Co-cultivo de zigotos e embriões de duas células de camundongos (Mus musculus domesticus) em suspensão de células epiteliais de ovidutos de camundongos e bovinos nos meios CZB sem glicose, TCM199 e Ménézo B2

Zygotes and two cells mouse embryos in co-culture of mouse and bovine epithelial cells in CZB glucose free, TCM199 and Ménézo B2 mediuns

Co-cultivo de zigotos e embriões de duas células de camundongos (Mus musculus domesticus) em suspensão de células epiteliais de ovidutos de camundongos e bovinos nos meios CZB sem glicose, TCM199 e Ménézo B₂

Zygotes and two cells mouse embryos in co-culture of mouse and bovine epithelial cells in CZB glucose free, TCM199 and Ménézo B₂ mediuns

Liliam Mara Trerrisan TAVARES¹; Mayra Elena Ortiz D’Avila ASSUMPÇÃO¹; Fernando FERREIRA²; Alecsandra Sobreira LIMA¹; Marco Roberto Bourg MELLO¹; José Antonio VISINTIN¹

CORRESPONDÊNCIA PARA:

José Antonio Visintin

Departamento de Reprodução Animal

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP

Cidade Universitária Armando de Salles Oliveira

Av. Orlando Marques de Paiva, 87

05508-000 – São Paulo – SP

e-mail: [e-mail]

RESUMO

Zigotos e embriões de 2 células de camundongos F1 (C57/DBA) foram cultivados (controle) e co-cultivados em suspensões de células epiteliais de ovidutos de camundongos (MOEC) e de bovinos (BOEC) até o estádio de blastocistos nos meios CZB, TCM199 e Ménézo B₂. Os zigotos que atingiram os estádios de blastocistos expandido e eclodido no CZB foram 44 (38,26%) para o controle, 2 (1,89%) para as MOEC e 8 (6,72%) para as BOEC, sendo que o controle apresentou-se estatisticamente diferente (p£0,05) em relação às MOEC e às BOEC. Os zigotos cultivados e co-cultivados nos meios TCM199 e B₂ não clivaram além de 2 células. Os embriões de 2 células que desenvolveram até blastocistos no CZB foram 46 (43,80%) para o controle, 45 (38,79%) para as MOEC e 37 (29,60%) para as BOEC, sendo que o controle apresentou-se estatisticamente diferente (p£0,05) em relação às BOEC. No TCM199, o total de blastocistos foi de 52 (48,15%) para o controle, 68 (39,08%) para as MOEC e 64 (48,49%) para as BOEC, não havendo diferença estatística (p>0,05) entre os três grupos. No B₂, o total de blastocistos foi de 28 (24,78%) para o controle, 34 (28,10%) para as MOEC e 25 (23,81%) para as BOEC, não havendo diferença estatística (p>0,05) entre os três grupos. Concluiu-se que o bloqueio dos zigotos nos meios TCM199 e B₂ pode estar relacionado à presença da glicose e que o oviduto não é espécie-específico quanto a sua capacidade em promover o desenvolvimento de embriões de camundongos.

UNITERMOS: Cultivos celulares; Células epiteliais; Embriões; Camundongos.

INTRODUÇÃO

Quando se cultivam embriões in vitro, ocorre o chamado "bloqueio celular" na fase de 2 células em camundongos e na fase de 8 células em bovinos². Estudos sobre o bloqueio celular mostram que esta fase coincide com as modificações na síntese de mRNA, sugerindo que em camundongos, até o final do estádio de 2 células, o embrião está sob controle materno e que o cultivo in vitro induz a deficiências citoplasmáticas que não permitem o seu desenvolvimento até o estádio de blastocisto¹³. Sabe-se que in vivo vários processos são responsáveis pelo desenvolvimento, como, por exemplo, as mudanças na síntese protéica após a fecundação. Em camundongos, da fase de zigoto até 8 células, ocorrem alterações nas proteínas sintetizadas a partir do mRNA materno, degradação do mRNA e aumento do mRNA embrionário¹⁶. Para que estas modificações ocorram, fatores autócrinos e parácrinos atuam sobre o embrião durante o seu desenvolvimento, como os fatores de crescimento do embrião e do fluido do oviduto, as proteínas específicas sintetizadas pelas células epiteliais do oviduto e os demais componentes do fluido do oviduto, como os íons, o lactato e o piruvato, interagindo intensa e delicadamente com o embrião, possibilitando o seu desenvolvimento até o estádio de blastocisto⁹.

