Resposta esteroidogênica induzida por hCG em garanhões jovens Mangalarga: testosterona e sulfato de estrona plasmáticos

hCG induced steroidogenic response in Mangalarga young stallions: plasma testosterone and estrone sulphate

Resumos

Avaliou-se a resposta esteroidogênica aguda da célula de Leydig em sete garanhões jovens da raça Mangalarga (2,6 a 4,5 anos), através de estimulação com gonadotrofina coriônica humana (hCG). Os animais foram tratados com 5.000 UI (hCG) Vetecor®, i.v., in bollus, às 8 horas. Amostras de plasma foram obtidas por venopuntura às 7 horas (basal), 4, 24, 48, 72 horas pós-estímulo (28 a 31 de agosto). Testosterona (T) e sulfato de estrona (E1SO4) foram dosados por radioimunoensaio (RIE) c.v. <= 5%. Os dados foram analisados pelos testes Friedman e Wilcoxon Matched-Pairs Signed Ranks (p <= 0,05). A magnitude da produção hormonal após o estímulo foi calculada pela Variação Percentual (delta %). Às 48 horas do teste, 57,1% dos animais (n = 4) apresentaram pico de T com um aumento de 5,7 vezes com relação ao basal. Embora em 57,1% (n = 4) tenha ocorrido a resposta máxima de E1SO4 às 4 horas, o valor máximo foi de 1,6 vez às 24 horas. A hCG pode ser empregada para estimular a resposta esteroidogênica da célula de Leydig e a dose de 5.000 UI é suficiente para estimular a esteroidogênese testicular. Em condições basais, as concentrações plasmáticas de estrógenos são superiores às dos andrógenos. Este protocolo pode ser usado para identificar problemas de origem endócrina em cavalos desta raça.

Célula de Leydig; Eqüinos; hCG; Testosterona

Leydig cell acute steroidogenic response, in seven young Mangalarga stallions (2.6 - 4.5 ys), was evaluated through human Corionic Gonadotrophin (hCG) stimulation. The animals were treated with 5,000 UI (hCG) Vetecor®, i.v., in bollus, at 8 a.m. Plasma samples were collected by venopuncture at 7 a.m. (basal), 4, 24, 48, and 72 hours after stimulation (from 28 to August 31). Testosterone (T) and estrone sulphate (E1SO4) was measured by radioimmunoassay (RIA), intra-assay variation <= 5%. Data were analysed by Friedman and Wilcoxon Matched-Pairs tests (p <= 0.05). The magnitude of hormonal production after stimulation was analysed by Percentual Variation (delta %). At 48 hours, 57.1% of the animals (n = 4) had maximal response (T) with values 5.7 greater than basal. And although 57.1% of them (n = 4) had maximal response (E1SO4) at 4 hours, the maximal value was 1.6 greater than basal at 24 hours. The hCG may be employed to stimulate the Leydig cell steroidogenic response and 5,000 UI is enough to stimulate testicular steroidogenesis. The estrogen basal concentrations are higher than testosterone basal concentrations. This protocol could be applied to identify fertility problems of endocrine origin in horses of this breed.

Leydig cell; Equine; hCG; Testosterone

Resposta esteroidogênica induzida por hCG em garanhões jovens Mangalarga: testosterona e sulfato de estrona plasmáticos

hCG induced steroidogenic response in Mangalarga young stallions: plasma testosterone and estrone sulphate

Samira Barbosa LIMA¹; Aurea WISCHRAL¹; Fernando FERREIRA¹: Ieda Therezinha do Nascimento VERRESCHI²

CORRESPONDÊNCIA PARA:

Ieda Therezinha do Nascimento Verreschi

Disciplina de Endocrinologia

Universidade Federal de São Paulo

Escola Paulista de Medicina

Rua Pedro de Toledo, 781 – 13º andar – Vila Clementino

04039-032 – São Paulo – SP

e-mail: [e-mail]

