 %), 90 (44,8 %), 24 (11,9 %) e 40 (19,9 %) cepas resistentes, respectivamente. Destas cepas, 26 (29,6%) e 23 (26,1%); 29 (32,2%) e 23 (25,6%); 4 (16,7%) e 6 (25,0%); 11 (27,5%) e 12 (30,0%) foram sensíveis a fagos do grupo III e III/Não Classificado, respectivamente. Em relação ao Conjunto Bovino, das cepas resistentes à penicilina, ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina, 15 (17,0%), 15 (17,0%) e 15 (17,0%); 16 (17,7%), 15 (16,7%) e 15 (16,7%); 2 (8,3%), 2 (8,3%) e 6 (25,0%); 6 (15,0%), 6 (15,0%) e 7 (17,5%) foram sensíveis, respectivamente, a fagos dos grupos III, IV e da associação III/IV.

 

DISCUSSÃO

A maioria das cepas de S. aureus mostraram-se sensíveis aos antibióticos utilizados neste experimento, com exceção da penicilina, ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina, para os quais foram detectadas, respectivamente, 88 (43,8%), 90 (44,8%), 24 (11,9%) e 40 (19,9%) cepas resistentes.

Na Espanha12 e na Inglaterra11, verificou-se que cepas de S. aureus isoladas do leite de vacas com mastite se mostraram resistentes à penicilina, em cerca de 40% dos casos. Na Índia21, isolou-se um grande número de bactérias do leite de vacas com mastite, principalmente S. aureus, resistentes à penicilina e estreptomicina, fato que se deve, segundo os autores citados, à ampla e má utilização da associação desses antibióticos no tratamento da doença, naquele país. Todavia, evidenciou-se no Estado de São Paulo, Brasil, que de 951 S. aureus isolados do leite de vacas com mastite, 75 a 90% eram sensíveis à cefalotina, nitrofurantoína, vancomicina e novobiocina; entretanto, todas as cepas foram resistentes à fosfomicina, polimixina B, colistina e rifamicina7. Em outro experimento15, no mesmo Estado, observou-se que, com exceção da tetraciclina e estreptomicina, ocorreu grande sensibilidade a antibióticos de cepas de S. aureus isoladas de vacas com mastite, levando os autores da pesquisa a afirmarem que o leite não constituía fonte importante de disseminação de estafilococos resistentes.

Muitas vezes, a comparação entre os resultados desta pesquisa com os verificados na bibliografia consultada tornou-se difícil, devido à variabilidade na metodologia utilizada pelos diferentes pesquisadores, embora pareça haver consenso quanto à elevada freqüência de cepas de S. aureus isoladas de bovinos resistentes à penicilina nos diferentes países1,12,21.

Provavelmente, a elevada freqüência de cepas de S. aureus resistentes a diferentes grupos de antibióticos usados no combate da mastite bovina, muitas vezes está condicionada, entre outros fatores, à má utilização de determinado produto, como, por exemplo, aplicação em subdosagens e período insuficiente de tratamento dos animais com a doença que, associados às normas higiênicas de manejo de ordenha mal conduzidas, propiciam a existência de portadores de cepas de S. aureus resistentes e facilitam a transmissão dessas bactérias entre os animais criados no mesmo ambiente, inclusive através das mãos do ordenhador e de utensílios destinados à ordenha.

Quanto à fagotipagem, constatou-se que, das cepas resistentes à penicilina, ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina, 15,9; 15,5; 25,0; e 25,0%, respectivamente, não foram tipáveis pelo conjunto de fagos de origem humana, enquanto, com o conjunto bovino, estes valores foram menores, ou seja, de 9,1; 8,9; 12,5 e 17,5%, respectivamente, concordando com as observações de vários pesquisadores8,9,17,19,22 que já haviam demonstrado o aumento do índice de tipificação do S. aureus, utilizando bacteriófagos obtidos a partir de cepas isoladas de bovinos.

Neste experimento, verificou-se que entre as cepas de S. aureus isoladas de leite e resistentes a penicilina, ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina houve predomínio das cepas sensíveis a fagos do grupos III e III/NC e a fagos dos grupos III, IV e da associação III/IV dos Conjuntos Básicos Internacionais Humano e Bovino, respectivamente. De forma semelhante ao constatado na resistência aos antibióticos, devido à diversidade na padronização dos conjuntos de fagos observados na bibliografia internacional, tornou-se difícil a comparação dos nossos resultados com aqueles obtidos por diferentes pesquisadores.

Na Espanha12, também se evidenciou, a partir de 53 cepas de S. aureus isoladas de leite de vacas com mastite, a maior freqüência de fagótipos dos grupos III e IV e da associação III e IV.

No Brasil18, constatou-se predominância de S. aureus do fagótipo 119 do grupo Miscelânea do conjunto bovino, na maioria dos 17 rebanhos produtores de leite B, a partir de cepas isoladas de amostras de leite colhidas de vacas com mastite criadas na região de Ribeirão Preto, São Paulo. Num estudo de portadores bovinos em lactação1, a partir de cepas isoladas da pele do úbere, evidenciou-se maior freqüência de S. aureus sensíveis a fagos dos grupos III e da associação III/IV do conjunto bovino e grupo III do conjunto humano.