Para minimizar o bloqueio celular durante o cultivo in vitro, vêm sendo utilizados sistemas de co-cultivo com células epiteliais de oviduto ou com células estabelecidas ou meios condicionados, demonstrando a não-especificidade do oviduto sobre o desenvolvimento embrionário^20,25,38. É sabido que o fluido do oviduto é constituído de várias substâncias derivadas do plasma sangüíneo e de proteínas específicas secretadas pelas células do oviduto²³, sendo que uma proteína de baixo peso molecular (<46KDa), provavelmente sintetizada pelo oviduto, é importante nas primeiras clivagens dos embriões de camundongos²⁶.

Diante dos resultados controversos em relação à especificidade celular para o co-cultivo de embriões e das dificuldades no desenvolvimento in vitro de embriões de camundongos de linhagens que apresentam bloqueio no estádio de duas células, o presente estudo dirigiu-se para a produção de células epiteliais de ovidutos de camundongos e bovinos em suspensão e para o co-cultivo de zigotos e embriões de 2 células de camundongos em suspensões celulares até o estádio de blastocisto.

MATERIAL E MÉTODO

Cultivo de Células Epiteliais de Ovidutos de Camundongos

Foram utilizadas fêmeas F1 C57Bl/DBA, entre 6 e 8 semanas de idade, mantidas à temperatura de 22ºC, 55% de umidade, renovação de ar controlada, 14 horas luz e com água e ração ad libitum. As camundongas foram superovuladas com 5 UI de eCG (Intervet) e, após 48 horas, 5 UI de hCG (Intervet), sendo acasaladas com machos vasectomizados. Após 24 horas da aplicação do hCG, as fêmeas foram sacrificadas por deslocamento cervical e aberta a cavidade abdominal para retirada dos ovidutos, os quais foram colocados em placa de Petri (Costar) de 35 mm contendo Solução Salina Tamponada (PBS – Nutricell) acrescida de 10% de Soro Fetal Bovino (SFB – Nutricell). Os ovidutos foram mantidos no meio Tissue Culture Medium 199 (TCM199 – Gibco)acrescido de 0,05% de pronase(Sigma) por 90 minutos à temperatura de 37ºC em estufa com 5% de CO₂³⁶. Após este período, a solução de TCM199 foi transferida para um tubo cônico (Costar) de 15 ml, onde permaneceu por 10 minutos para sedimentar as células, quando foi descartado o sobrenadante. Este processo foi repetido por duas vezes nos meios de cultivo Chatot, Ziomek e Bavister (CZB) acrescidos de 4 mg de BSA fração V (Sigma) por ml ou TCM199 e Ménézo B₂ (B₂ – INRA) acrescidos de 10% de SFB. Em seguida, cada sedimento foi ressuspendido em 1 ml do respectivo meio, colocando-se 250 µl em uma placa de Petri de 35 mm contendo 2,5 ml do próprio meio de cultivo. As células foram cultivadas em estufa com 5% de CO₂ e temperatura de 37ºC durante 8 dias (controle), realizando-se a troca dos meios CZB, TCM199 e B₂ após 48 horas do início do cultivo e nas avaliações a cada 48 horas. Ainda, foi efetuado o cultivo em suspensão, colocando-se de 4 a 6 pequenos aglomerados de células por gota de 100 µl dos meios CZB, TCM199 ou B₂, sob óleo mineral (Sigma) em placa de Petri (Costar) de 60 mm. Após 3 lavagens nos respectivos meios, os zigotos e os embriões de 2 células de camundongos foram colocados em co-cultivos.