RESUMO

Avaliou-se a resposta esteroidogênica aguda da célula de Leydig em sete garanhões jovens da raça Mangalarga (2,6 a 4,5 anos), através de estimulação com gonadotrofina coriônica humana (hCG). Os animais foram tratados com 5.000 UI (hCG) Vetecor®, i.v., in bollus, às 8 horas. Amostras de plasma foram obtidas por venopuntura às 7 horas (basal), 4, 24, 48, 72 horas pós-estímulo (28 a 31 de agosto). Testosterona (T) e sulfato de estrona (E₁SO₄) foram dosados por radioimunoensaio (RIE) c.v. £ 5%. Os dados foram analisados pelos testes Friedman e Wilcoxon Matched-Pairs Signed Ranks (p £ 0,05). A magnitude da produção hormonal após o estímulo foi calculada pela Variação Percentual (D %). Às 48 horas do teste, 57,1% dos animais (n = 4) apresentaram pico de T com um aumento de 5,7 vezes com relação ao basal. Embora em 57,1% (n = 4) tenha ocorrido a resposta máxima de E₁SO₄ às 4 horas, o valor máximo foi de 1,6 vez às 24 horas. A hCG pode ser empregada para estimular a resposta esteroidogênica da célula de Leydig e a dose de 5.000 UI é suficiente para estimular a esteroidogênese testicular. Em condições basais, as concentrações plasmáticas de estrógenos são superiores às dos andrógenos. Este protocolo pode ser usado para identificar problemas de origem endócrina em cavalos desta raça.

UNITERMOS: Célula de Leydig; Eqüinos; hCG; Testosterona.

INTRODUÇÃO

Na gônada masculina dos mamíferos, o papel da célula de Leydig é a secreção de hormônios esteróides, que ajudam a regular a função do epitélio seminífero, do eixo hipotalâmico-hipofisário, e das glândulas sexuais acessórias A gonadotrofina coriônica humana (hCG) tem sido usada para avaliar os receptores para o hormônio luteinizante (LH), em células de Leydig de eqüinos com a vantagem de ser mais estável que o LH eqüino e ambas as gonadotrofinas estimulam a esteroidogenêse^9,10. Paradoxalmente, os testículos dos garanhões produzem grande quantidade de estrógenos^3,19 e baixa quantidade de testosterona¹⁶. Os estrógenos circulam na forma de sulfoconjugados¹³ protegidos da metabolização e permitindo uma reativação por hidrólise tecidual⁴. Os estrógenos podem servir como biomarcadores sensíveis para predizer modificações da fertilidade em garanhões^8,14,15. Alguns autores sugerem que a sua determinação no sangue, juntamente com a testosterona, pode auxiliar no diagnóstico da infertilidade¹¹. A estimulação da esteroidogênese pelas células de Leydig é um parâmetro amplamente utilizado no estudo das alterações reprodutivas ligadas à esfera hormonal em várias espécies. No presente experimento, uma única dose estimuladora de hCG foi administrada em cavalos jovens da raça Mangalarga com o objetivo de avaliar a responsividade da célula de Leydig neste grupo de animais. A resposta esteroidogênica ao hCG foi avaliada através da medida das concentrações plasmáticas de testosterona e sulfato de estrona.

MATERIAL E MÉTODO

Foram avaliados 7 garanhões Mangalarga jovens nascidos e criados na Fazenda Rio das Pedras em Jundiaí, com idades de 2,6 a 4,5 anos, mantidos a pasto de coast cross (Cynodon dactlylon) durante o dia e levados para a baia à noite. O teste foi realizado em 4 dias (de 28 a 31 de agosto de 1997), antes da "estação de monta". No dia 1 iniciou-se a colheita do sangue periférico por venopuntura da jugular externa às 7 horas. Aplicou-se uma única dose de 5.000 UI de hCG-Vetecor® por via intravenosa in bollus às 8 horas e a seguir foram feitas colheitas seqüenciais do sangue periférico às 4, 24, 48 e 72 horas pós-estímulo. Após centrifugação, o plasma foi aliquotado, identificado e congelado a -20ºC até as dosagens hormonais.

