Suscetibilidade in vitro a antibióticos de cepas de Staphylococcus spp e Micrococcus spp isoladas a partir de mucosa oral de macacos-pregos (Cebus apella) mantidos em cativeiro

In vitro susceptibility to antibiotics in Staphylococcus spp e Micrococcus spp strains isolated from oral mucosae of captive capuchin monkeys (Cebus apella)

Suscetibilidade in vitro a antibióticos de cepas de Staphylococcus spp e Micrococcus spp isoladas a partir de mucosa oral de macacos-pregos (Cebus apella) mantidos em cativeiro

In vitro susceptibility to antibiotics in Staphylococcus spp e Micrococcus spp strains isolated from oral mucosae of captive capuchin monkeys (Cebus apella)

Daniel Aspis^I; Lúcia Baldassi^II; Pedro Manuel Leal Germano^III; José Daniel Luzes Fedullo^IV; Estevão de Camargo Passos^V; Margareth de Andrade Gonçalves^VI

^IPrefeitura Municipal de Barueri, Barueri - SP

^IIInstituto Biológico, São Paulo - SP

^IIIFaculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo, São Paulo - SP

^IVFundação Parque Zoológico de São Paulo, São Paulo - SP

^VInstituto Pasteur, São Paulo - SP

^VISecretaria da Educação do Governo do Estado de São Paulo, São Paulo - SP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

O estudo foi realizado com 29 macacos-pregos (Cebus apella). Foram colhidas 50 amostras de suabe da mucosa oral, junto à transição muco-gengival maxilar, com auxílio de zaragatoas esterilizadas, embebidas em caldo Brain Heart Infusion (BHI). Todos os animais foram submetidos a exame clínico para avaliação periodontal. As amostras obtidas foram cultivadas em meios apropriados: caldo simples, caldo BHI, e ágar sangue para o isolamento de cocos Gram-positivos aeróbios da família Micrococcaceae. Para sua classificação utilizou-se as provas de catalase, Staphy-test (teste rápido para caracterização de Staphylococcus aureus) e sensibilidade à bacitracina. Foram identificados 73,1% de Staphylococcus spp; 15,4% de Staphylococcus aureus; e 11,5% Micrococcus spp. As cepas isoladas foram testadas em relação à sua suscetibilidade a antibióticos pela técnica de difusão em ágar. Verificou-se para as cepas de Staphylococcus spp, 94,7% de sensibilidade a cefalotina e resistência de 89,5% à penicilina, 97,4% à oxacilina, 55,3% à tetraciclina, 57,9% à clindamicina e 63,2% à amoxicilina. Os dados obtidos demonstraram que a cefalotina foi o antibiótico para o qual as amsotras de Staphylococcus spp estudadas apresentaram, in vitro, maior grau de sensibilidade.

Palavras-chave: Suabe oral. Staphylococcus spp. Micrococcus spp. Antibióticos. Suscetibilidade in vitro. Macacos-pregos (Cebus apella).

ABSTRACT

Twenty-nine capuchin monkeys (Cebus apella) were used in this study. Fifty samples of oral mucous membrane were collected in area next to their muco-gingival-maxilar transition using sterilized swabs soaked in Brain Heart Infusion (BHI). All animals were clinically examined for periodontal evaluation. The samples were cultivated in appropriate media, namely: simple broth, BHI broth and, blood agar in order to get aerobic Gram positive cocos, from the Micrococcaceae family, isolated. Catalase test, Staphy-test (a quick-test for Staphylococcus aureus characterization) and bactracin-sensitivity test were the tools employed for their classification. Data were follows: 73.1% of them were Staphylococcus spp; 15.4% Staphylococcus aureus; and, 11.5% Micrococcus spp. The isolated were strains tested for their in vitro susceptible to antibiotics by the agar diffusion technique. Concerning the Staphylococcus spp strains, 94.7% were susceptibility to cephalotin; however, 89.5% of them were resistant to penicillin; 97.4% to oxacilin; 55.3% to tetracicline; 57.9% to clindamicine; and 63.2% to amoxiciline. Staphylococcus spp strains studied presented the highest in vitro sensitivity degree to cephalotin..