Cultivo de Células Epiteliais de Ovidutos de Bovinos

Os ovidutos foram colhidos até 15 minutos após o abate das fêmeas, lavados 2 vezes em solução fisiológica 0,9% adicionada de 100 UI de penicilina G (Sigma) por ml e em seguida transportados nesta solução a 29ºC. No laboratório, os ovidutos foram lavados em solução fisiológica 0,9% e dissecados, sendo sob fluxo laminar, lavados externamente com álcool 70ºGL e ainda, externa e internamente, com solução de PBS acrescida de 10% de SFB e 100 UI de Penicilina G e 50 mg de Estreptomicina (Sigma) por ml. O oviduto foi comprimido levemente e injetado em sua luz 2 ml de PBS, recuperando-se as células epiteliais em um tubo cônico de 15 ml, onde foram sedimentadas durante 10 minutos⁸. Em seguida, realizaram-se duas lavagens em PBS e duas nos meios CZB acrescidos de 4 mg de BSA fração V por ml ou TCM199 e B₂ acrescidos de 10% SFB. Após a última lavagem, cada sedimento foi ressuspendido em 1 ml do respectivo meio, procedendo-se ao cultivo celular como mencionado no item 3.1.

Co-cultivo de Zigotos e de Embriões de 2 Células de Camundongos em Suspensões de Células Epiteliais de Ovidutos de Camundongos e de Bovinos

Os embriões de camundongos foram colhidos em estádios de zigoto e de 2 células, de fêmeas F1 C57Bl/DBA, púberes entre 6 e 8 semanas de vida, superovuladas com 5 UI de eCG e, após 48 horas, 5 UI de hCG, via intraperitoneal, sendo acasaladas com machos inteiros da mesma linhagem. Após 26 a 28 e 40 a 42 horas da injeção de hCG, foram efetuadas as colheitas dos zigotos e dos embriões de 2 células, respectivamente. Para a colheita dos zigotos e dos embriões de 2 células, as fêmeas foram sacrificadas, os ovidutos retirados e transferidos para placa de Petri de 35 mm contendo solução de PBS acrescida de 10% de SFB. A colheita dos zigotos e dos embriões de 2 células foi realizada com auxílio de seringa de 1 ml e agulha gengival 30G (B&D) sob fluxo laminar. Após cada colheita, 15 a 20 zigotos ou embriões de 2 células foram colocados no co-cultivo em suspensão de células de ovidutos de camundongos ou de bovinos, em gota de 100 µl de CZB acrescido de 4 mg de BSA-V por ml ou TCM199 e B₂ acrescidos de 10% de SFB, sob óleo mineral em placa de Petri de 60 mm.

Como controle, foram cultivados zigotos e embriões de 2 células nos meios CZB, TCM199 e B₂ sem células, em gota de 100 µl sob óleo mineral.

Os sistemas de cultivo e de co-cultivo dos zigotos foram avaliados às 24, 72 e 96 horas e dos embriões de 2 células às 48 e 72 horas após o início do cultivo.

Análise estatística

Com o objetivo de comparar a proporção de desenvolvimento embrionário, utilizou-se o teste Qui-quadrado (c ²) com nível de significância a 95% (a <0,05). Em situações em que os valores empregados foram menores que 5, utilizou-se o teste de Fisher³. Todos os cálculos estatísticos foram efetuados pelo programa Epi Info Executive Health Information Shell 1.03.08/3/95, idealizado por Coulombier D.^*; Faran, R.^*; Halthock, L.^** ; e Smith, C.^*.

