Inoculação de Pseudomonas fluorescens e adubação NPK na composição química e contaminação fungo-fumonisina de milho

Inoculation of Pseudomonas fluorescens and NPK fertilization on chemical composition and fungal-fumonisin contamination of maize

ARMAZENAMENTO E PROCESSAMENTO DE PRODUTOS AGRÍCOLAS

Inoculação de Pseudomonas fluorescens e adubação NPK na composição química e contaminação fungo-fumonisina de milho¹

Inoculation of Pseudomonas fluorescens and NPK fertilization on chemical composition and fungal-fumonisin contamination of maize

Luciana P. Bernd^I; Thiago M. Souza^II; Mariana A. de Oliveira^III; Elisabete Y. S. Ono^IV; Claudemir Zucareli^V; Elisa Y. Hirooka^VI

^IIFRS. Campus Bento Gonçalves, RS, BR. E-mail: [e-mail] (Autor correspondente)

^IIFAPC/OSU. Stillwater, OK, USA. E-mail: [e-mail]

^IIICCA/UEL. Londrina, PR, BR. E-mail: [e-mail]

^IVDBBTEC/CCE/UEL. Londrina, PR, BR. E-mail: [e-mail]

^VCCA/UEL. Londrina, PR, BR. E-mail: [e-mail]

^VIDCTA/CCA/UEL. Londrina, PR, BR. E-mail: [e-mail]

RESUMO

Propôs,neste trabalho, avaliar o efeito da inoculação de sementes com Pseudomonas fluorescens e adubação NPK (nitrogênio, fósforo e potássio) na composição química e contaminação por fungo-fumonisina de grãos de milho. O delineamento experimental foi bloco casualizado em fatorial 2 x 3, correspondente à inoculação com P. fluorecens (não inoculada ou inoculada) e níveis de adubação NPK (0, 125 e 250 kg ha^-1, formulados 08-28-16) com 4 repetições. Os parâmetros avaliados foram composição química (proteína e cinzas), contaminação fúngica (bolores e leveduras) e fumonisinas B₁ (FB₁) e B₂ (FB₂). Os dados foram submetidos à análise de variância, comparação de médias pelo teste de Tukey e correlação de Pearson, pelo teste-t (p < 0,05). Inoculação com P. fluorescens e adubação mineral não apresentaram efeito individual sobre os parâmetros avaliados (p > 0,05). A interação entre fatores, com incremento no nível de adubação NPK e uso de P. Fluorescens, resultou em aumento no teor de cinzas e proteína (p < 0,05) e reduziu a contaminação por leveduras no grão, favorecendo o crescimento de Fusarium spp. (r = -0,40; p < 0,05). Os níveis de fumonisinas totais (FB₁ + FB₂) observados estão enquadrados nos limites máximos tolerados, estabelecidos por órgãos de vigilância sanitária.

Palavras-chave:Zea mays L., bactéria diazotrófica, adubação mineral, bromatologia, micotoxina

ABSTRACT

The study aimed to evaluate the effect of inoculation of seeds with Pseudomonas fluorescens and NPK fertilization (nitrogen, phosphorus and potassium) on chemical composition and contamination by fungal-fumonisin of maize grains. The experiment was conducted in randomized block design in factorial 2 x 3, corresponding to inoculation with P. fluorescens (non-inoculated or inoculated) and levels of NPK fertilization (0, 125 and 250 kg ha^-1, formulation 8-28-16), with 4 replications. The parameters evaluated were chemical composition (protein and ash), contamination by fungal (mold and yeast) and fumonisins B₁ (FB₁) and B₂ (FB₂). The data were subjected to analysis of variance, comparisons of means by Tukey test and Pearson correlation by test-t (p < 0.05). Inoculation with P. fluorescens and mineral fertilizer as an isolated factor did not affect the parameters evaluated (p > 0.05). The interaction between factors, increase in NPK level and use of P. fluorescens, resulted in increase in protein content and ash (p < 0.05), and reduction in contamination by yeast of the grain, favoring the growth of Fusarium sp. (r = -0.40, p < 0.05). The levels of total fumonisins (FB₁+FB₂) observed are above the maximum tolerated limit established by health surveillance agencies.