Ainda, no Estado de São Paulo15, verificou-se que cepas de S. aureus isoladas de leite de vacas com mastite eram lisadas com maior freqüência pelos fagos dos grupos III e III/Não Classificado do conjunto humano, bem como, pelos fagos dos grupos IV e Miscelânea, específicos do conjunto bovino.

Quanto às dificuldades encontradas na comparação dos resultados obtidos nesta investigação com os referidos na literatura mundial, parece-nos oportuno comentar que consideramos de fundamental importância, em futuros trabalhos relacionados à pesquisa de "resistência a antibióticos" e "fagotipagem de S. aureus", que os autores citem, além de, obviamente o método empregado nestas determinações, o conjunto de antibióticos e de bacteriófagos utilizados, respectivamente, para permitir comparabilidade de resultados, preferencialmente seguindo as recomendações estabelecidas por comissões oficiais de padronização, conforme salientou Solé-Vernin23, no tocante à fagotipagem de S. aureus. Este último autor considerou que no caso particular do S. aureus, os bacteriófagos não apresentam ação lítica altamente específica como aquela que ocorre para a Salmonella typhi, agente etiológico da febre tifóide. Salientou ainda a necessidade do trabalho em equipe do clínico, epidemiologista e o bacteriologista, pois reações fracas na fagotipagem poderiam auxiliar na confirmação de identidade de dois fagótipos algo diferentes.

Assim, o exame bacteriológico de amostras de leite torna-se importante subsídio ao clínico veterinário para orientação sobre os agentes bacterianos prevalentes num rebanho leiteiro, auxiliando na conduta terapêutica de casos de mastite, principalmente quando associado à prova de antibiograma. Permite ao veterinário identificar a ocorrência de possíveis agentes etiológicos de mastite resistentes a antibióticos, principalmente em relação ao S. aureus, cuja sensibilidade, geralmente, é muito baixa. Além disso, associando-se os resultados da resistência a antibióticos aos da fagotipagem, que permite identificar linhagens de S. aureus, será possível ao veterinário conhecer as cepas prevalentes e animais fontes de infecção e, conseqüentemente, assegurar medidas mais adequadas para o controle da mastite no rebanho.

 

CONCLUSÕES

De acordo com o material e a metodologia utilizados neste experimento sobre resistência a antibióticos e fagotipagem de cepas de Staphylococcus aureus isoladas de leite podemos destacar as seguintes conclusões:

1) a maioria das cepas de S. aureus mostraram-se sensíveis aos antibióticos utilizados neste experimento, com exceção da penicilina, ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina, para os quais foram detectadas, respectivamente, 88 (43,8%), 90 (44,8%), 24 (11,9%) e 40 (19,9%) cepas resistentes;

2) das cepas resistentes à penicilina, ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina, 15,9; 15,5; 25,0; e 25,0%, respectivamente, não foram tipáveis pelo conjunto de fagos de origem humana, enquanto, com o conjunto bovino, estes valores foram menores, ou seja, de 9,1; 8,9; 12,5 e 17,5%, respectivamente;

3) dentre as cepas de S. aureus isoladas de leite e resistentes a penicilina, ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina, houve predomínio da cepas sensíveis a fagos do grupos III e III/NC e a fagos dos grupos III, IV e da associação III/IV dos Conjuntos Básicos Internacionais Humano e Bovino, respectivamente;

4) é altamente recomendável, em futuros estudos sobre "resistência a antibióticos" e "fagotipagem" de S. aureus, relacionar o conjunto de antibióticos e de bacteriófagos utilizados, respectivamente, para permitir comparabilidade de resultados, preferencialmente seguindo as recomendações estabelecidas por comissões oficiais de padronização.

 

 

SUMMARY

In this study, 201 strains of S. aureus were isolated from crude milk and submitted to antibiotic resistance by the disc diffusion method using impregnated paper discs with the following antibiotics: amikacin, ampicillin, cephalotin, cephoxitin, chloramphenicol, clindamycin, oxacylin, penicillin, tetracycline, tobramycin and vancomycin. With the exception of 88 (43.8%), 90 (44.8%), 24 (11.9%) e 40 (19.9%) resistant strains to penicillin, ampicillin, chloramphenicol and tetracycline, respectively, it was verified that most of the 201 strains (95% or more) showed sensitivity to the others tested antibiotics. The strains resistant to these four antibiotics were phage-typified with the basic international set of phages for S. aureus of human and bovine origin and showed predominant sensitivity to the phage of the groups III and III/No Classified from the human basic set and to the phage groups III, IV and to the association III/IV from the bovine set.

UNITERMS: Bacteriophage typing; S. aureus; Milk; Microbial sensitivity tests.

 

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Enviado para publicação: 27/08/1996
Aprovado para publicação: 19/11/1997

 

 

1 Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP - SP
* Os meios de cultura foram fornecidos pela Laborterápica Bristol.
** Cefar Fármaco Diagnóstica.

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