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Avaliação das provas de soroaglutinação rápida, soroaglutinação lenta, antígeno acidificado e 2-mercaptoetanol no diagnóstico da brucelose bovina

Evaluation of rapid agglutination, tube agglutination, buffered plate antigen and 2-mercaptoethanol tests in the diagnosis of bovine brucellosis

Resumos

Avaliaram-se comparativamente as provas de soroaglutinação rápida, soroaglutinação em tubo, 2-mercaptoetanol e antígeno tamponado acidificado no diagnóstico da brucelose bovina. Todas as provas apresentaram boa concordância quando considerada a interpretação preconizada pelo Ministério da Agricultura do Brasil. As provas do antígeno tamponado acidificado e do 2-mercaptoetanol apresentaram alta concordância. Neste sentido, o presente estudo propõe o uso da prova do antígeno tamponado acidificado como triagem para o diagnóstico da brucelose bovina.

Brucelose animal; Bovinos; Diagnóstico; Serologia


Bovine serums were evaluated by the plate agglutination, tube agglutination, buffered plate antigen and 2-Mercaptoethanol tests for bovine brucellosis diagnosis. All presented a good concordance when considering the official Ministry of Agriculture interpretation. High concordance was verified for the buffered plate antigen and 2-Mercapthoetanol tests. This study suggests the use of the buffered plate antigen test as a screening test for bovine brucellosis diagnosis.

Brucellosis; Cattle; Diagnosis; Serology


Avaliação das provas de soroaglutinação rápida, soroaglutinação lenta, antígeno acidificado e 2-mercaptoetanol no diagnóstico da brucelose bovina

Evaluation of rapid agglutination, tube agglutination, buffered plate antigen and 2-mercaptoethanol tests in the diagnosis of bovine brucellosis

Jane MEGID1 1 Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública (DHVSP) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Botucatu – SP 2 Departamento de Bioestatística – Instituto de Biociências – UNESP, Botucatu – SP ; Márcio Garcia RIBEIRO1 1 Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública (DHVSP) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Botucatu – SP 2 Departamento de Bioestatística – Instituto de Biociências – UNESP, Botucatu – SP ; Gilberto MARCOS JÚNIOR1 1 Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública (DHVSP) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Botucatu – SP 2 Departamento de Bioestatística – Instituto de Biociências – UNESP, Botucatu – SP ; Adalberto José CROCCI2 1 Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública (DHVSP) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Botucatu – SP 2 Departamento de Bioestatística – Instituto de Biociências – UNESP, Botucatu – SP

CORRESPONDÊNCIA PARA:

Jane Megid

Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP

Caixa Postal 560

18618-000 – Botucatu – SP

e-mail: jane@fmvz.unesp.br

RESUMO

Avaliaram-se comparativamente as provas de soroaglutinação rápida, soroaglutinação em tubo, 2-mercaptoetanol e antígeno tamponado acidificado no diagnóstico da brucelose bovina. Todas as provas apresentaram boa concordância quando considerada a interpretação preconizada pelo Ministério da Agricultura do Brasil. As provas do antígeno tamponado acidificado e do 2-mercaptoetanol apresentaram alta concordância. Neste sentido, o presente estudo propõe o uso da prova do antígeno tamponado acidificado como triagem para o diagnóstico da brucelose bovina.

UNITERMOS: Brucelose animal; Bovinos; Diagnóstico; Serologia.

INTRODUÇÃO

A brucelose bovina é uma enfermidade causada pela Brucella abortus (B. abortus), apresentando-se em todo o mundo como problema sanitário e econômico16. Com exceção de um pequeno número de países, onde foi possível a erradicação, sua incidência é considerada alta, particularmente nos trópicos e em países com pouco investimento nas áreas de produção de leite e carne19.

A infecção com Brucella nos animais induz no hospedeiro uma resposta imune, tanto humoral como celular18, sendo que a magnitude e a duração desta resposta podem ser afetadas por fatores como: virulência da amostra, inóculo, idade, sexo, gestação, estado imune e espécie animal19.

Tanto no homem como nos animais, a infecção natural estimula o aparecimento simultâneo ou ligeiramente diferenciado de imunoglobulinas (Ig) das classes IgM e IgG. Durante a evolução da doença, ocorre o declínio e tendência de desaparecimento da IgM, enquanto a IgG se estabelece e persiste. O desaparecimento da IgG significa, geralmente, a eliminação da infecção7. Em bovinos classificados como positivos para brucelose, Beh5 encontrou que a maioria das Ig séricas pertencia à subclasse IgG1, com pequenas quantidades da classe IgM.

Na brucelose animal, assim como em outras infecções, o isolamento do microrganismo é o método diagnóstico mais seguro, mas, em virtude das dificuldades deste procedimento e da sua limitação para uso em grandes rebanhos, os métodos sorológicos são os mais utilizados3,5,7,18.

