Avaliação da eficácia do colostro bovino hiperimune na infecção experimental de roedores com Cryptosporidium parvum

Evaluation of the efficacy of hyperimmune bovine colostrum on Cryptosporidium parvum experimental infection of rodents

Avaliação da eficácia do colostro bovino hiperimune na infecção experimental de roedores com Cryptosporidium parvum

Evaluation of the efficacy of hyperimmune bovine colostrum on Cryptosporidium parvum experimental infection of rodents

Vicente José Salles de Abreu^I; Ary Lopes Cardoso^I; Hilda Fátima de Jesus Pena^II; Solange Maria Gennari^II; Idércio Sinhorini^III; Sueli Blanes Damy^IV

^IUnidade de Nutrição e Metabolismo do Instituto da Criança "Pedro de Alcântara" da Faculdade de Medicina da USP, São Paulo - SP

^IIDepartamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, São Paulo - SP

^IIIDepartamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, são Paulo - SP

^IVCentro de Bioterismo do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP, São Paulo - SP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

O colostro bovino hiperimune contém alta concentração de anticorpos anti- Cryptosporidium parvum. Este produto é considerado como uma das estratégias terapêuticas promissoras no controle da criptosporidiose intestinal em humanos. Com o objetivo de avaliar a eficácia do colostro bovino hiperimune na redução do parasitismo e na prevenção de alterações de mucosa intestinal, foram infectados, experimentalmente, com oócistos de Cryptosporidium parvum, vários ratos (F344) e camundongos (C57BL/6). Os resultados mostraram que o colostro bovino hiperimune apresentou altos títulos de anticorpos. Os ratos F344, tratados com colostro bovino hiperimune ou com colostro normal, tiveram redução no parasitismo intestinal e apresentaram menor comprometimento de sua mucosa. Os camundongos C57BL/6, quando tratados com colostro hiperimune ou normal, apresentaram ligeira redução do parasitismo intestinal e não evidenciaram diferenças estatísticas significantes nas alterações histopatológicas da mucosa. Conclui-se que o uso do colostro bovino hiperimune tenha um benefício limitado na infecção causada pelo Cryptosporidium parvum.

Palavras-chave: Colostro. Modelos animais de doenças. Cryptosporidium parvum. Roedores. Ratos endogâmicos F344.

ABSTRACT

The hyperimmune bovine colostrum has a high concentration of antibodies anti-Cryptosporidium parvum. This product is considered one of the promising therapeutic strategies in the control of intestinal cryptosporidiosis in humans. With the purpose to evaluate the hyperimmune bovine colostrum efficacy in reducing the parasitism and preventing intestinal mucosa alterations, several strains of rats F344 and mice were experimentally infected with Cryptosporidium parvum oocysts. The results showed that the hyperimmune bovine colostrum had high levels of antibodies. The rats F344, treated either with hyperimmune or normal bovine colostrum, had reduction of the intestinal parasitism and presented little mucosa compromise. The mice C57BL/6 when treated either with hyperimmune or normal colostrum had slight reduction of the intestinal parasitism and evidenced no statistical significant differences in the histopathological mucosa changes. In conclusion, the use of hyperimmune bovine colostrum has a limited benefit in Cryptosporidium parvum infection.

Key-words: Colostrum. Diseases animal models. Cryptosporidium parvum. Rodents. F344 endogamic rats.

Introdução

O Cryptosporidium spp. foi descrito inicialmente por Tyzzer em 1907 como um protozoário presente nas glândulas gástricas de camundongos assintomáticos. Não foi associado à doença em animais até 1955, quando Slavin atribuiu-lhe o papel de agente causal da diarréia em perus. Posteriormente, o Cryptosporidium parvum (C. parvum) foi responsabilizado como agente causador de diarréia em bovinos, ovinos, suínos e outros animais domésticos e silvestres. Em 1971, Panciera, Thomassen e Garden¹ associaram esse coccídeo à diarréia bovina. Os primeiros dois casos de criptosporidiose em humanos foram relatados em 1976 por dois diferentes grupos.^2,3 A partir de 1982, o relato de pessoas infectadas pelo Cryptosporidium parvum aumentou proporcionalmente ao registro crescente de pacientes com Aids.

Até o presente, não há terapia eficaz contra a criptosporidiose. O colostro bovino hiperimune anti-C.parvum (CBH) neutralizou a infectividade de esporozoítas in vitro e impediu o estabelecimento de infecção experimental com Cryptosporidium parvum em camundongos BALB/c e em vacas.^{4,5,6,7,8,9,10,11} A principal imunoglobulina presente no CBH é a IgG₁^12,13 .

