Proporção macho: fêmea de embriões bovinos cultivados na presença ou ausência de glicose após FIV com espermatozóides selecionados por Swim-up ou Gradiente de Percoll

Resumos

No sistema de PIV em bovinos, tem sido obtida uma elevada porcentagem de embriões machos. Este experimento foi realizado para determinar se a presença de glicose no meio de cultivo afeta a proporção macho:fêmea (M:F) dos embriões bovinos PIV a partir da FIV com espermatozóides preparados pelos métodos do swim-up (S) ou do gradiente de Percoll (P). Após a MIV, os COCs foram divididos em dois grupos e inseminados com espermatozóides preparados por um dos métodos. Os zigotos foram cultivados em meio com ou sem 5,56mM de glicose, totalizando 4 tratamentos: S-Gli, S+Gli, P-Gli e P+Gli e 48h após a inseminação, os embriões de cada tratamento foram submetidos à sexagem por PCR (n=845). O efeito da glicose no meio de cultivo sobre a proporção M:F dos embriões PIV a partir dos dois métodos foi semelhante (teste do c²), resultando em uma porcentagem de machos menor do que 50% no estágio de 2-C (S: 30,8%; P: 23,8%: P<0,01) e maior do que 50% no estágio de 8-C (S: 79,4%; P: 68,8%: P<0,01). Estas porcentagens foram diferentes (P<0,05) das observadas quando os embriões foram cultivados sem glicose, tanto no estágio de 2-C (S: 48,5%; P: 41,5%) como no de 8-C (S: 62,5%; P: 50,8%). A presença de glicose não afetou a proporção M:F no total de embriões produzidos (S: 56,7%; P: 49,0%), que foi semelhante à observada na ausência de glicose (S: 55,7%; P: 46,2%). Portanto, a glicose exacerbou a diferença na velocidade de desenvolvimento entre os embriões machos e fêmeas.

Fecundação in vitro; Proporção macho:fêmea; Glicose; Gradiente de Percoll; Swim-up

In the bovine IVP system, it has been obtained a high percentage of male embryos. This experiment was carried ou to determine if the glucose presence in the culture medium affects the sex ratio of bovine embryos IVP from the IVF with spermatozoa prepared for the swim-up (S) or Percoll gradient (P) methods. After the IVM, the COCs had been divided in two groups and inseminated with spermatozoa prepared for one of the methods. The zygotes had been cultivated in medium with or without 5.56mM of glucose, totalizing 4 treatments: S-Glu, S+Glu, P-Glu and P+Glu, and 48h post-insemination, the embryos of each treatment had been sexed for the PCR method (n=845). The effect of glucose in the culture medium on sex ratio of embryos IVP from the two methods was similar (c² test), resulting in a percentage of males lower than 50% in the 2-C stage (S: 30.8%; P: 23.8%: P<0.01) and higher than 50% in the 8-C stage (S: 79.4%; P: 68.8%: P<0.01). These percentages were different (P<0.05) of the observed when the embryos were cultivated without glucose, as much in the 2-C stage (S: 48.5%; P: 41.5%) as in the 8-C stage (S: 62.5%; P: 50.8%). The glucose presence did not affect the sex ratio in the total of produced embryos (S: 56.7%; P: 49.0%), that was similar to the observed in the glucose absence (S: 55.7%; P: 46.2%). Therefore, the glucose exacerbated the difference in the development speed between the female and male embryos.

In vitro fertilization; Sex ratio; Glucose; Percoll gradient; Swim-up

Proporção macho:fêmea de embriões bovinos cultivados na presença ou ausência de glicose após FIV com espermatozóides selecionados por Swim-up ou Gradiente de Percoll

Maria Gabriela Tavares Rheingantz^I; Ligia Margareth Cantarelli Pegoraro^II; Odir Antonio Dellagostin^I; Anita Mylius Pimentel^I; Mari Lourdes Bernardi^III; João Carlos Deschamps^I

^IInstituto de Biologia e Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, Pelotas - RS

^IIEmbrapa Clima Temperado, Pelotas - RS

^IIIDepartamento de Zootecnia da Faculdade de Agronomia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre - RS