Key-words: Oral swabs. Staphylococcus spp. Micrococcus spp. Antibiotics. in vitro susceptibility. Capuchin monkeys (Cebus apella).

Introdução

Em saúde pública, a preocupação com a criação de primatas não humanos não está ligada somente ao risco de transmissão de doenças contagiosas aos seres humanos, de caráter zoonótico ou não, mas, sobretudo por lesões cutâneas traumáticas ou infecciosas causadas por mordeduras. Por se tratar de animais considerados inteligentes, de reflexos rápidos e providos de grande força física, são capazes de agredir com severidade seus tratadores, infligindo-lhes ferimentos graves¹, os quais parecem ser mais sérios do que os provocados por outros animais exóticos.^2,3

As mordeduras provocam simultaneamente lesões por compressão dos tecidos, determinando escarificação da zona atingida; e, por perfuração, dando origem a necroses puntiformes, correspondentes à penetração profunda dos dentes caninos do animal.⁴

A cavidade bucal e os dentes dos macacos, de um modo geral, constituem meio hiperséptico, associando floras saprófitas e patogênicas extremamente polimorfas, além de enzimas e produtos de degradação biológica, muitas vezes tóxicos⁴. Estes microrganismos são conseqüência dos hábitos alimentares dos animais, que incluem desde frutas variadas até pequenos roedores e insetos ou ao costume de levar constantemente as mãos contaminadas à boca, mesmo com matéria fecal. Por outro lado, os microrganismos podem, também, fazer parte da própria flora microbiana dos animais, tal como relatado por Kloos et al.⁵, que isolaram a partir da superfície cutânea de primatas não humanos: Staphylococcus spp, Staphylococcus aureus de narinas e abdômen e Staphylococcus sciuri ocasionalmente das narinas. As espécies de Micrococcus spp foram encontradas nos macacos de cheiro (Saimiri sciureus), sendo Micrococcus varians a mais isolada.

Dada a gravidade destes acidentes nos seres humanos e sua freqüência cada vez maior nos centros urbanos, inúmeras pesquisas têm sido realizadas com a finalidade de avaliar a flora microbiana de primatas não humanos. Assim, Rayan et al.⁶ isolaram um total de 82 cepas de bactérias da cavidade bucal de 17 macacos Rhesus (Macaca mulata), destacando-se entre outras Streptococcus spp a-hemolíticos (19,5%); Streptococcus spp g-hemolíticos (1,2%); Staphylococcus aureus (3,8 %) e Staphylococcus spp b-hemolíticos (1,2%); Pseudomonas spp (2,4%); e, Eschericha coli (1,2%).

Krygier et al.⁷ isolaram de placa bacteriana de superfícies dentárias limpas e gengiva saudável de macaco Macaca speciosa, cocos e bastonetes Gram-positivos. Contudo, a medida que se evidenciava gengivite, provocada pela deposição de placas bacterianas, era possível isolar, também, fusobactérias, espiroquetas e espirilas.

Em pesquisa realizada com orangotangos, Pongo pygmaeus, Stoller et al.⁸ identificaram flora poli-microbiótica a partir de culturas bacterianas anaeróbias de placa sub-gengival, provenientes tanto de regiões comprometidas, quanto sem alterações.

Com base nos aspectos mencionados, o estudo da flora bacteriana dos primatas não humanos, em particular a da cavidade bucal, bem como a verificação de sua sensibilidade a antibióticos, é importante em saúde pública. Assim, o objetivo deste trabalho é verificar a sensibilidade, in vitro, a antibióticos, de cepas de Staphylococcus spp e Micrococcus spp, isoladas de mucosa oral de macacos-pregos (Cebus apella) mantidos em cativeiro.