A testosterona (T) foi dosada por radioimunoensaio (RIE) convencional segundo a técnica descrita por Lox et al.¹² utilizando anticorpo produzido no Laboratório de Hormônios da Disciplina de Endocrinologia da UNIFESP/EPM¹⁷. O limite de detecção foi de 5 ng/dl, e o coeficiente de variação intra-ensaio (para valores baixos e elevados) foi menor que 5%, com recuperação entre 80% e 98% (média de 90%). O sulfato de estrona (E₁SO₄), dosado através de kit comercial (DSL-5400. Diagnostic Systems Laboratories, Inc.®), apresentou limite de detecção de 0,10 ng/ml e o coeficiente de variação intra-ensaio para os valores elevados e baixos foram menores que 5%. Os ensaios hormonais foram feitos em duplicatas e os valores foram expressos em ng/ml e convertidos para nmol/l¹⁸.

Sendo o objetivo deste trabalho a caracterização da produção hormonal pelas células de Leydig em resposta ao tratamento agudo com hCG, tomaram-se os valores hormonais basais (imediatamente antes da injeção) como controle das concentrações plasmáticas atingidas após a estimulação. Para todas as comparações feitas, o p < 0,05 foi considerado como indicador de diferenças significantes. O teste de Friedman ANOVA de duas vias foi utilizado para comparar os cinco tempos do teste (0, 4, 24, 48 e 72 horas) para os dois hormônios estudados, e as diferenças entre dois tempos foram analisadas através do teste para amostras dependentes, Wilcoxon Matched-Pairs Signed-Ranks. Este mesmo teste foi aplicado para verificar diferenças entre os valores basais e as respectivas respostas máximas (picos). Calculou-se a Variação Percentual (D %) ou incremento relativo entre os valores basais e os respectivos picos para evidenciar a magnitude da produção hormonal após o estímulo com hCG.

RESULTADOS

As concentrações de T variaram durante os tempos do teste e foram identificadas pelo teste de Friedman, para o grau de liberdade 4. Já para E₁SO₄ não houvediferença significante (Tab. 1 e Fig. 1). Em 4 (57,1%) animais o pico de testosterona ocorreu às 48 horas do teste e correspondeu a um aumento de 5,7 vezes com relação ao valor basal e incremento relativo (D %) de 318,6%. Nos demais, a resposta máxima ocorreu às 24 horas em 2 (28,6%) e às 72 horas em 1 (14,3%) (Fig. 2).

Tabela 1

Valores medianos das concentrações plasmáticas de testosterona e sulfato de estrona durante o teste de estímulo com hCG em garanhões jovens da raça mangalarga, São Paulo, 1997.

T = testosterona; E1SO4 = sulfato de estrona; * pico; 0 = basal; a, b,c = p £ 0,05 - Wilcoxon Matched–Pairs.

Figura 1

Figura 2

Em 4 (57,1%) animais houve elevação significante da produção de E₁SO₄ às 4 horas, porém o valor mediano máximo foi verificado às 24 horas do teste (Tab. 1), correspondendo a um aumento de 1,6 vez com relação ao valor basal, e um incremento relativo (D %) de 70,8%. Nos demais, a resposta máxima ocorreu às 24 horas em 1 (14,3%), às 72 horas em 2 (28,6%) (Fig. 2). Não foi possível verificar diferença significativa entre os tempos, mas os valores basal e de pico foram significantes (Wilcoxon Matched-Pairs) representados na Tab. 1.

DISCUSSÃO

Em potros pré-púberes, a principal modificação das células de Leydig é histofuncional passando do tipo fetal para o tipo pré-púbere, caracterizado bioquimicamente pela presença de receptores específicos para LH/hCG. A repercussão endócrina desta evolução funcional é a produção diferenciada dos esteróides sexuais. Nestas condições, ambos, andrógenos e estrógenos, são produzidos pelas células de Leydig, desempenhando funções específicas no desenvolvimento reprodutivo de garanhões. Empregou-se o teste de estímulo com hCG para caracterizar a resposta esteroidogênica da célula de Leydig de garanhões jovens e pôde-se verificar a predominância do estrógeno sulfato de estrona com relação ao andrógeno, testosterona. Fato semelhante também foi observado em animais adultos empregando o mesmo teste com o dobro da dose, ou seja, 10.000 UI de hCG^6,14.