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

No sistema de PIV em bovinos, tem sido obtida uma elevada porcentagem de embriões machos. Este experimento foi realizado para determinar se a presença de glicose no meio de cultivo afeta a proporção macho:fêmea (M:F) dos embriões bovinos PIV a partir da FIV com espermatozóides preparados pelos métodos do swim-up (S) ou do gradiente de Percoll (P). Após a MIV, os COCs foram divididos em dois grupos e inseminados com espermatozóides preparados por um dos métodos. Os zigotos foram cultivados em meio com ou sem 5,56mM de glicose, totalizando 4 tratamentos: S-Gli, S+Gli, P-Gli e P+Gli e 48h após a inseminação, os embriões de cada tratamento foram submetidos à sexagem por PCR (n=845). O efeito da glicose no meio de cultivo sobre a proporção M:F dos embriões PIV a partir dos dois métodos foi semelhante (teste do c²), resultando em uma porcentagem de machos menor do que 50% no estágio de 2-C (S: 30,8%; P: 23,8%: P<0,01) e maior do que 50% no estágio de 8-C (S: 79,4%; P: 68,8%: P<0,01). Estas porcentagens foram diferentes (P<0,05) das observadas quando os embriões foram cultivados sem glicose, tanto no estágio de 2-C (S: 48,5%; P: 41,5%) como no de 8-C (S: 62,5%; P: 50,8%). A presença de glicose não afetou a proporção M:F no total de embriões produzidos (S: 56,7%; P: 49,0%), que foi semelhante à observada na ausência de glicose (S: 55,7%; P: 46,2%). Portanto, a glicose exacerbou a diferença na velocidade de desenvolvimento entre os embriões machos e fêmeas.

Palavras-chave: Fecundação in vitro. Proporção macho:fêmea. Glicose. Gradiente de Percoll. Swim-up.

ABSTRACT

In the bovine IVP system, it has been obtained a high percentage of male embryos. This experiment was carried ou to determine if the glucose presence in the culture medium affects the sex ratio of bovine embryos IVP from the IVF with spermatozoa prepared for the swim-up (S) or Percoll gradient (P) methods. After the IVM, the COCs had been divided in two groups and inseminated with spermatozoa prepared for one of the methods. The zygotes had been cultivated in medium with or without 5.56mM of glucose, totalizing 4 treatments: S-Glu, S+Glu, P-Glu and P+Glu, and 48h post-insemination, the embryos of each treatment had been sexed for the PCR method (n=845). The effect of glucose in the culture medium on sex ratio of embryos IVP from the two methods was similar (c² test), resulting in a percentage of males lower than 50% in the 2-C stage (S: 30.8%; P: 23.8%: P<0.01) and higher than 50% in the 8-C stage (S: 79.4%; P: 68.8%: P<0.01). These percentages were different (P<0.05) of the observed when the embryos were cultivated without glucose, as much in the 2-C stage (S: 48.5%; P: 41.5%) as in the 8-C stage (S: 62.5%; P: 50.8%). The glucose presence did not affect the sex ratio in the total of produced embryos (S: 56.7%; P: 49.0%), that was similar to the observed in the glucose absence (S: 55.7%; P: 46.2%). Therefore, the glucose exacerbated the difference in the development speed between the female and male embryos.

Key-words: In vitro fertilization. Sex ratio. Glucose. Percoll gradient. Swim-up.

Introdução

Vários estudos têm reportado uma elevada proporção de machos entre os embriões mamíferos produzidos in vitro^1,2,3,4,5, o que poderia limitar a aplicação da técnica de PIV, sobretudo em rebanhos bovinos com aptidão leiteira.

Apesar das causas deste desvio ainda não estarem esclarecidas, há especulações de que as condições in vitro possam estar relacionadas com este fenômeno.^5,6,7,8 Alguns autores^9,10 sustentam que os componentes do meio de cultivo podem influenciar a velocidade de desenvolvimento e/ou a sobrevivência dos embriões de determinado sexo, afetando assim a proporção macho:fêmea, devido a diferenças metabólicas ligadas ao sexo do embrião.