RESULTADOS

No experimento de cultivo e de co-cultivo de zigotos (Tab. 1) no CZB (zigoto x CZB), os resultados demonstraram que 100% dos embriões, no segundo dia (D-2), atingiram o estádio de duas células nos grupos CONTROLE, MOEC e BOEC. No quarto dia (D-4), os embriões bloqueados e não-bloqueados (mórulas e blastocistos) apresentaram-se estatisticamente diferentes entre os grupos CONTROLE, BOEC e MOEC (p£0,05), enquanto no quinto dia (D-5) o grupo CONTROLE apresentou-se estatisticamente diferente (p£0,05) em relação aos grupos MOEC e BOEC quanto aos blastocistos expandido e eclodido.

Tabela 1

Desenvolvimento de embriões de 2 células de camundongos nos meios CZB, TCM199 e B2 com e sem células epiteliais de ovidutos de camundongos (MOEC) e de bovinos (BOEC), São Paulo – 1997.

Nos experimentos com os meios TCM199 e B₂, houve bloqueio de desenvolvimento de 100% dos embriões após a primeira clivagem (Tab. 1).

No experimento de cultivo e de co-cultivo de embriões de 2 células (Tab. 2) no CZB (2 células x CZB), no D-4, tanto os embriões bloqueados quanto os não-bloqueados (mórulas e blastocistos) não apresentaram diferenças estatísticas (p>0,05) entre os grupos CONTROLE, MOEC e BOEC. No D-5, os embriões em estádios de blastocistos expandido e eclodido cultivados no grupo CONTROLE apresentaram-se estatisticamente diferentes (p£0,05) em comparação aos co-cultivados no grupo BOEC.

Tabela 2

No experimento de cultivo e de co-cultivo de embriões de 2 células (Tab. 2) no TCM199 (2 células X TCM199), no D-4, tanto os embriões bloqueados quanto os não-bloqueados (mórulas e blastocistos) no grupo BOEC apresentaram-se estatisticamente diferentes (p£0,05) quando comparados aos grupos CONTROLE e MOEC. Já para o B₂ (2 células X B₂), observou diferença estatística (p£ 0,05) entre os grupos BOEC e CONTROLE. No D-5, tanto no B₂ quanto no TCM199, os blastocistos expandido e eclodido nos grupos CONTROLE, MOEC e BOEC não apresentaram diferenças estatísticas (p>0,05).

Comparando-se o desenvolvimento dos embriões de 2 células nos grupos CONTROLE e BOEC (Tab. 3), no D-4, verificaram-se que tanto os embriões bloqueados quanto os não-bloqueados (mórula e de blastocisto) apresentaram-se estatisticamente diferentes (p£0,05) entre os meios CZB, TCM199 e B_2. Já para a MOEC, observou-se que houve diferença estatística (p£0,05) entre o CZB e os meios TCM199 e B₂. No D-5, verificou-se que houve diferença estatística (p£0,05) em relação aos blastocistos no grupo CONTROLE entre o meio B₂ e os meios CZB e TCM199 e no grupo BOEC entre o meio TCM199 e os meios CZB e B₂, enquanto no grupo MOEC não houve diferença estatística (p>0,05) entre os meios CZB, TCM199 E B₂.

Tabela 3

Cultivo (controle) e co-cultivo de embriões de 2 células de comundongos com células epiteliais de ovidutos de camundongos (MOEC) e de bovinos (BOEC), nos meios CZB, TCM199 e B2. São Paulo – 1997.

DISCUSSÃO

Os estudos sobre o desenvolvimento de embriões de camundongos mostraram que há diferença entre os estádios embrionários durante o cultivo in vitro¹⁴. O cultivo in vitro de zigotos de camundongos apresenta algumas restrições, pois muitas linhagens possuem bloqueio no estádio de 2 células. A falha no desenvolvimento pode ser reflexo de ativação inadequada ou parcial do genoma embrionário durante a fase de transcrição¹¹. No entanto, a utilização de linhagens híbridas a partir do estádio de 2 células possibilitou o desenvolvimento normal dos embriões⁴⁴. Sabe-se que há influência do oviduto sobre o desenvolvimento de embriões entre os estádios de 2 e 4 células², interação entre as proteínas de alto e de baixo peso molecular do fluido do oviduto e do embrião^10,25,27 e presença de fatores autócrinos e parácrinos que estimulam a interação do oviduto com o embrião⁹. A utilização de segmento ou do órgão para o cultivo de embriões de camundongos, fecundados in vitro^5,32,43 ou colhidos nas fases de zigoto⁴⁶ e de 8 a 16 células²³ possibilitou avaliar o desenvolvimento de embriões até o estádio de blastocisto e estudar novas formas de cultivo in vitro²⁷. O oviduto tem papel ativo no desenvolvimento embrionário de mamíferos², podendo ser mimetizado in vitro pelo cultivo apropriado das células epiteliais do oviduto. No entanto, para embriões de camundongos, a ação metabólica das células epiteliais do oviduto parece alterar os fatores específicos que aumentam a taxa de clivagem³⁶.