Materiais e Métodos

Foi utilizado um grupo de 29 macacos-pregos (Cebus apella) adultos mantidos na Fundação Parque Zoológico de São Paulo. Os animais gozavam de boas condições de saúde e negativos ao teste tuberculínico intradérmico, não apresentando histórico recente de uso de antibióticos. Os animais estavam identificados através de números tatuados no lado interno da coxa, seus pesos variavam de 1,2-5,0 kg. Eram alimentados duas vezes ao dia com frutas, vegetais, ovos cozidos, pescoço de frango e ração para primatas formulada pelo zoológico e água ad libitum. Todos os animais foram mantidos em três recintos fechados com área de 3,0 x 2,0 x 4,0 metros com barras de ferro, cerca de arame e chão cimentado durante os 12 meses do experimento.

Cada animal foi anestesiado com 4,4 mg/kg tiletamina e zolazepam (Zoletil 50, Virbac do Brasil Ind. e Com. Ltda., São Paulo, Brasil, 04696-000) por via intra-muscular para facilitar o teste tuberculínico intradérmico, cuidados veterinários e colheita das amostras.

Foram colhidas, de cada um dos animais do experimento, amostras da mucosa oral, junto à transição muco-gengival maxilar, com o auxílio de zaragatoas esterilizadas, embebidas em caldo Brain Heart Infusion (BHI) mantidas em tubos de tampa rosqueada. Foram realizadas sete colheitas com freqüência bi-mensal.

O número de animais submetidos às colheitas foi: 8 na primeira, 8 na segunda, 8 na terceira, 8 na quarta, 7 na quinta, 5 na sexta e 6 na sétima, totalizando 50 amostras colhidas. A apresentação dos animais para colheita das amostras foi praticada de modo aleatório.

As amostras foram submetidas, de imediato, aos procedimentos técnicos para cultura e isolamento de cocos Gram-positivos aeróbios e foram semeadas em caldo simples, ágar contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro, e incubadas a 37ºC por 24 horas. As diferentes colônias obtidas foram submetidas à coloração de Gram e tiveram suas morfologias e atividade hemolítica anotadas. Aquelas que se caracterizaram como cocos Gram-positivos foram isoladas e mantidas em caldo BHI, para identificação bioquímica.

As diferentes colônias foram caracterizadas quanto à produção e tipo de hemólise (não hemolíticas, a e b-hemolíticas).

As cepas de cocos Gram-positivos com reação positiva à prova de catalase e negativas à prova de bacitracina (ausência de halo de inibição) foram submetidas ao Staphy-Test (Probac do Brasil Produtos Bacteriológicos Ltda., São Paulo, Brasil, 05509-005) teste em lâmina, para identificação de Staphylococcus aureus.

Após a identificação, as cepas de Staphylococcus spp, Staphylococcus aureus e Micrococcus spp foram submetidas ao teste de suscetibilidade aos seguintes antibióticos: clindamicina 2 mg, penicilina 10 U, oxacilina 1 mg, tetraciclina 30 mg, amoxicilina 10 mg e cefalotina 30 mg, conforme técnica proposta por Bauer et al.⁹, e modificações propostas pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards.¹⁰

Resultados

Na tabela 1 observam-se o total de cepas isoladas e respectivas freqüências, foram isoladas 52 cepas de cocos Gram-positivos aeróbios em 27/29 (93,1%) animais, Staphylococcus spp ocorreu em 23/29 (79,3%), Staphylococcus aureus em 7/29 (24,1%) e Micrococcus spp em 6/29 (20,7%). A freqüência das cepas isoladas foi de 73,1% (38/52) para Staphylococcus spp, 15,4% (8/52) para Staphylococcus aureus e 11,5% (6/52) para Micrococcus spp.

Todas as cepas se mostraram positivas à prova da catalase, as quais foram submetidas ao Staphy-test e à prova da bacitracina. Na tabela 2 estão representados a freqüência da atividade hemolítica das cepas de Staphylococcus spp isoladas, 68,4% (26/38) não hemolíticas, 23,7% (9/38) a-hemolíticas e 7,9% (3/38) b-hemolíticas.