A glicose parece estar envolvida na ocorrência do desvio na proporção macho:fêmea resultante da diferente velocidade de desenvolvimento entre os sexos¹¹. Nas primeiras horas após a fecundação, embriões bovinos do sexo masculino clivam mais rapidamente do que os do sexo feminino, quando cultivados em meio contendo 5,56 mM de glicose^12,13,14. Tiffin et al.¹⁵ constataram que o metabolismo da glicose é significativamente maior em embriões bovinos do sexo masculino do que nos do sexo feminino.

A presença de radicais de oxigênio no meio de cultivo também parece participar do mecanismo que determina este desvio macho:fêmea relacionado com a velocidade de desenvolvimento. Estes radicais, embora apresentem ação citotóxica, possuem também efeito estimulante sobre o desenvolvimento dos embriões¹⁶ e são encontrados em níveis mais baixos nos embriões fêmeas do que nos machos.¹⁷

O efeito dos métodos de preparação dos espermatozóides para FIV e das condições de cultivo sobre a proporção macho:fêmea dos embriões produzidos in vitro ainda é pouco conhecido. Em estudos recentes, foi constatado que o método swim-up resultou em maior proporção de machos entre embriões bovinos produzidos in vitro, enquanto o gradiente de Percoll não determinou desvios na proporção macho:fêmea.^18,19

O presente trabalho teve como objetivo determinar se a presença de glicose no meio de cultivo afeta a proporção macho:fêmea dos embriões bovinos produzidos in vitro resultantes da fecundação in vitro com espermatozóides preparados pelos métodos swim-up ou gradiente de Percoll.

Materiais e Métodos

Colheita dos oócitos e maturação in vitro

Ovários bovinos foram colhidos em frigoríficos e transportados até o laboratório em solução de NaCl a 0,9%, a 22°C. Os folículos com 2-8 mm de diâmetro foram aspirados para obtenção dos complexos oócitos-cumulus (COC). Foram utilizados somente oócitos que possuíam três ou mais camadas de células do cumulus oophorus não expandidas e que não apresentavam degeneração citoplasmática visível na avaliação morfológica.

A maturação dos oócitos foi realizada em TCM-199/25 mM hepes (Gibco) com 10% SFB (Gibco), 0,01 UI/mL rFSH (Gonal F-75), 5 mg/mL LH, 0,05 mg/mL sulfato de estreptomicina e 0,065 mg/mL penicilina G potássica. Os oócitos selecionados foram incubados neste meio por 22 a 24 horas, em estufa a 38,5°C, com 5% de CO₂ em ar e umidade relativa acima de 90%.

Após o período de maturação, os oócitos foram transferidos para o meio de fecundação IVF-TALP²⁰, em grupos de 25 a 50 oócitos em 400 mL de meio, onde foram imediatamente inseminados com espermatozóides preparados por um dos métodos descritos a seguir. O dia da inseminação foi considerado como dia zero (D0). Todos os reagentes químicos utilizados foram da Sigma, com exceção dos produtos indicados.

Preparação dos espermatozóides e fecundação in vitro (FIV)

Para a FIV, foi utilizado sêmen bovino de um único ejaculado congelado em palhetas de 0,5 mL, que foi descongelado imediatamente antes de sua utilização, em banho-maria a 37°C por 30 segundos.

Em cada dia de FIV, os oócitos maturados in vitro foram aleatoriamente divididos em dois grupos: um grupo foi inseminado com espermatozóides preparados pelo método do swim-up, conforme Parrish et al.²¹ e o outro foi inseminado com espermatozóides preparados pelo método do gradiente de Percoll.²² Foi descongelada uma palheta de sêmen por dia de FIV e o seu conteúdo dividido entre os dois tratamentos, que foram realizados simultaneamente. A concentração de espermatozóides utilizada para a inseminação foi de 10⁶ espermatozóides/µL. Os gametas foram incubados durante 18 a 22 horas a 38,5°C, em estufa com 5% de CO2 em ar e umidade relativa acima de 90%.