No presente estudo, mesmo na presença de células epiteliais, o co-cultivo de zigotos nos meios TCM199 e B₂, mais complexos, não proporcionou desenvolvimento além do estádio de 2 células (Tab. 1), o que não ocorreu com o meio CZB. Provavelmente a glicose teve efeito inibitório ou as células não foram capazes de transformar a glicose presente nos meios³⁹, o suficiente para que os embriões pudessem desenvolver-se normalmente. In vivo, esta baixa concentração de glicose no fluido do oviduto parece ser devida à metabolização de parte da glicose pelas células do cumulus¹². No entanto, não foi observada diferença no desenvolvimento in vitro de zigotos em ovidutos de camundongas quando foram cultivados com e sem células do cumulus⁴⁵. O cultivo e o co-cultivo de zigotos no CZB livre de glicose possibilitaram seu desenvolvimento além de 2 células, observando-se que, no D-4 do embrião, houve clivagens até os estádios de mórula e de blastocisto no CZB controle (73,04%), no CZB com MOEC (85,85%) e no CZB com BOEC (47,90%), conforme mostra a Tab. 1, sugerindo que a ausência da glicose foi o fator determinante para a ultrapassagem do bloqueio. Entretanto, do estádio de mórula até o de blastocisto expandido houve decréscimo nas taxas de desenvolvimento (Tab. 1), mostrando que há necessidade de glicose a partir do estádio de mórula^6,37,40. Em bovinos, durante o desenvolvimento embrionário, a metabolização da glicose foi mais efetiva nos estádios de 8 a 16 células, acentuando-se ainda mais na fase de expansão do blastocisto³⁵, quando há maior demanda de energia.

Os experimentos do presente estudo, que utilizaram embriões de 2 células no cultivo sem células e no co-cultivo com MOEC e BOEC nos meios CZB livre de glicose, TCM199 e B₂, mostraram desenvolvimento até o estádio de blastocisto em todos os grupos (Tab. 2). Nos grupos controle, a taxa de bloqueio no D-4 dos embriões apresentou-se menor no cultivo com o CZB sem glicose (Tab. 3). Nesta fase, os embriões metabolizam grandes quantidades de glutamina³⁴, devido ao bloqueio da glicólise causada pela inibição da piruvatocinase³⁴, o qual pode estar relacionado à conservação da glicose para períodos subseqüentes ou ao aumento da demanda de energia³³. Suspeita-se que a presença da glutamina no CZB pode ter efeito benéfico nestes períodos sobre o desenvolvimento dos embriões.