Deve ser levada em consideração no diagnóstico da enfermidade a presença de aglutininas séricas não específicas para B. abortus, que ocorrem em bovinos15. Estas aglutininas podem causar as denominadas reações cruzadas, mediadas por complexos normais entre antígeno e anticorpo, envolvendo principalmente imunoglobulinas da classe IgM, decorrentes de vacinação contra brucelose14 e outros agentes. Aceita-se, atualmente, que agentes como Yersinia enterolitica 0:9, Escherichia coli 0:116 e 0:157, Francisella tularensis, Salmonella urbana, Pseudomonas maltophilia, bem como outros gêneros possam causar reações cruzadas com B. abortus em testes sorológicos, dificultando o diagnóstico da enfermidade8,12.

Dentre os testes sorológicos empregados no diagnóstico da doença, destacam-se como os mais amplamente utilizados: Soroaglutinação Lenta em Tubo (SAT), Soroaglutinação Rápida em Placa (SAR), Antígeno Tamponado Acidificado (ATA), 2-Mercaptoetanol (2-ME), Rivanol, Fixação de Complemento (FC) e Enzyme Linked Immunosorbent Assay – ELISA19.

A SAT foi o teste sorológico mais comumente utilizado para o diagnóstico da brucelose bovina até aproximadamente 19679. Em anos recentes, com o melhor conhecimento das diferentes classes de Ig, surgiram dúvidas com relação a sua eficácia4. Possui como desvantagem a ocorrência de reações cruzadas com antígenos heteroespecíficos e com aglutininas pós-vacinais19, que podem decorrer da sua maior eficiência em detectar Ig da classe IgM, do que da subclasse IgG11.

O teste de SAR é uma adaptação da SAT, e se baseia na visualização da aglutinação em placa3. Mac Millan12 considera que a SAR possui como vantagem a simplicidade de execução e precocidade de resultados em relação à SAT, porém com menor sensibilidade, enquanto Alton et al.3 consideram-nas idênticas. Segundo Mac Millan12, a SAR e a SAT detectam as mesmas classes de Ig.

A prova do ATA (Rosa Bengala) consiste em uma soroaglutinação em placa, onde o antígeno é tamponado em pH baixo19. Esta acidificação do antígeno reduz a atividade da IgM12, tornando a prova seletiva para identificação da subclasse IgG17. O teste é utilizado como prova de triagem em rebanhos e possui uma grande sensibilidade em animais vacinados com a B19. Recomenda-se, porém, que os positivos nesta prova sejam retestados em provas complementares19.

O 2-ME é utilizado como teste complementar às provas de SAR e SAT3. A prova fundamenta-se na ação de certos compostos que contêm o radical tiol (2-ME), que degradam a configuração em pentâmero da IgM, determinando assim a perda da sua atividade aglutinante. Este processo torna o teste sensível às aglutinações estabelecidas pela classe IgG, que não sofre alteração na sua atividade na presença deste reagente7. Conforme Nicoletti13, a prova do 2-ME gera reações falso-positivas em menor quantidade que as provas de SAT, SAR e ATA (Rosa Bengala).

Considerando a resposta imune animal decorrente da infecção pela Brucella e das características das diferentes provas, pretendeu-se avaliar a concordância entre as provas de SAR, SAT, 2-ME e ATA no diagnóstico da brucelose bovina e sua aplicabilidade a campo e laboratorial.

MATERIAL E MÉTODO

Foram analisados soros sangüíneos procedentes de animais adultos, de diversas raças e de diferentes propriedades, com histórico vacinal desconhecido, encaminhados para diagnóstico à Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais - FMVZ - UNESP/Botucatu-SP.

Os soros foram submetidos às provas de SAR, SAT e 2-ME, de acordo com Alton et al.3, e ATA, com base em Mac Millan12. Para a avaliação estatística da concordância entre as provas quantitativas (SAR, SAT e 2-ME) e qualitativas (ATA) foram considerados positivos os títulos maiores ou iguais a 100 na SAR e SAT, de acordo com o preconizado pelo Ministério da Agricultura do Brasil para animais não vacinados6 e título 50 para a prova do 2-ME. A análise estatística foi baseada no estudo comparativo dos métodos, 2 a 2, quanto à igualdade das proporções de positivos detectados pelo teste de Mc Nemar20, e a concordância entre os métodos através do coeficiente Kappa2, considerando-se K = 0 ausência de concordância; K entre 0,6 e 0,8 boa concordância e K = 1 concordância perfeita.

RESULTADOS

As tabelas abaixo demonstram os resultados obtidos nos diferentes testes independentemente da interpretação de positividade adotada para cada prova.