Key words:Zea mays L., diazotrophic bacteria, mineral fertilization, bromatology, mycotoxin

INTRODUÇÃO

Qualidade nutricional, facilidade de adaptação e aplicabi-lidade fazem, do milho, cereal de importância mundial com destaque para os Estados Unidos, China e Brazil, entre os maiores produtores do cereal, com 313,9 (35,5%), 192,8 (21,8%) e 73,0 (8,3%) milhões de toneladas na safra 2011/2012, respectivamente (USDA, 2013).

O milho, tal como outros cereais, é hospedeiro de espécies fúngicas produtoras de micotoxinas, como Fusarium verticillioides, principal contaminante do milho e produtor de fumonisinas, toxinas associadas aos feitos nocivos à saúde humana e animal (Norred, 1993). As fumonisinas, principalmente a FB₁, têm sido associadas às micotoxicoses em animais, como leucoencefalomalácia em equinos e síndrome de edema pulmonar em suínos. Em seres humanos têm sido relatados a ocorrência de câncer esofágico e defeitos do tubo neural de fetos (Waes et al., 2009). Em razão dos efeitos nocivos de Fusarium em culturas agrícolas, o controle de F. verticillioides e da produção de fumonisinas em milho tornou-se prioridade na investigação da segurança dos alimentos.

Objetivando redução da infecção por fitopatógenos em cereais, leguminosas e oleaginosas, as estratégias de controle são, em geral, baseadas no uso de pesticidas químicos (Kanampiu et al., 2002). Entretanto, o uso massivo desses produtos pode poluir as águas, degradar o solo e aumentar a resistência de insetos (Pereira et al., 2010).

As rizobactérias se apresentam com alternativa promissora de uso como agente de controle biológico, estando indiretamente relacionadas com a produção de metabólitos, como antibióticos, sideróforos e ácido hidrociânico, que diminuem o crescimento de fitopatógenos. Outrossim, favorecerem a planta pela produção de reguladores de crescimento e melhoria na absorção de nutrientes (Myoungsu et al., 2005).

Hernández-Rodríguez et al. (2008) relataram que rizobactérias (Burkholderia spp. e Pseudomonas fluorescens) exibiram efeito antagonista contra F. verticillioides M1 inoculado em milho. Pseudomonas fluorescens (cepas MKB 158 e MKB 249) e Pseudomonas frederiksbergensis (cepa 202) reduziram significativamente a gravidade de doenças causadas por Fusarium culmorum no trigo e na cevada (Khan & Doohan, 2009).

O milho, por apresentar alto potencial produtivo, é uma das culturas mais exigentes em fertilizantes, sobretudo nitrogenados e fosfatados. O suprimento inadequado de nitrogênio e fósforo é um dos fatores limitantes ao rendimento de grãos. Aliadas a isto, plantas de milho expostas ao estresse por falta de fertilidade do solo são altamente susceptíveis à infecção por fungos toxigênicos (Blandino et al., 2008).

Apesar da perspectiva de utilização de rizobactérias com o propósito de bioproteção e crescimento vegetal, ainda é imprescindível o fornecimento de nutrientes para a cultura uma vez que a inoculaçao das bactérias não substitui a adubação porém pode promover melhor absorção e utilização dos nutrientes disponíveis (Saubidet et al., 2002). Contudo, as respostas da planta em relação à interação desses fatores ainda são desconhecidas haja vista que a fertilidade natural do solo, ou os níveis de adubação fornecidos podem influenciar o comportamento das bactérias quanto à sobrevivência, reprodução e eficiência de atuação, alterando o desenvolvimento da planta, a produtividade e a qualidade do produto.

Desta forma, o trabalho objetivou avaliar, em condições de campo, o efeito da inoculação com Pseudomonas fluorescens e níveis de adubação NPK na composição química e contaminação por fungos e fumonisinas, em grãos de milho.

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido no período de segunda safra (safrinha) de 2009, no município de Londrina (23º 22' latitude Sul, 51º 22' longitude Oeste de Greenwich, com altitude de 580 m). O solo do local é caracterizado como Latossolo Vermelho eutroférrico e o clima da região, segundo a classificação de Köppen, é Cfa, ou seja, clima subtropical, com verões quentes, geadas pouco frequentes e tendência de concentração das chuvas nos meses de verão; apesar disto, sem estação seca definida (Caviglione et al., 2000). As temperaturas máximas e mínimas diárias, como a precipitação pluviométrica diária durante o período de condução do experimento, fornecidas pela estação metereológica do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) situada a 5 km da área experimental, estão apresentadas na Figura 1.