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia do colostro hiperimune na redução do parasitismo intestinal e na prevenção de alterações da mucosa intestinal em roedores experimentalmente infectados com Cryptosporidium parvum.

Materiais e Métodos

O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa da FM-USP, nº 272/00 em 13/09/2000.

Para a obtenção dos oocistos de Cryptosporidium parvum foram utilizados dois bezerros machos, da raça holandesa, com exames parasitológicos negativos. Cada animal foi inoculado oralmente com 3,5 x 10⁷ oocistos de Cryptosporidium parvum obtidos a partir de uma vaca naturalmente infectada. Desde o 1º dia de inoculação adaptou-se um saco plástico de coleta de fezes na região posterior dos animais. As fezes foram colhidas a partir do 3º ou 4º dia pós-inoculação (dpi) até o 11º, quando então diminuiu a eliminação de oocistos. As fezes foram homogeneizadas em água destilada e tamisadas com coador de chá comum para eliminar debris grosseiros, sendo então estocadas em solução de dicromato de potássio 2%, a 4ºC ¹³ . O antígeno foi preparado purificando-se os oocistos dessas fezes. Posteriormente, esses oocistos foram lavados e armazenados a 4º C. Segundo a contagem de oocistos obtida, o "pellet" foi assepticamente aliquotado em tubos de "eppendorf", na dose vacinal de 2,0 x 10⁷ oocistos/"eppendorf", sendo armazenados em "freezer" a -20ºC, até sua utilização.

Os colostros foram preparados a partir da hiperimunização de cinco vacas da raça holandesa, multíparas e em gestação com sorologias negativas para toxoplasmose, brucelose e tuberculose. A dose vacinal foi preparada na concentração de 2,0 x 10⁷ oocistos por imunização. As vacas receberam injeções 10 semanas antes do parto (SAP) por via intramuscular e, posteriormente, por via intramamária, na 8, 6 e 4 SAP.¹⁴ Todos os colostros foram colhidos imediatamente após o parto e posteriormente, analisados pelo teste de ELISA para titulação de anticorpos anti-Cryptosporidium parvum ^7,13,15. Os colostros foram mantidos congelados a -20ºC até a sua utilização.

Na tabela 1 são apresentados os títulos de anticorpos, ou seja, as diluições até onde foram detectados pelo ELISA os anticorpos para Cryptosporidium parvum nas 5 amostras de colostro obtidas. O animal controle não foi imunizado.

Os camundongos receberam a dose de 1 x 10⁶ oocistos de Cryptosporidium parvum diluída em 10 ml de solução salina tamponada (PBS) e os ratos a dose de 2 x 10⁶ oocistos de Cryptosporidium parvum em 20 ml de PBS. A inoculação foi realizada por via oral, utilizando-se uma ponteira de polipropileno acoplada a uma micropipeta. A dose administrada baseou-se nos trabalhos de Ungar et al.¹⁶ e Mead et al.¹⁷ , que verificaram que a menor dose capaz de infectar 100% dos camundongos é de 10⁶ oocistos.

Foram utilizados 40 camundongos C57BL/6 e 37 ratos F344, isogênicos, com idade variando de 2 a 4 dias de vida e originários do Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Todos os procedimentos utilizados neste trabalho foram realizados de acordo com princípios éticos estabelecidos pelo COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.¹⁸

Os animais foram distribuídos em 4 grupos:

- grupo controle positivo: animais inoculados com oocistos de Cryptosporidium parvum e que não receberam colostro posteriormente;

- grupo controle negativo: animais não inoculados com oocistos e que não receberam colostro posteriormente;

- grupo colostro normal: animais inoculados com oocistos de Cryptosporidium parvum e que receberam colostro normal no 4º e 5º dpi ;

- grupo colostro hiperimune: animais inoculados com oocistos de Cryptosporidium parvum e que receberam colostro hiperimune no 4º e 5º dpi.