Dos animais com títulos £ 50 na SAR, observou-se que 89,3% (732/820) resultaram negativos ao ATA. Por outro lado, dos soros que reagiram com títulos ³ 100 na SAR, 85,7% (144/168) resultaram positivos ao ATA. Em 1,3% (8/609) dos soropositivos no ATA verificaram-se resultados negativos na SAR (Tab. 1). Dos animais com títulos ³ 100 na SAR constataram-se 14,3% (24/168) de resultados negativos no ATA.

Tabela 1

Comparando-se a prova do ATA com a SAT, verificou-se que dos animais com títulos £ 25 na SAT, 3,3 % (13/388) apresentaram reações positivas no ATA. Dos animais com títulos 25 e 50 na SAT, constatou-se em 78,7% (111/141) dos soros ausência de reação na prova do ATA. Em animais com títulos 100 na SAT, 33,7% (27/80) dos soros resultaram negativos no ATA, enquanto dos soros que apresentaram título ³ 200 na SAT, 94,1% (161/171) resultaram positivos no ATA (Tab. 2).

Tabela 2

Quando comparados os resultados do ATA com o 2-ME, observaram-se 3,7% (16/431) de reações positivas no ATA e negativas no 2-ME. Dos soros que reagiram na diluição 1:25 no 2-ME, 59,0% (23/39) resultaram negativos no ATA. Dos animais com títulos iguais a 50 no 2-ME, 23,5% (12/51) apresentaram reações negativas no ATA, enquanto 92,1% dos soros com títulos ³ 50 no 2-ME também reagiram no ATA (Tab. 3).

Tabela 3

Quando comparados os resultados da SAT e SAR, verificou-se que dos animais com títulos ³ 25 na SAT, 20,4% (96/470) dos soros foram negativos na SAR. Destes animais, 46,9% (45/96), 35,4% (34/96) e 15,6% (15/96) apresentaram, respectivamente, títulos 25, 50 e ³ 100 (Tab. 4).

Tabela 4

Dos soros testados comparativamente na SAR e 2-ME, verificou-se que nos animais negativos ou que apresentaram títulos £ 25 no 2-ME, em 63,7% (426/669) não foram constatadas reações na SAR. Por outro lado, dos animais que apresentaram títulos ³ 25 na SAR, em 29,6% (179/605) dos soros, verificou-se ausência de reação no 2-ME, dos quais, 17,8% (108/605) e 4,1% (25/605) apresentaram, respectivamente, títulos 50 e ³ 100 na SAR. Dos soros que resultaram negativos na SAR, observaram-se 3,5% (16/456) de reações positivas no 2-ME, com títulos ³ 50 (Tab. 5).

Tabela 5

Na comparação entre a SAT e o 2-ME ,observou-se que dos soros com títulos ³ 25 na SAT, 26,8% (166/620) resultaram negativos no 2-ME, dos quais 25,5% (158/620) apresentaram títulos entre 25 e 100. Dos soros negativos no 2-ME, 5,0% (31/620) apresentaram título 100 na SAT. Os resultados negativos na SAT concordaram em 99,4% (469/472) com os resultados negativos ou com títulos £ 25 no 2-ME (Tab. 6).

Tabela 6

DISCUSSÃO

Embora a análise estatística tenha demonstrado bom coeficiente de concordância (coeficiente Kappa) entre os diferentes métodos, os menores valores destes coeficientes de concordância foram observados na comparação da SAR - considerada prova de triagem - com a SAT e provas complementares (ATA e 2-ME). O maior coeficiente de concordância foi observado entre as provas do ATA e 2-ME, seguido, respectivamente, pelo 2-ME e SAT, ATA e SAT, ATA e SAR.

As provas de SAT e SAR apresentaram bom percentual de resultados concordantes quando considerados os títulos £ 50, que resultaram negativos ao ATA e 2-ME. Quando avaliado, no entanto, o resultado dos animais com títulos iguais ou superiores a 100 na SAR e SAT - considerados positivos em ambas as provas para animais não vacinados6 - constatou-se que 14,3% e 33,7% dos animais, respectivamente, resultaram negativos no ATA. De maneira similar, dos animais com títulos ³ 100 na SAR e entre 25 e 100 na SAT, 4,1% e 26,8% dos soros resultaram negativos, respectivamente, no 2-ME. Estes resultados podem ser justificados em virtude de SAR e SAT reagirem indistintamente com Ig da classe IgM e IgG1, contrariamente ao ATA e 2-ME, que apresentam reações preferencialmente com IgG7, considerada a classe de imunoglobulina de maior especificidade no diagnóstico da doença. No presente estudo, elevado percentual de resultados concordantes entre SAR e SAT com o 2-ME e ATA foi observado somente em soros com títulos iguais ou superiores a 200 na SAR e SAT, sendo estes títulos considerados positivos independentemente do estado vacinal do animal6.