Cultivo dos zigotos

Após o período de FIV, os presumíveis zigotos foram submetidos ao vórtex por 2 minutos, para a remoção das células do cumulus e dos espermatozóides aderidos. Logo após, os presumíveis zigotos de cada grupo foram lavados três vezes em meio SOFaa e então divididos aleatoriamente e transferidos para gotas de 400 mL de meio SOFaa²³ com 3 mg/mL de BSA (albumina sérica bovina), com ou sem a presença de 5,56 mM de glicose. As gotas de meio de cultivo foram cobertas com óleo mineral. Os zigotos foram cultivados em estufa a 38,5°C, com 5% CO₂ em ar e umidade relativa acima de 90%. No segundo dia após a inseminação (D2), os embriões clivados de cada tratamento foram classificados morfologicamente em 2-células (2-C), 4-células (4-C) e 8-células (8-C), e preparados para a sexagem.

Preparo dos embriões para a sexagem

Após a avaliação, os embriões foram colocados em solução de pronase a 0,25% para remoção da zona pelúcida, evitando assim possível contaminação com DNA de espermatozóides que permaneceram ligados à zona pelúcida. A seguir, os embriões foram lavados quatro vezes em solução de PBS e então submetidos ao tratamento de lise com proteinase K (Gibco), onde cada embrião foi transferido para um tubo eppendorf contendo 20 ml de tampão de lise (150 mg/mL proteinase K, 15 mM Tris-HCl pH 8,9, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100), que foi incubado a 37°C por 60 minutos. A seguir, os tubos foram incubados a 95°C por 15 minutos, para inativação da proteinase K e armazenados a –20°C, até o momento da sexagem.

Sexagem dos embriões

Os embriões foram sexados pelo método de PCR, com a utilização de dois pares de primers (Genosys), simultaneamente. O primeiro par, reconhece uma seqüência autossômica específica de bovinos, o DNA satélite 1.715, que é amplificada tanto em fêmeas como em machos bovinos²⁴. O segundo par, reconhece uma seqüência repetitiva específica do cromossomo Y bovino amplificada somente em machos bovinos.^24,2526,27 O produto da amplificação com os primers DNA bovino-específicos possui 216 pb e o produto da amplificação com os primers cromossomo Y-específicos possui 175 pb.

No momento da sexagem, os tubos contendo as amostras (lisados de embriões) foram descongelados à temperatura ambiente. As reações de PCR foram realizadas em um volume total de 30 mL, utilizando como templates 10 mL de cada amostra. Todas as amplificações foram realizadas em um tampão com uma concentração final de 10 mM Tris-HCl pH 8,4 , 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs , 1U/amostra Taq DNA polimerase (Gibco), 20 nM primers 1+2 e 20 nM primers 3+4.

As amostras foram amplificadas em um termociclador, sendo desnaturadas a 94°C por 4 minutos, seguidos de 40 ciclos consistindo de desnaturação (95°C por 1 minuto), anelamento (56°C por 30 segundos) e extensão (72°C por 1 minuto). Após o último ciclo, todas as amostras foram incubadas por mais 10 minutos a 72°C.

A cada processamento, foram incluídos um controle negativo (amostra sem DNA), um controle positivo-fêmea (amostra com DNA de fêmea bovina) e um controle positivo-macho (amostra com DNA de macho bovino), para excluir contaminantes e checar a validade dos reagentes.

Análise dos produtos do PCR

Os produtos da amplificação por PCR (15 mL) foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2,5% corado com brometo de etídio e analisados sob luz ultravioleta.

As amostras que apresentaram apenas o produto com 216 pb foram consideradas do sexo feminino. As amostras que apresentaram o produto com 175 pb, específico do cromossomo Y, além do produto com 216 pb, foram consideradas do sexo masculino.

Delineamento experimental e análise estatística

Foram realizados 4 tratamentos, em 10 repetições, sendo avaliado o efeito de dois métodos de preparação dos espermatozóides para FIV e da presença ou não de glicose no meio de cultivo dos zigotos, da seguinte forma: T1: swim-up + cultivo com 5,56mM de glicose; T2: swim-up + cultivo sem glicose; T3: Percoll + cultivo com 5,56mM de glicose e T4: Percoll + cultivo sem glicose.