Observou-se que os embriões do grupo com CZB, aparentemente, não sofreram influência benéfica das células epiteliais MOEC e BOEC, havendo, a partir do estádio de mórula, atraso de desenvolvimento dos embriões em cultivo e em co-cultivos, sugerindo que a ausência da glicose representa fator limitante para a evolução até blastocisto (Tab. 2). Avaliando-se os grupos de embriões de 2 células cultivados e co-cultivados no TCM199 e no B₂, observa-se que, no D-4 do embrião, o total de embriões em estádios de mórula e de blastocisto no co-cultivo em TCM199 com MOEC foi inferior (p£0,05) em relação ao TCM199 controle e com BOEC, sugerindo que a BOEC se adaptou melhor ao TCM199 ou que houve ineficiência de metabolização da glicose pelas células, o que não proporcionou meio adequado para o desenvolvimento embrionário (Tab. 2). Porém, não houve diferença estatística (p£0,05) quando se comparou o B₂ com MOEC e o B₂ controle ou com BOEC, sugerindo que ambas as células adaptaram-se de maneira semelhante ao meio (Tab. 2). Por outro lado, o total de blastocistos expandidos e eclodidos no D-5 do embrião demonstrou que os meios TCM199 e B₂, ambos com MOEC e BOEC, não apresentaram diferença estatística quando comparados aos seus controles sem células (Tab. 2). Os totais de embriões até blastocistos em células MOEC não apresentaram diferença estatística entre os meios CZB, TCM199 e B₂ (Tab. 3). Porém, quando comparou-se o co-cultivo com BOEC, o melhor desenvolvimento foi observado no TCM199 (Tab. 3). Estes resultados sugerem que houve melhor aproveitamento dos componentes dos meios pelas células e pelos embriões a partir do estádio de mórula. Nos sistemas de co-cultivo, devem ser consideradas a densidade^18,19, a temperatura, a umidade e a tensão de CO₂ da estufa, assim como o pH^4,42, a osmolaridade e a composição dos meios. No presente estudo, a osmolaridade dos meios foi mantida dentro dos limites considerados ideais, ou seja, CZB entre 274 e 295 mOsmol⁶, TCM199^a entre 270 e 300 mOsmol e B₂^b entre 275 e 305m Osmol, enquanto que o pH variou entre 6,8 e 7,4. As diferentes composições dos meios de cultivo devem ser consideradas quando se deseja sucesso no cultivo de embriões desde o estádio de zigoto até blastocisto. Os vários meios de cultivo empregados no desenvolvimento embrionário em sistemas in vitro tentam mimetizar o fluido do oviduto, porém, na maioria das vezes, alguns componentes dos meios como fosfato, glicose, glutamina, lactato e piruvato apresentam-se com concentrações diferentes em relação ao fluido do oviduto, podendo causar tanto inibição quanto o bloqueio do desenvolvimento embrionário. Por conta disso, foram realizadas inúmeras comparações entre os meios de cultivo ou entre as alterações dos componentes para otimizar a produção de embriões^{1,6,7,12,17,19,21,28,38}, objetivando encontrar o meio ideal para o desenvolvimento embrionário. Os meios condicionados em diferentes tipos celulares¹⁵, ou os meios com e sem fontes protéicas, evidenciaram a presença de duas moléculas que atuam nas primeiras clivagens dos embriões, as quais podem ou não ser oriundas das células do oviduto²⁴. Neste estudo, as células epiteliais BOEC empregadas para o co-cultivo de embriões de camundongos comportaram-se de maneira semelhante àquela observada por Thibodeaux et al.⁴¹. Porém, as células em suspensão não apresentaram sinais de degeneração nos cultivos considerados controle até o quinto dia⁷.