Foram avaliados três níveis de adubação NPK (0, 50 e 100% da indicação técnica para a cultura) e inoculação ou não de sementes com P. fluorescens. O delineamento experimental foi de bloco casualizado, em esquema fatorial 2 x 3 com quatro repetições. O híbrido de milho utilizado foi P30F35 (Pioneer^®) apresentando ciclo precoce, elevada capacidade de adaptação para a safrinha e alto potencial produtivo.

As parcelas foram constituídas de quatro linhas de cinco metros de comprimento, com espaçamento entre linhas de 0,9 m. Foram consideradas parcelas úteis as duas linhas centrais, desprezando-se 0,5 m das suas extremidades.

Previo à instalação do experimento foram coletadas amostras de solo para análise química da área experimental a 0-10 e 10-20 cm de profundidade (Tabela 1). Com base nesses resultados foi realizada a adubação do solo com nitrogênio, fósforo e potássio (N-P-K) no sulco da semeadura com o fertilizante formulado 08-28-16. Os tratamentos com 0, 50 e 100% da recomendação técnica corresponderam às quantidades de 0, 125 e 250 kg ha^-1 do formulado (EMBRAPA, 2012).

Anterior à semeadura, as sementes que receberam o inoculante à base de P. fluorescens foram tratadas na dose de 140 mL ha^-1 (100 mL de Rizofos liq Maíz^® e 40 mL de Premax R Protector^®). A semeadura foi realizada manualmente e, para atingir a densidade de aproximadamente 55 mil plantas ha^-1, realizou-se desbaste quando as plantas apresentavam três folhas expandidas.

Durante o desenvolvimento da cultura a área foi monitorada com relação à pragas e plantas daninhas. Constatou-se a necessidade de aplicação de Teflubenzuron na dosagem de 100 mL ha^-1 para controle de vaquinha (Diabrotica speciosa) devido à desfolha ocasionada pelo inseto adulto no estádio V3 (Ritchie et al., 1986) além de eliminação de plantas daninhas, realizada mediante capina manual.

A adubação nitrogenada de cobertura foi realizada aos 35 dias após a emergência das plântulas (estádio V6) com aplicação de 80 kg ha^-1 de N (ureia) em todos os tratamentos. A colheita da área útil da parcela foi realizada manualmente quando os grãos apresentavam aproximadamente 20% de umidade; após a limpeza as amostras foram moídas a 30 mesh, realizando-se higienização do equipamento entre amostras (álcool 70%) e armazenadas a -18 ºC até o momento de uso.

O teor de proteína bruta foi determinado pelo método de Kjeldahl (AOAC, 1995) realizando-se a digestão da amostra (MOD TE-40/25^®), com posterior destilação (MOD TE-036/1^®) e conversão do teor total de N em proteína pelo uso do fator 6,25. O teor de cinzas foi determinado segundo a pesagem dos resíduos da incineração em mufla (MOD 318D24^®) (IAL, 2008).

Para a contagem de bolores e leveduras 10 g de milho triturado (30 mesh) foram homogeneizados em 90 mL de água peptonada estéril 0,1% (v/v) e submetidos a diluições seriadas (10^-1 a 10^-6) em tubos contendo o mesmo diluente. Uma alíquota de 0,1 mL de cada diluição foi plaqueada em Ágar batata dextrose (BDA), acidificada a pH 4,0 com ácido tartárico. As placas foram incubadas a 25 ºC, durante 5 dias (MOD TE-39, Tecnal^®) e os gêneros fúngicos identificados de acordo com Samson et al. (1995).