Os dados foram analisados pelo teste do c² (Qui-quadrado), sendo a proporção macho:fêmea em cada tratamento comparada com aquela teoricamente esperada de 1:1. A proporção macho:fêmea entre os tratamentos também foi comparada.

Resultados

Neste experimento, dos 879 embriões que foram submetidos ao PCR, 845 (96,1%) apresentaram amplificação para os primers autossômicos bovino-específicos. Destes, 439 (52%) também mostraram amplificação da seqüência Y-específica.

Os resultados são apresentados na tabela 1. Quando os dois métodos de seleção de espermatozóides foram comparados, não apresentaram diferença significativa, dentro de cada estágio, tanto na presença como na ausência de glicose. Quando foi considerado o número total de embriões, foi verificado, na ausência de glicose, um maior percentual de machos com o swim-up (P<0.05) do que com o Percoll.

Comparando a proporção de machos com a freqüência esperada de 50%, dentro de cada estágio de desenvolvimento, a presença de glicose no meio de cultivo resultou em uma porcentagem menor do que 50% de embriões do sexo masculino no estágio de 2-células (P<0,01) e maior do que 50% no estágio de 8-células (P<0,01), tanto para swim-up como para Percoll. Na ausência de glicose, foi observada uma porcentagem maior do que 50% de embriões do sexo masculino somente no estágio de 8-células (P<0,05) e com o método swim-up. Com o Percoll, não houve desvios na proporção dos sexos, em nenhum estágio, na ausência de glicose. Considerando o total de embriões, houve tendência a uma maior proporção de embriões do sexo masculino, com o swim-up, tanto na presença como na ausência de glicose (P<0,10). Com os dois métodos de seleção dos espermatozóides, a diferença na proporção de machos entre os estágios mais avançados e menos avançados só ocorreu na presença de glicose.

Com ambos os métodos de seleção dos espermatozóides, foi observado que a presença de glicose determinou uma porcentagem de machos significativamente maior do que a ausência de glicose, entre os 1embriões mais adiantados (P<0,05) e uma porcentagem de machos significativamente menor entre os embriões mais atrasados (P<0,05), indicando uma diferença acentuada na velocidade de desenvolvimento entre embriões machos e fêmeas.

Discussão

A diferente velocidade de desenvolvimento entre os sexos, apesar de resultar em uma maior proporção de machos entre os embriões mais desenvolvidos, não necessariamente resulta em desvio na proporção macho:fêmea no número total dos embriões, o que já foi observado em bovinos^2,12,28,29 e ovinos³⁰. No presente estudo, o aumento significativo no percentual de machos no estágio 8-C, na presença de glicose, tanto para o método Percoll como para swim-up, mostra que a glicose exacerbou a diferença na velocidade de desenvolvimento entre os embriões machos e fêmeas.

O metabolismo total da glicose é o dobro em embriões bovinos machos do que nos fêmeas, o que pode estar relacionado com o desenvolvimento mais rápido dos embriões machos.¹⁵ A elevada concentração de glicose no meio de cultivo (=5,56mM) pode contribuir para determinar a maior velocidade de desenvolvimento in vitro dos embriões bovinos machos, desde as primeiras clivagens.^10,12,13,28

O efeito da glicose na velocidade de desenvolvimento pode ser devido ao estímulo na formação de radicais de oxigênio, que se encontram em níveis baixos nos embriões fêmeas como resultado do controle glicose-dependente das enzimas HPRT e G6PDH, ligadas ao cromossomo X, que são super-expressadas antes da inativação de um dos cromossomos X.^12,28 Esta suposição é reforçada pela constatação de que a expressão dos genes HPRT e G6PDH é significativamente maior nos embriões bovinos fêmeas do que nos machos³¹. A concentração elevada de glicose no meio de cultivo (4,5 mM), assim como uma elevada tensão de oxigênio na atmosfera gasosa (20%), aumenta a geração de radicais de oxigênio derivados das reações xantina oxidase-hipoxantina (XOD-HXT)³². No presente experimento, assim como nos experimentos de Peippo e Bredbacka¹³ e Bredbacka e Bredbacka^12,28, foram utilizadas altas concentrações de glicose no meio de cultivo (5,56 mM) e de oxigênio na atmosfera (20%), as quais podem ter conduzido a um aumento dos radicais livres de oxigênio no meio de cultivo. A alta tensão de oxigênio, superior à existente no oviduto bovino, que é de 5%¹⁶, poderia por si só ter induzido a produção de radicais livres de oxigênio, resultantes das reações XOD-HXT, mesmo na ausência de glicose. Estes radicais poderiam ser suficientes para determinar o estresse oxidativo que aceleraria o desenvolvimento dos embriões machos, o qual seria exacerbado pelo incremento das reações XOD-HXT, na presença de glicose. Nos embriões fêmeas, a presença de glicose levaria à super-expressão das enzimas G6PDH e HPRT, ligadas ao cromossomo X, reduzindo a sua produção de radicais de oxigênio até níveis anormalmente baixos, talvez até atrasando o seu desenvolvimento.^12,28