O aumento relativo do andrógeno, que foi mais que três vezes superior ao do estrógeno, possivelmente refletiu a importância da produção da testosterona para a demanda reprodutiva, sendo concentrada em grande parte pelos túbulos seminíferos no próprio testículo^1,2. Este fato repercute na produção diária de 0,3 mg de T por minuto por um testículo, enquanto a produção do E₁SO₄ é de 5,6 mg por minuto por testículo¹⁶. Assim como observado por Zondek¹⁹; Bedrak; Samuels³ e Cox et al.⁷, machos da espécie eqüina produzem normalmente mais estrógenos do que andrógenos, os garanhões jovens estimulados com a hCG apresentaram estas mesmas características.

Os momentos de produção hormonal máxima durante a estimulação com hCG diferiram para andrógeno e estrógeno. Enquanto este último predominou nas primeiras 24 horas do teste, o andrógeno predominou após este tempo. O aspecto bifásico de produção desses hormônios já havia sido assinalado em garanhões férteis¹⁴ que também considerou as concentrações estimuladas da T como indicadoras de função da célula de Leydig. Os estrógenos têm sido relacionados à estimulação e manutenção da espermatogênese, e Claus et al.⁵ sugerem que o conteúdo estrogênico do ejaculado aumente a freqüência da contração uterina em suínos, associado ao aumento da concentração de prostaglandina F2a na veia eferente. A concentração de estrógenos na circulação periférica em suínos poderia facilitar o transporte dos espermatozóides e influenciar o momento da onda pré-ovulatória de LH e a ovulação. Por apresentarem receptores para LH/hCG, somente as células de Leydig são capazes de responder às gonadotrofinas luteinizantes e coriônica com a produção tanto de andrógenos como de estrógenos; portanto, as concentrações plasmáticas de andrógenos e estrógenos observadas após a estimulação com hCG nestes garanhões jovens refletem a responsividade esteroidogênica desta célula.

CONCLUSÃO

A gonadotrofina coriônica humana (hCG) pode ser empregada para estimular a resposta esteroidogênica da célula de Leydig e a dose de 5.000 UI é suficiente para estimular a esteroidogênese testicular. Em condições basais, as concentrações plasmáticas circulantes de estrógenos são superiores às dos andrógenos, podendo a observação da concentração destes hormônios após o teste de estímulo com hCG fornecer subsídios para o diagnóstico de infertilidade e subfertilidade de origem endócrina em eqüinos machos da raça Mangalarga.

AGRADECIMENTOS

Dr. Renato Campanarut Barnabe - Departamento de Reprodução Animal – VRA-FMVZ-USP

Ivonne Fianti Bianco – Laboratório de Hormônios – Disciplina de Endocrinologia / UNIFESP-EPM

Apoio: CNPq.

SUMMARY

Leydig cell acute steroidogenic response, in seven young Mangalarga stallions (2.6 – 4.5 ys), was evaluated through human Corionic Gonadotrophin (hCG) stimulation. The animals were treated with 5,000 UI (hCG) Vetecor®, i.v., in bollus, at 8 a.m. Plasma samples were collected by venopuncture at 7 a.m. (basal), 4, 24, 48, and 72 hours after stimulation (from 28 to August 31). Testosterone (T) and estrone sulphate (E₁SO₄) was measured by radioimmunoassay (RIA), intra-assay variation £ 5%. Data were analysed by Friedman and Wilcoxon Matched-Pairs tests (p £ 0.05). The magnitude of hormonal production after stimulation was analysed by Percentual Variation (D %). At 48 hours, 57.1% of the animals (n = 4) had maximal response (T) with values 5.7 greater than basal. And although 57.1% of them (n = 4) had maximal response (E₁SO₄) at 4 hours, the maximal value was 1.6 greater than basal at 24 hours. The hCG may be employed to stimulate the Leydig cell steroidogenic response and 5,000 UI is enough to stimulate testicular steroidogenesis. The estrogen basal concentrations are higher than testosterone basal concentrations. This protocol could be applied to identify fertility problems of endocrine origin in horses of this breed.

UNITERMS: Leydig cell; Equine; hCG; Testosterone.

Recebido para publicação: 21/05/1998

Aprovado para publicação: 03/09/1999

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1

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP - SP

² Disciplina de Endocrinologia da Escola Paulista de Medicina da UFSP - SP

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Abr 2001
• Data do Fascículo
  2000

Histórico

• Aceito
  03 Set 1999
• Recebido
  21 Maio 1998