A determinação de fumonisinas foi realizada por CLAE de conformidade com a metodologia adaptada por Ueno et al. (1993). Para extração, um volume de 30 mL de metanol: água (3:1, v:v) foi adicionado a 10 g de amostra triturada (30 mesh), seguido de agitação a 150 rpm, por 1 hora, a 10 ºC (MOD MA-830/A^®). Após filtração foi aplicado 1 mL do extrato bruto em coluna de troca aniônica (Sep-Pak accell plus QMA^®) previamente acondicionado com 5 mL de metanol seguido de 5 mL de metanol:água (3:1, v:v); em seguida, foram aplicados 6 mL de metanol:água (3:1, v:v) seguidos de 3 mL de metanol. As fumonisinas foram eluídas com 10 mL de solução de ácido acético 0,5% em metanol e o eluato seco a 40 ºC. O resíduo foi ressuspenso em 2 mL de metanol:água (3:1, v:v) secado sob gás N₂ a 40 ºC e novamente ressuspenso em 800 µL de metanol:água (3:1, v:v). Alíquotas de 200 µL foram secadas em gás N₂ a 40 ºC. Uma alíquota de 200 µL foi ressuspensa em 100 µL de acetonitrila:αgua (1:1), derivatizada com 200 µL de o-phtaldialdeνdo (40 mg de OPA, 1 mL de metanol, 5 mL de borato de sódio a 0,1 mol L^-1 e 50 µL de 2-mercaptoetanol) e as injeções foram feitas dentro de 1 min, em CLAE. Fumonisinas foram analisadas em sistema isocrático de fase reversa, por CLAE (bomba LC-10 AD e detector de fluorescência (RF 535^®) usando-se a coluna C₁₈ Luna^® 5 µ (4,6 x 250 mm). Foi utilizado comprimento de onda de 335 e 450 nm de excitação e emissão, respectivamente. A fase móvel consistiu de metanol: fosfato de sódio (CH₃OH:Na₂HPO₄) 0,1 M (80:20, v:v) ajustado com ácido o-fosfórico a pH 3,3, fluxo de 1 mL min^-1. O limite de detecção de FB₁ e FB₂ foi 27,5 e 35,3 ng g^-1, respectivamente.

Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) seguida do teste de comparação de médias por Tukey e correlação de Pearson, analisada pelo Teste-t (p < 0,05) utilizando-se o programa Statistica for Windows versão 6.0. Os valores referentes à contagem de bolores e leveduras foram convertidos à escala logarítmica, antes de serem submetidos à análise estatística.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O teor de proteína dos grãos de milho variou entre 9,64 e 14,19% (base seca); no entanto, os diferentes níveis de adubação, a presença/ausência de inoculação com P. fluorescens e a interação entre esses fatores, não exerceram efeitos significativos na porcentagem média de proteína nos grãos de milho (p > 0,05; Tabela 2).

Resultado similar foi relatado por Pommer & Sawazaki (1981) ao verificarem que o teor percentual de proteína na matéria seca dos grãos de milho não foi alterado significativamente pela adubação contínua com NPK em ensaio no município de Campinas, SP; por outro lado, em Mococa, SP, o teor proteico percentual foi influenciado significativamente pelo nitrogênio porém se sabe que as respostas à adubação são dependentes de condições climáticas, genótipo, do tipo de solo utilizado no experimento e da interação de fatores.

Rehman et al. (2011) observaram que os teores de proteína, amido e lipídeo no grão de milho foram menores quando não realizada adubação com NPK. Além disto, observou-se aumento no teor de proteína e amido, além de redução no teor de lipídeo no grão com o incremento na dose utilizada (300-150-150 kg NPK ha^-1).

As condições climáticas durante o período de condução do experimento não foram adequadas para a cultura do milho ocorrendo escassez hídrica e baixa temperatura com registros de geadas, conforme demonstrado na Figura 1.

A produção da cultura de milho pode ficar comprometida se a deficiência hídrica coincidir com o período de florescimento, fase que determina a quantidade de óvulos a serem fecundados e, por consequência, a produção de grãos (Cardoso et al., 2004). Outrossim, a mobilização de nutrientes para os grãos de milho pode ter sido afetada uma vez que a absorção e a translocação de minerais pela planta requerem umidade no solo (Oktem, 2008) elucidando, assim, a ausência de efeito significativo dos teores médios de proteína nos grãos de milho no presente estudo em diferentes teores de adubação com NPK (p > 0,05; Tabela 2).

