Níveis de IgG séricos em bezerros experimentalmente infectados pelo Haemonchus placei

Serum IgG level in calves experimentally infected with Haemonchus placei

Níveis de IgG séricos em bezerros experimentalmente infectados pelo Haemonchus placei

Serum IgG level in calves experimentally infected with Haemonchus placei

Sandra Mayumi Nishi; Leonardo José Richtzenhain; Solange Maria Gennari

Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, São Paulo - SP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Dois experimentos foram realizados para se conhecer a dinâmica dos anticorpos séricos (IgG) em bezerros após infecção com Haemonchus placei. No Experimento 1 estudou-se os níveis de IgG ao longo da primeira e segunda infecção. No Experimento 2 a influência de diferentes níveis protéicos da dieta e a resposta à infecção, medida através dos níveis de IgG séricos, foi observada em bezerros imunizados e não imunizados, através de infecções sucessivas e experimentalmente desafiados com L₃ de H. placei. Observou-se que os bezerros infectados desenvolveram resistência a reinfecções, com acentuado decréscimo nos valores de ovos por grama de fezes (OPG) na segunda infecção. Entretanto, nesse mesmo período, os níveis de IgG séricos mantiveram-se elevados, independentes do decréscimo do OPG. Observou-se também que bezerros submetidos a dieta protéica adequada apresentaram maior produção de IgG sérico, sugerindo uma melhor resposta às infecções quando comparados aos submetidos a dietas com níveis protéicos mais baixos.

Palavras-chave:Haemonchus. Bovinos. ELISA.

SUMMARY

Two experiments were conducted to determine the serum antibody (IgG) dynamic in calves infected with Haemonchus placei. At Experiment 1, the IgG level during the first and second experimental infection were measured and at Experiment 2, the influence of dietary protein and immunization on IgG levels. The calves were immunized using successive H. placei infection truncated by the use of anthelmintic and challenged with 100,000 L_3. The infected calves developed a high level of protection, with a significant reduction on fecal egg counts (EPG) at the second infection. However, at the same period, the IgG values continue to presented high levels, independent of the EPG decrease. It was also observed that calves submitted to an adequate protein diet presented a higher IgG level, suggesting an influence on immune response to the infection when compared to the low protein diet calves.

Keywords:Haemonchus. Bovine. ELISA.

INTRODUÇÃO

Haemonchus placei é um nematódeo de elevada patogenicidade que acomete os bovinos. Juntamente com o gênero Cooperia spp. o H. placei é um dos parasitos de maior ocorrência no Brasil. Produz altas taxas de morbidade e consequentemente importantes perdas econômicas^{10, 11, 13}. É hematófago, produzindo lesões na mucosa do abomaso que podem causar perdas de sangue e plasma para a luz intestinal. Infecções maciças podem levar animais jovens a óbito por hipoproteinemia e anemia aguda.

O parasitismo gastrintestinal em ruminantes está freqüentemente associado à alta densidade animal e a sistemas intensivos de manejo. Entretanto, nos ruminantes, o estado nutricional e particularmente a disponibilidade de proteínas e minerais é um fator importante na otimização da produtividade animal, interferindo na patogenia e nos mecanismos de resposta imune dos hospedeiros às infecções por nematódeos gastrintestinais^{1, 2, 8}.

O presente trabalho teve por objetivo conhecer a dinâmica dos anticorpos séricos (IgG) em bezerros na primeira infecção e em infecção sucessiva pelo H. placei e a influência do valor proteico da dieta sob os níveis de IgG, em bezerros infectados por esse nematódeo. Para tanto dois experimentos foram realizados:

Experimento 1 - Estudo dos níveis de IgG ao longo da primeira e segunda infecção. Experimento 2 - Influência de diferentes níveis protéicos da dieta e a resposta à infecção, medida pelos níveis de IgG séricos, em bezerros imunizados e não imunizados, através de infecções sucessivas, e experimentalmente desafiados com larvas infectantes (L3) de H. placei.

MATERIAL E MÉTODO

Obtenção de larvas e adultos de H. placei

Bezerros criados livres de parasitos foram infectados com L3 oriundas de culturas puras de H. placei e utilizados como doadores de L₃ e vermes adultos. As larvas foram recuperadas a partir de culturas de fezes e utilizadas até 10 dias após a recuperação. Os adultos foram obtidos do abomaso dos doadores após a necrópsia, com a remoção do conteúdo e colheita manual, como descrito em Gennari et al.⁸.

Animais experimentais

Foram utilizados bezerros machos da raça Holandesa Preta e Branca, com idade aproximada de seis meses, criados desde o nascimento em baias coletivas, livres de parasitas e alimentados com ração comercial, feno de capim Coast Cross (Cynodon dactylon) e água ad libitum.