Embora as diferenças não tenham sido significativas, percebe-se um aumento gradativo no percentual de machos, à medida que avança o estágio de desenvolvimento, mesmo na ausência de glicose no meio de cultivo (Tabela 1), o que pode indicar que a mesma não é o único fator envolvido neste processo. Esta constatação discorda da reportada por outros autores^12,13,28, os quais atribuem o desenvolvimento mais rápido dos embriões machos somente à presença de glicose exógena no meio de cultivo.

A expressão de genes ligados ao cromossomo Y, como o SRY e/ou o ZFY, desde as primeiras clivagens foi constatada em diferentes espécies mamíferas^{33,34,35,36,37} e sua participação na aceleração do desenvolvimento dos embriões machos não pode ser descartada. Genes ligados ao cromossomo Y podem ter um efeito "acelerador" em machos e os dois cromossomos X ativos podem ter um efeito "retardador" em fêmeas, durante o período pré-implantação.³⁶ A detecção da transcrição em estágios tão precoces como 2-células, em embriões bovinos produzidos in vitro^38,39, pode ser um indício de que as condições in vitro são capazes de alterar a transcrição de um ou mais genes que afetam o desenvolvimento embrionário precoce.

Já foi constatado que os espermatozóides portadores do cromossomo X ou Y apresentam diferenças na habilidade em fecundar os oócitos, talvez devido a diferenças na motilidade, tempo de viabilidade ou nos processos de capacitação e reação do acrossoma.⁴⁰ Alguns produtos gênicos ou proteínas carregados pelo espermatozóide portador do cromossomo Y e liberados no momento da fecundação, também podem determinar a diferença na velocidade de desenvolvimento entre os sexos. Tais produtos gênicos poderiam induzir a transcrição de outros genes, exclusivamente em embriões machos.⁴¹

No presente trabalho, foi observado que, na ausência de glicose, obteve-se um maior percentual de embriões machos quando foi utilizado o método do swim-up do que com o método do Percoll, considerando-se o número total de embriões produzidos, confirmando observações anteriores, de que o swim-up favorece a seleção de um maior número de espermatozóides portadores do cromossomo Y, determinando a produção de um maior percentual de embriões do sexo masculino.^18,19 Este aspecto pode ter implicações práticas no momento da escolha do método de seleção de espermatozóides para PIV, quando deve ser considerado que um desvio na proporção de machos pode ocorrer nos estágios mais avançados de desenvolvimento, sobretudo quando os espermatozóides são selecionados pelo método do swim-up e o cultivo dos zigotos é efetuado na presença de glicose.

A presença de glicose no meio de cultivo não afetou a proporção M:F no total dos embriões produzidos a partir do swim-up ou do Percoll mas determinou, com ambos os métodos, desvios na proporção M:F, com uma maior porcentagem de machos entre os embriões de desenvolvimento mais adiantado (rápidos) e uma menor porcentagem de machos entre os embriões de desenvolvimento mais atrasado (lentos). Portanto, a glicose exacerbou a diferença na velocidade de desenvolvimento entre os embriões machos e fêmeas.

Recebido para publicação: 01/07/2003

Aprovado para publicação: 25/03/2004

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Ago 2005
• Data do Fascículo
  Fev 2004

Histórico

• Aceito
  25 Mar 2004
• Recebido
  01 Jul 2003