Na tabela 3 estão registrados os microrganismos isolados dos macacos-pregos de número 21 a 29, submetidos a mais de uma colheita. Foram isoladas cepas de Staphylococcus spp nos animais n^ºs 21, 22, 24, 25, 26, 27 e 28; cepas de Staphylococcus aureus nos animais n^ºs 22, 23, 25, 26 e 27; e cepas de Micrococcus nos animais n^ºs 23, 25 e 29. Saliente-se que o isolamento bacteriano nos animais n^ºs 22, 28 e 29 ocorreu em uma única oportunidade, nos animais n^ºs 21, 23, 24, 25, 26 e 27 na maioria das ocasiões, sendo que apenas o nº 25 apresentou isolamento para os três microrganismos.

A tabela 4 mostra a suscetibilidade in vitro aos antibióticos das cepas isoladas. Em relação à sensibilidade e resistência frente aos antibióticos testados, a cefalotina apresentou o maior poder de inibição do crescimento bacteriano das cepas isoladas, uma vez que foi observado sensibilidade em 94,7% (36/38) das cepas de Staphylococcus spp, 87,5% (7/8) das cepas de Staphylococcus aureus e 66,7% (4/6) das cepas de Micrococcus spp; enquanto que a oxacilina apresentou o resultado menos satisfatório, pois não inibiu o crescimento bacteriano em 97,4% (37/38) das cepas de Staphylococcus spp, 62,5% (5/8) das cepas de Staphylococcus aureus e 83,3% (5/6) ) das cepas de Micrococcus spp, demonstrando uma resistência desses microrganismos a este antibiótico. Saliente-se que a suscetibilidade dos microrganismos, frente aos antibióticos empregados, apresentaram comportamentos distintos e com freqüências diversas, e do ponto de vista clínico, a sensibilidade intermediária é considerada como resistência.

Discussão

O gênero Staphylococcus ocorre habitualmente na pele e membranas mucosas de mamíferos e aves. Há 33 espécies caracterizadas neste gênero, e dentre as que foram isoladas de seres humanos e primatas não humanos, destacam-se as de interesse para as medicinas humana e veterinária que são coagulase positivas e patogênicas S. aureus, S. intermedius, S. hiycus e S. schleiferi coagulans. As coagulase-negativas são representadas por S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus, S. cohnii, S. xylosus, S. warneri, S. simulans, S. lugdunensis, S. schleiferi schleiferi, S. pasteuri, S. caprae, S. pulvereri, S. hominis, S. capitis e S. auricularis ¹¹, sendo algumas delas produtoras de toxinas e enzimas específicas.⁵

Segundo Parr et al.¹², alguns pesquisadores enfatizaram a função da higienização da pele por parte de macacos Cebus apella. Talvez o auxílio oral na limpeza cutânea e remoção de ectoparasitas interferisse com a composição da microflora da mucosa oral desta espécie de primatas não humanos.

O isolamento de alta porcentagem de Staphylococcus spp, da família Micrococcaceae no presente estudo, (73,1%), pressupõe risco de processo inflamatório infeccioso em caso de mordedura por estes animais.

Os dados sobre a ocorrência de mordeduras infligidas por animais são escassos^13,14,15, os relacionados a estudo bacteriológico das lesões também o são², e em relação aos acidentes provocados com primatas não humanos os registros também são escassos.^{3,16,17,18,19,20}

O estudo de sensibilidade e resistência frente a antibióticos de cepas de Staphylococcus spp tem sido realizado por autores, principalmente no que se refere ao estudo da mastite bovina.²¹

Lloyd et al.²² realizaram um estudo com cepas de Staphylococcus intermedius e S. aureus isoladas a partir da pele, ouvidos, olhos, mucosas nasal e oral, traquéia, vagina e vulva de animais da espécie canina. Das cepas isoladas da mucosa oral, 100% mostraram-se resistentes à penicilina, 80% resistentes à oxitetraciclina, não havendo resistência aos antibióticos lincomicina, eritromicina, co-trimoxazole e cefalexina.