Delineamento experimental

Experimento I

Quinze animais foram divididos em dois grupos. No início do experimento (dia zero) dez bezerros receberam uma solução contendo 100.000 L₃ de H. placei por via oral e cinco foram mantidos como controles. Semanalmente foi realizada a contagem do número de ovos de nematódeos por grama de fezes (OPG) utilizando o método de McMaster modificado¹⁵. Quando 75% dos animais infectados atingiram valores de OPG inferiores a 100, os bezerros foram tratados com oxfendazole na dose de 2,5mg por kg de peso vivo (Systamex, Mallinckrodt Veterinária Ltda., Brasil) e quatro dias depois, novamente infectados com 100.000L3 de H. placei. As contagens de OPG continuaram a ser realizadas semanalmente até o final do experimento (décima semana após a reinfecção).

Toda semana, amostras de sangue foram colhidas por meio de venopunção da veia jugular, utilizando tubos tipo Vacutainer de 5 ml. Os soros foram mantidos congelados a ^–20^oC até a realização do ensaio imunoenzimático (ELISA).

Experimento II

Dezesseis bezerros foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de quatro animais cada. Dois grupos receberam dieta hipoproteica (BP), 213 g de proteína bruta (PB) por animal por dia, e dois grupos receberam dieta com níveis adequados de proteína (AP), com 469 g PB/animal/dia. Cinco semanas após o início das dietas, um dos grupos BP e um dos grupos AP foram oralmente infectados com 50.000 L₃ de H. placei (BP-I e AP-I). Os demais grupos foram mantidos como controles não infectados (BP-C e AP-C). No 25º dia pós-infecção (DPI), antes do início da patência, todos os animais infectados foram vermifugados com oxfendazole (2,5mg/kg de peso vivo - Systamex, Mallinckrodt Veterinária Ltda., Brasil). Quatro dias depois, os mesmos bezerros foram reinfectados com 50.000 L₃ e novamente vermifugados no 25º DPI. Após intervalo de quatro dias, todos os quatro grupos experimentais foram desafiados com 100.000 L₃ de H. placei e mantidos sob observação durante cinco semanas.

Amostras de fezes e de sangue dos animais foram colhidas durante todo o experimento, em intervalos semanais. Os soros foram mantidos a - 20^oC até a realização do ELISA e das fezes obteve-se os valores de OPG.

ELISA indireto

Como antígeno utilizou-se extrato antigênico bruto de adultos de H. placei, segundo Gennari e Tait⁹. A concentração protéica do extrato solúvel foi medida pelo método do ácido bicinconínico (BCA Protein Kit, Pierce). Microplacas de poliestireno (Nunc, Dinamarca) foram sensibilizadas com 10 mg/ml do antígeno solúvel de H. placei diluído em tampão carbonato-bicarbonato 0,05M pH 9,6 e incubadas em câmara úmida a 4°C durante uma noite. Utilizou-se soro eqüino a 4% e Tween 20 a 0,05% em salina tamponada (PBS 0,01M fosfato 0,15M NaCl pH 7,2) como solução bloqueadora. As amostras de soro foram diluídas a 1:50 e incubadas durante 45 minutos a 37°C. A seguir, utilizou-se IgG de coelho anti-IgG bovino conjugado à peroxidase (Sigma, EUA) diluído a 1:1000 em PBS. Entre cada uma dessas etapas foram realizadas três lavagens das microplacas com PBS + Tween 20. Cinco minutos após a adição do substrato cromógeno (ortofenilenodiamina em tampão citrato-fostato pH 5,0 e H₂O₂) a reação enzimática foi interrompida com HCl 1N. A leitura da reação foi realizada por espectrofotometria com filtro 492 nm em leitor de microplacas (Multiskan-plus, Labsystems, Finlândia). Cada amostra de soro foi ensaiada em duplicata. Os valores médios das leituras em densidade óptica (D.O.) foram corrigidos em relação a uma amostra padrão positiva e negativa, com a obtenção do valor A/P (amostra/positivos), segundo a equação:

A/P = D.O. da amostra - D.O. controle negativo

D.O. controle positivo - D.O. controle negativo onde,

D.O. da amostra = valor médio das densidades ópticas das duplicatas da amostra,

D.O. controle negativo = valor médio das densidades ópticas das duplicatas do soro controle negativo e

D.O. controle positivo = valor médio das densidades ópticas das duplicatas do soro controle positivo.

Análise Estatística

Os resultados foram analisados através de Análise de Variância e as diferenças entre os grupos nas diferentes semanas experimentais foram medidas pelo teste de Tukey. Valores de p<0,05 foram considerados significantes.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Fig. 1 ilustra os níveis de IgG séricos anti-H. placei detectados pelo ELISA e os valores de OPG em bezerros infectados pelo H. placei e controles, durante duas infecções consecutivas (Experimento 1). O período de patência iniciou-se na quarta semana pós-infecção com valores máximos de OPG observados na oitava semana e decaindo nas semanas seguintes. Dineen et al.⁷, em infecções por Haemonchus contortus em ovinos, também encontraram o pico de OPG entre a terceira e a quarta semana de patência.