Todos os animais foram sacrificados em câmara de CO₂ no 6⁰ dpi. As amostras obtidas do intestino delgado, ceco e intestino grosso foram conservadas em solução de formol a 10%, coradas com hematoxilina-eosina e fixadas em parafina. A análise histológica foi feita em microscopia ótica de luz branca com objetiva de 40x, com aumento final de 140x (Microscópio Olympus ^TM). O parasitismo intestinal e a arquitetura da mucosa intestinal foram avaliados pelo pesquisador e pelo patologista. Ao todo foram analisadas 160 lâminas e foram feitas 2 contagens de campo/lâmina. O parasitismo foi verificado pela contagem do número de oocistos de Cryptosporidium parvum/campo (o/c) no terço distal da mucosa do intestino delgado. Os examinadores observaram a integridade da mucosa intestinal. Posteriormente, de acordo com o grau de comprometimento observado, foi instituído um escore morfológico. Não foram registradas medidas específicas do comprometimento das vilosidades. O escore foi realizado com base na análise histológica do patologista e do pesquisador realizadas em separado. Quando houvesse diferença de resultado, o patologista reavaliava as lâminas para obter o escore. Assim, para a mucosa intestinal normal – escore morfológico de 0; havendo leve comprometimento de mucosa, ou seja, quando as vilosidades exibissem discreta descamação superficial e leve encurtamento das pontas - escore morfológico de 1; havendo moderado comprometimento, ou seja, quando as vilosidades apresentassem encurtamento de aproximadamente 50% de seu comprimento normal – escore morfológico de 2; havendo grave comprometimento da mucosa intestinal, com deslocamento, ausência ou achatamento quase total das vilosidades – escore morfológico 3.

A análise estatística consistiu de análise de variância (ANOVA) com pós-teste Student-Newman-Keuls test, com nível de significância < 1%; teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de DMS (diferença mínima significativa).

Resultados

A figura 1 exibe a curva de parasitismo intestinal em algumas linhagens de roedores em que se estudou a infecção causada pelo Cryptosporidium parvum. Como os ratos F344 e os camundongos C57BL/6 recém-nascidos exibiram um tempo maior de parasitismo intestinal verificado através da presença de oocistos na mucosa intestinal, essas linhagens foram consideradas as mais apropriadas para prosseguir o experimento.

A tabela 2 apresenta a média do número de oocistos do Cryptosporidium parvum evidenciada na mucosa do intestino delgado dos ratos F344 e dos camundongos C57BL/6 infectados experimentalmente. Pode-se observar que quando os animais foram infectados e não receberam qualquer um dos colostros (grupo controle positivo), os ratos F344 exibiram maior média de oocistos que os camundongos C57BL/6. Quando os animais receberam algum tipo de colostro, o parasitismo foi menor nos ratos F344 do que nos camundongos C57BL/6. Entre os animais F344, aqueles que receberam colostro normal tiveram menor parasitismo que os tratados com colostro hiperimune. Entre os camundongos C57BL/6 não houve diferenças significantes entre os diferentes grupos de tratamento.

A tabela 3 apresenta o escore morfológico dos ratos F344 e dos camundongos C57BL/6 infectados experimentalmente com oocistos de Cryptosporidium parvum. A morfologia da mucosa intestinal esteve mais preservada nos ratos F344 do que nos camundongos C57BL/6. Contudo, em ambas as linhagens de roedores não houve diferenças significativas na arquitetura da mucosa intestinal com o emprego do colostro normal ou do hiperimune.

Os resultados, apresentados nas tabelas 2 e 3, mostram que os ratos F344 comparativamente aos camundongos C57BL/6, quando infectados com Cryptosporidium parvum, apresentam maior média de oocistos na mucosa intestinal e têm a arquitetura de mucosa mais preservada quando recebem colostro bovino normal ou hiperimune.