Biberstein et al.²³, realizaram experimento no qual procedeu-se à identificação de cepas de Staphylococcus spp coagulase-positivos isoladas a partir de casos clínicos variados, das espécies canina, felina, eqüina, primatas não humanos, caprina e bovina. Realizaram testes de sensibilidade frente aos antibióticos penicilina, ampicilina, oxacilina, carbenicilina, cefalotina, eritromicina, cloranfenicol, tetraciclina, gentamicina, kanamicina, amicacina, sulfametoxazole e trimetoprim. Cepas de S. aureus apresentaram 70% de resistência frente à penicilina, 23,3% à tetraciclina, 15,4% ao cloranfenicol e S. intermedius mostrou resistência à penicilina de 61,3% das cepas, 39,9% à tetraciclina, 9,8% ao cloranfenicol e 10,5% à eritromicina.

Para Saijonmaa-Koulumies e Lloyd²⁴, cepas de S. intermedius, isoladas da mucosa oral de cães, apresentaram resistência à penicilina e à amoxicilina, quando da realização de antibiograma com a técnica da difusão em ágar. Os antibióticos testados foram penicilina, amoxicilina, amoxicilina com ácido clavulânico, cefalexina, sulfametoxazole com trimetoprim, eritromicina, lincomicina, oxitetraciclina, meticilina, enrofloxacina e oxacilina.

São raros os dados de literatura sobre isolamento e sensibilidade de Micrococcus spp. EIFF et al.²⁵, testaram, in vitro, 188 cepas de Micrococcus spp e 63 de Stomatococcus mucilaginosus obtidas a partir de casos clínicos humanos, frente à penicilina, ampicilina, cefazolina, cefotiam, cefuroxime, cefotaxime, imipenem, gentamicina, amicacina, netilmicina, eritromicina, claritromicina, clindamicina, vancomicina, teicoplanina, rifampicina, fosfomicina e ácido fusídico. Os resultados mostraram que os antibióticos b-lactâmicos testados, penicilina e imipenem, eram mais ativos contra Micrococcus spp. A rifampicina mostrou ser o antibiótico mais ativo dentre os testados.

Goldstein e Citron²⁶ estudaram, in vitro, a atividade de dez antibióticos frente a 147 cepas de bactérias aeróbias. Foram testados penicilina, cefalexina, ampicilina, tetraciclina, ácido clavulânico e amoxicilina, cefadroxil, cefuroxime, ciprofloxacin, ofloxacin e enofloxacin. Todas as cepas empregadas mostraram sensibilidade frente ao cefuroxime, 60% de resistência à cefalexina e 95% ao cefadroxil.

Rayan et al.⁶ verificaram para cepas de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, entre outras bactérias isoladas a partir da cavidade oral de macacos Rhesus (Macaca mulatta), sensibilidade de 100% frente ao cefoperazone, 96% ao cloranfenicol e 89% à ampicilina.

Ainda que haja controvérsia sobre a atuação em casos de ferimento por mordedura, sobre intervenção cirúrgica além de tratamento profilático e terapêutico com antibióticos, alguns autores preconizam que a escolha de antibióticos deva ser empírica, selecionando-se aqueles com atividade contra Staphylococcus aureus e Streptococcus spp, entre outros.^27,28 Assim, o prévio e constante conhecimento da prevalência de espécies bacterianas na microbiota, bem como sua sensibilidade a antibióticos, é essencial para que se esteja preparado para atuação em problemas emergenciais.

Conclusões

1.Staphylococcus spp foram isolados de 79,3% (23/29) dos macacos-prego (Cebus apella), Staphylococcus aureus de 24,1% (7/29) e Micrococcus spp de 20,7% (6/29).

2. Os dados obtidos demonstram que a cefalotina foi o antibiótico para o qual as cepas de Staphylococcus spp, isoladas a partir da mucosa oral de macacos-prego (Cebus apella) criados em cativeiro, apresentaram maior grau de sensibilidade.

3. Para Staphylococcus spp, a maior porcentagem de resistência foi observada em relação a penicilina (89,5%), oxacilina (97,4%), clindamicina (57,9%) e amoxicilina (63,2%).

Recebido para publicação: 28/02/2003

Aprovado para publicação: 19/02/2004

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Set 2005
• Data do Fascículo
  2003

Histórico

• Recebido
  28 Fev 2003
• Aceito
  19 Fev 2004