Na reinfecção os bezerros também iniciaram a eliminação de ovos entre a quarta e quinta semana após a infecção (20ª semana experimental), mas com valores bastante reduzidos quando comparados aos valores de OPG da primeira infecção (p<0,05), evidenciando o aparecimento da imunidade, resultados estes similares aos encontrados por Schallig et al. ¹⁴, em ovinos.

Ao acompanhar a carga parasitária de ovinos observou-se que a fixação e o desenvolvimento de uma grande quantidade de vermes ocorre na primeira infecção por H. contortus. Nas infecções subsequentes, cada vez uma menor quantidade de larvas infectantes consegue se estabelecer e chegar à fase adulta e, desses, as fêmeas apresentam-se menores e possuem menos ovos ^{4, 5}. Não há dados das variações de OPG em infecções subsequentes por H. placei em bovinos, mas parece haver semelhanças com as observações feitas na espécie ovina.

A produção de IgG foi detectada pelo ELISA entre a terceira e quarta semana após a primeira infecção. Os níveis de IgG inicialmente apresentaram-se baixos e foram se elevando até atingir um pico na sétima semana, se mantendo com pequenas oscilações até o final do experimento. Os níveis de IgG no grupo infectado foram superiores aos do grupo controle (p<0,05) durante todo o experimento.

No Experimento II, tanto os bezerros imunizados (através de infecções truncadas pelo uso de anti-helmínticos) quanto os controles, apresentaram, durante o período de imunização, níveis semelhantes de IgG séricos (p>0,05), independente do esquema nutricional (Fig. 2). Já após o desafio, os animais que receberam dieta com teores protéicos mais elevados (AP) apresentaram níveis de IgG mais altos independente de terem sido imunizados previamente ou não. Entre os animais infectados (Fig. 2-A) os bezerros do grupo AP apresentaram níveis mais altos de IgG nas semanas de 9 a 12 (p<0,05) e nos controles (Fig. 2-B) a diferença entre os AP e BP foi observada da semana 10 à 13 (p<0,05), também com os níveis de IgG maiores nos bezerros AP.

O valor médio mínimo e máximo de OPG na última semana experimental, foi de 750 e 450 OPG, respectivamente para os grupos BP-I e AP-I (imunizados) e de 875 e 500 OPG, respectivamente para os bezerros BP-C e AP-C (não imunizados). Apesar dos valores de OPG obtidos nos grupos com dieta hipoproteica terem sido superiores, esta diferença não foi significante (p>0,05). Adams (1983)³ observou o aparecimento de resistência em ovinos pós-infecção com H. contortus, com os valores de OPG bastante baixos e inferiores aos observados no presente trabalho com bovinos.

No entanto, independente dos valores de OPG, observou-se que os bezerros com uma dieta protéica a níveis adequados, conseguem superar melhor os efeitos do parasitismo, quando comparados a bezerros com dieta deficiente e submetidos ao mesmo desafio, resultados estes apresentados em Gennari et al.⁸. Observou-se que os valores de hematócrito, albumina, proteína sérica e sinais clínicos da hemoncose apresentaram-se menos alterados nos animais com dietas protéicas adequadas. Observação semelhante pode ser constatada em relação à resposta humoral, com os valores de IgG superiores nos animais dos grupos AP (p<0,05).

Devido ao pequeno tempo de observação dos animais após o início da patência, não foi possível analisar a possível correlação entre os valores de OPG e os níveis séricos de IgG, porém, sabe-se que a resposta humoral não é o único fator envolvido na resposta imune de ruminantes contra as infecções por helmintos, nos quais a resposta celular tem especial importância¹² .

A presença de anticorpos tipo IgG em infecções por nematóides, não possui validade para diagnóstico, uma vez que é comum reação cruzada entre os tricostrongilídeos⁶, mas permite a obtenção de informações sobre a dinâmica da resposta imune em condições experimentais.

CONCLUSÕES

Os bezerros infectados com H. placei desenvolvem um bom grau de resistência a reinfecções, uma vez que a contagem de ovos nas fezes é acentuadamente maior na primeira infecção.

O contato prévio com o H. placei não refletiu nos níveis de IgG sérico após o desafio.

Bezerros submetidos a dieta protéica adequada apresentam maior produção de IgG sérico que os submetidos a dietas com níveis protéicos mais baixos.

AGRADECIMENTOS

À FAPESP pelo financiamento do projeto e ao CNPq pela bolsa de aperfeiçoamento a S.M. Nishi.

Recebido para publicação: 19/09/2001

Aprovado para publicação: 27/02/2002

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• ²
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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Jun 2003
• Data do Fascículo
  2002

Histórico

• Recebido
  19 Set 2001
• Aceito
  27 Fev 2002