Deve-se lembrar que in vivo, no fluido do oviduto, são sintetizadas e secretadas proteínas pelas células do oviduto, além de diferentes substâncias provenientes do plasma sangüíneo^9,22. Durante as diferentes fases do ciclo estral, mudanças funcionais ocorrem tanto nas células ciliadas quanto nas células secretoras do oviduto, as quais são moduladas pelo estrógeno e pela progesterona nas diversas espécies animais^{29,30,31,45,46}. Partindo destas mudanças observadas durante o ciclo estral nas diferentes espécies, sugere-se que o oviduto não é espécie-específico quanto a sua capacidade em promover o desenvolvimento de embriões¹⁰. No presente estudo, a utilização de células epiteliais de ovidutos de bovinos (BOEC) no co-cultivo de zigotos de camundongos, demonstrou-se que não há especificidade, pois houve desenvolvimento de zigotos até o estádio de mórula, embora em taxa inferior ao controle e ao co-cultivo com MOEC (Tab. 1). Ao verificar o total de blastocistos expandidos e eclodidos, nota-se que as taxas de desenvolvimento embrionário de ambos os co-cultivos estiveram aquém do controle (Tab. 1), sugerindo que não foi o tipo de célula que impossibilitou o desenvolvimento, mas sim a falta de componentes, como a glicose, no meio. A ocorrência de bloqueio dos zigotos na fase de 2 células nos cultivos e nos co-cultivos com TCM199 e B₂ demonstra também que não foi o tipo célula, mas provavelmente o meio que causou o bloqueio (Tab. 1). Os resultados de desenvolvimento embrionário apresentados no co-cultivo de embriões de 2 células demonstraram que as células do oviduto não são espécie-específicas, conforme trabalhos encontrados em literatura^19,38,39,25. O mesmo não ocorreu com Sparks et al.³⁹, que sugeriram que as células de ovidutos de camundongas no TCM199 podem não metabolizar a glicose o suficiente para prover ambiente adequado ao desenvolvimento total do embrião. Portanto, são necessários novos estudos para verificar a eficiência das células epiteliais de oviduto e das células estabelecidas sobre o desenvolvimento embrionário nas diferentes espécies animais. O presente estudo permitiu concluir que o bloqueio na fase de duas células dos zigotos de camundongos cultivados e co-cultivados nos meios TCM199 e B₂ pode estar relacionado à presença da glicose. A interrupção de desenvolvimento a partir do estádio de mórula no CZB ocorreu, provavelmente, pela ausência de glicose. O desenvolvimento de embriões de camundongos em co-cultivo com células epiteliais de ovidutos não é espécie-específica, pois foi observada evolução dos zigotos e dos embriões de 2 células até o estádio de blastocisto no co-cultivo com BOEC. O desenvolvimento de zigotos de camundongos até blastocistos é possível em meio simples quimicamente definido como o CZB sem glicose.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos ao CNPq, pelo suporte financeiro para a realização do projeto, e ao Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, pelo uso das instalações.

SUMMARY

Mouse embryos were cultured and co-cultured in mouse (MOEC) and bovine (BOEC) oviduct epithelial cells suspension. Embryos were co-cultured from one cell and two-cell stage to blastocyst stage. Cell culture (MOEC and BOEC) was made at a 100 µl drop under oil. Embryos were recovered 24-26 hours in the case of zygotes and 46-48 hours in the case of 2 cell embryos after hCG injection. Total embryos were randomly split into 3 groups: control (cultured), MOEC and BOEC (co-cultured) with CZB, TCM199 and B₂ mediums. In CZB group, 44 zygotes (38.26%) from the control achieved blastocyst stage (expanded or hatched), being statistically different (p£0.05) from MOEC (1.89%) and BOEC (6.72%). Co-culture with zygotes in TCM199 and B₂ didn’t pass 2 cell block. Two cell embryos cultured in CZB achieved blastocyst stage at a rate of 43.80% for the control, 38.79% for MOEC and 29.60% for BOEC group. Statistical difference (p£0.05) appears from the control with BOEC groups. In TCM 199 medium, total of blastocyst were 48.15% for the control, 39.08% for MOEC and 48.49% for the BOEC groups, having no statistical difference among groups. This study allowed concluding that zygote block in TCM199 and B₂ medium may be related to the presence of glucose. And that mouse embryos development is not species-specific.

UNITERMS: Cells cultured; Epithelial cells; Embryos; Mice.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recebido para publicação: 17/06/1998

Aprovado para publicação: 24/05/1999

¹

Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP - SP

²

Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP - SP

^*

Center for Desease Control and Prevention.

^**

Delaware Division of Public Health.

^a

Gibco BRL Products e References Guide - U.S.A.

^b

Laboratoire C.C.D. - INRA - França.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Set 2000
• Data do Fascículo
  1999

Histórico

• Recebido
  17 Jun 1998
• Aceito
  24 Maio 1999