As provas do ATA e 2-ME apresentaram alto percentual de resultados concordantes, visto que 92,1% dos animais com títulos ³ 50 no 2-ME também reagiram no ATA. Por outro lado, 3,7% dos animais positivos no ATA não apresentaram reação no 2-ME, que poderia ser justificado com base na maior sensibilidade do ATA em relação ao 2-ME, conforme relatado por Huber e Nicoletti10. Estes autores referem a sensibilidade do ATA comparável à de FC na detecção de animais vacinados, infectados com amostra de campo, além da sensibilidade do ATA superior à FC na detecção de animais infectados não vacinados, porém com menor especificidade. Consideram, desta maneira, que, quando da ocorrência de reações positivas ao ATA e negativas à FC em animais não vacinados, fatores como rebanho, vaca e histórico vacinal deveriam ser avaliados. Entretanto, Casas Olascoaga7 relata rápida negatividade do ATA em animais vacinados entre 3 e 8 meses de idade, testados após 24 meses de idade. No Brasil, resultados semelhantes foram descritos por Ribeiro et al.17, que referem ausência de animais reagentes nas provas do ATA e 2-ME no 308.º dia após a vacinação de bezerras com a B19.

O uso do ATA como teste de triagem, no diagnóstico da brucelose bovina, vem sendo feito no controle da doença em países sul-americanos, como a Argentina. Adicionalmente, o ATA também tem sido empregado como prova de triagem para brucelose humana, comparativamente à FC, com resultados promissores, em virtude de sua alta sensibilidade, especificidade, praticidade e baixo custo11. Casas Olascoaga7 relata que o emprego do ATA como teste de triagem em campanhas de controle e erradicação da brucelose permite reduzir o número de provas diagnósticas, possibilita a detecção de casos crônicos, a eliminação de suspeitos, além da boa correlação com a fixação de complemento.

Os resultados obtidos no presente estudo caracterizaram bom coeficiente de concordância entre os testes utilizados rotineiramente no diagnóstico da brucelose bovina, desde que respeitados os critérios de positividade definidos pelo Ministério da Agricultura do Brasil para animais vacinados e não vacinados6. Demonstram claramente, no entanto, a ocorrência de reações falso-positivas e falso-negativas quando do uso da prova de soroaglutinação rápida como triagem, possibilitando, por um lado, a permanência de animais positivos no rebanho, e, por outro, a eliminação de animais falso-positivos quando utilizada isoladamente. O uso desta prova como triagem obriga o envio das amostras suspeitas e positivas para o reteste em provas complementares, por laboratórios especializados, aspecto muitas vezes difícil em virtude da distância dos laboratórios e do encaminhamento das amostras, retardando e encarecendo sobremaneira o diagnóstico.

A prova do 2-ME, avaliada comparativamente ao ATA, demonstrou o maior coeficiente de concordância e se caracterizou como prova complementar específica, o que sugere a sua utilização em substituição à fixação de complemento nos laboratórios que não realizam esta última prova rotineiramente, por dificuldades técnicas e materiais.

A utilização do ATA, concordante com Casas Olascoaga7, elimina reações suspeitas e falso-positivas observadas nas provas de soroaglutinação rápida e em tubo, além de permitir a realização do teste a campo, possibilitando aos veterinários um diagnóstico mais acurado, reduzindo a necessidade de envio de um grande número de amostras para laboratórios especializados e o reteste de animais suspeitos.

Os resultados obtidos sugerem o uso do ATA como teste de triagem em substituição à SAR em virtude de sua alta sensibilidade, especificidade, praticidade e baixo custo, o que no contexto global resulta em menor custo diagnóstico, aliado a maior eficácia diagnóstica, possibilitando estratégias de controle da brucelose em menor espaço de tempo.

SUMMARY

Bovine serums were evaluated by the plate agglutination, tube agglutination, buffered plate antigen and 2-Mercaptoethanol tests for bovine brucellosis diagnosis. All presented a good concordance when considering the official Ministry of Agriculture interpretation. High concordance was verified for the buffered plate antigen and 2-Mercapthoetanol tests. This study suggests the use of the buffered plate antigen test as a screening test for bovine brucellosis diagnosis.

UNITERMS: Brucellosis; Cattle; Diagnosis; Serology.

Recebido para publicação: 19/11/1999

Aprovado para publicação: 10/08/2000

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  • 1
    Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública (DHVSP) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Botucatu – SP
    2
    Departamento de Bioestatística – Instituto de Biociências – UNESP, Botucatu – SP
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      20 Jun 2001
    • Data do Fascículo
      2000

    Histórico

    • Recebido
      19 Nov 1999
    • Aceito
      10 Ago 2000
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