Discussão

Alguns pesquisadores observaram que o colostro bovino normal e sua fração solúvel (soro) freqüentemente têm baixos títulos de anticorpos anti-Cryptosporidium parvum, além de conter citocinas com atividade anti-Cryptosporidium parvum. Esse colostro possui também fatores microbicidas não relacionados às imunoglobulinas e podem reduzir, de maneira inespecífica, a infecção causada pelo Cryptosporidium parvum. Esses fatores, presentes no colostro, correspondem aos linfócitos T e B, leucócitos polimorfonucleares, macrófagos e fatores biologicamente ativos como vitaminas, prostaglandinas, lactoferrina e complemento. Essas substâncias são capazes de modular uma resposta imunológica.^6,8,19,20 Estes fatos podem explicar o porquê de o parasitismo intestinal ter diminuído nos animais infectados experimentalmente com o Cryptosporidium parvum quando receberam colostro bovino normal. O fato de o colostro hiperimune não apresentar um resultado melhor do que o colostro normal poderia sugerir, em uma primeira análise, que os anticorpos, presentes no produto hiperimune, não fossem protetores. Isso poderia advir do protocolo de preparo do inóculo vacinal. Assim, os anticorpos do colostro hiperimune para o Cryptosporidium parvum teriam um menor efeito neutralizante, uma vez que esses anticorpos não reconheceriam os epítopos do antígeno. Entretanto, o protocolo de produção de anticorpos seguiu a metodologia indicada por Fayer, Guidry e Blagburn⁷ e o teste de ELISA demonstrou alta concentração de anticorpos. É importante lembrar que o protocolo de produção de colostro bovino hiperimune estimula a resposta humoral, mediada por imunoglobulinas e a resolução da criptosporidiose se deve principalmente à resposta celular. Portanto, o CBH não traria benefício adicional na resolução da infecção intestinal de roedores. Arrowood et al.²¹ verificaram que os camundongos lactantes de mães com história de infecção prévia com Cryptosporidium parvum, desenvolveram infecção quando foram inoculados com esses parasitas. Esses autores concluíram que somente os anticorpos não foram suficientes para proteger os animais contra esta infecção. Taghi-Kilani, Sekla e Hayglass²² também investigaram o papel da resposta imune-humoral ativa no controle da infecção com Cryptosporidium parvum em camundongos BALB/c recém-nascidos. Os autores encontraram uma baixa produção de anticorpos IgG e IgM e os níveis de anticorpos não se correlacionaram com a duração ou a quantidade de excreção de oocistos. Esses estudiosos concluíram que, em camundongos, a ativação de respostas com anticorpos à infecção com Cryptosporidium parvum não tem um papel importante na resolução da infecção com Cryptosporidium parvum. Por outro lado, Hill, Dawson e Blewet¹⁹ empregaram anticorpos monoclonais em modelo experimental. Esses autores queriam determinar se a exposição ao componente IgG purificado do soro hiperimune de ovelhas poderia neutralizar os esporozoítas do C. parvum no epitélio intestinal de ratos. Os pesquisadores observaram que a IgG específica era capaz de neutralizar a infectividade desses esporozoítas.

Em nosso trabalho, a infecção ocorreu na porção terminal do íleo e na porção proximal do cólon. Este achado coincide com o descrito por outros autores.^23,24 Uma possibilidade de o colostro hiperimune de nosso experimento não ter apresentado um resultado melhor, pode ser devido ao fato de estágios intra-celulares do parasita não terem sido neutralizados pelo colostro. O Cryptosporidium parvum é um parasita intra-celular, aderente à superfície do enterócito, encistado entre as microvilosidades e fechado em um vacúolo parasitário.^25,26,27 Está bem documentada a autoinfecção desencadeada por diversos estágios do ciclo de vida desse parasita.²⁸ Saxon e Weinstein²⁹ não observaram resposta com o uso de colostro hiperimune em um pequeno grupo de pacientes com criptosporidiose intestinal. Esses autores atribuíram o insucesso terapêutico ao fato de haver formas endógenas do parasita e não terem localização exclusiva na luz intestinal. Por outro lado, vários trabalhos demonstram que os anticorpos neutralizantes do colostro bovino hiperimune estão dirigidos contra os determinantes antigênicos conhecidos de oocistos do Cryptosporidium parvum e também contra epítopos presentes em outros estágios evolutivos do parasita.^{4,10,12,15,25,27,30,31,32,33,34} Perryman et al.⁹ observaram eficácia do colostro hiperimune quando usado antes da infecção com Cryptosporidium parvum. Os autores acreditam que a rápida neutralização dos esporozoítas dentro do lúmen intestinal, antes de ocorrer a infecção das células epiteliais, seria importante para reduzir a intensidade da infecção inicial após a ingestão dos oocistos e em diminuir a autoinfecção causada pelos esporozoítas liberados na célula infectada do hospedeiro. Naciri et al.³⁵ realizaram estudo da eficácia do colostro hiperimune em ovelhas com criptosporidiose. Estes autores obtiveram uma redução dos casos de criptosporidiose quando forneceram o colostro profilaticamente, ou seja, antes da inoculação dos oocistos.

Conclusões

A partir de nossos resultados e da literatura acumulada sobre o assunto, em sua maioria com modelos murinos, pode-se concluir que o benefício do colostro bovino hiperimune é limitado. Os trabalhos mais otimistas evidenciam um efeito protetor do produto quando usado profilaticamente. Este benefício preventivo do colostro nos parece de pouco valor na prática clínica.

Recebido para publicação: 08/08/2002

Aprovado para publicação: 19/02/2004

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Set 2005
• Data do Fascículo
  2003

Histórico

• Aceito
  19 Fev 2004
• Recebido
  08 Ago 2002