Com relação ao teor de cinzas, observaram-se variação de 1,53 a 1,67% (base seca), a não inoculação/inoculação de sementes com P. fluorescens e os níveis de adubação NPK, avaliados isoladamente (Tabela 2) não surtiram efeitos significativos para os níveis médios de tal resposta (p > 0,05) embora a interação entre esses fatores tenha resultado em efeito significativo na porcentagem média de cinzas (p < 0,05; Tabela 2).

Segundo Ferreira et al. (2001) a disponibilidade de minerais no solo influencia a composição mineral foliar e esta, por sua vez, a composição mineral dos grãos de milho. Por outro lado, as rizobactérias inoculadas nas culturas exercem efeitos benéficos ao promover o crescimento vegetal em virtude sobretudo do aumento da disponibilidade de nutrientes para as plantas, pela solubilização de fosfato inorgânico (Rodríguez & Fraga, 1999) e pelo maior crescimento da raiz, favorecendo a absorção de nutrientes pelos grãos.

Conforme apresentado na Tabela 3, o milho apresentou contaminação natural por Fusarium spp. (2,0 x 10³ a 2,1 x10⁶ UFC g^-1), Penicillium spp. (não detectável a 1,0 x 10⁵ UFC g^-1), Aspergillus spp. (não detectável a 2,0 x 10⁴ UFC g^-1) e leveduras (não detectável a 9,0 x 10⁴ UFC g^-1). Contaminação inicial por Fusarium spp., Penicillium spp. e Aspergillus spp. também foi relatada por Moreno et al. (2009) em milho proveniente das safras de 2003 e 2004 da região Norte do Paraná e por Richard et al. (2007) investigando a micoflora de milho maduro em silo na França.

A contaminação média por fumonisinas (FB₁ + FB₂) nos grãos variou entre 0,30 a 0,54 µg g^-1 (Tabela 3). Embora alguns países, incluindo a Suíça e a Eslováquia, tenham os seus próprios regulamentos que definem os níveis máximos aceitáveis de fumonisinas em milho, não existe ainda uma legislação global para regular tais níveis.

O "Mycotoxin Committee of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticans" estabelece os níveis máximos tolerados entre 5 e 50 µg g^-1 (FB₁ + FB₂ + FB₃) em milho destinado à alimentação de equinos, suínos, bovinos e aves (IARC, 2002). Já o "Food and Drug Administration" (FDA) estabeleceu, como valores totais de FB₁ + FB₂ + FB₃ de até 4 µg g^-1 para o milho destinado ao consumo humano (Avantaggiato et al., 2002).

No Brasil e segundo a Resolução - RDC nº 7 de 18 de fevereiro de 2011, desde de janeiro de 2014 é de 5 µg g^-1 o limite máximo tolerado (LMT) de fumonisinas (FB₁ + FB₂) em grãos de milho destinado posteriormente ao processamento (Brasil, 2011). Desta forma, o milho avaliado no presente estudo, safra de 2009, apresentou níveis de fumonisinas totais (FB₁ + FB₂) enquadrados dentro dos limites máximos estabelecidos pelos órgãos nacional e internacional.

A contaminação reduzida de fumonisinas pode ser relativa à fertilidade natural do solo aliada à adubação nitrogenada fornecida, proporcionando uma adubação balanceada aumentando, então, a resistência das plantas. Blandino et al. (2008) relataram que, por falta de nitrogênio, o estresse aumenta significativamente a contaminação de milho por FB₁. Paralelamente, os baixos níveis de fumonisinas podem ter sido reflexo também das condições climáticas (restrições hídricas) durante o desenvolvimento da cultura no campo (Figura 1). Pereira et al. (2010) observaram que altos níveis de fumonisinas foram obtidos em milho, na safra de 2007-2008, com alta precipitação pluviométrica que ocorreu da floração à maturidade, em comparação com a safra de 2006-2007.

Os níveis de adubação, a presença/ausência de inoculação com P. fluorescens e a interação entre esses fatores, não se mostraram significativos para a contaminação fúngica e por fumonisinas; exceção foi encontrada para os resultados de contaminação por levedura, ocorrendo efeito significativo negativo da interação entre os níveis de adubação e inoculação demonstrando que a adubação com maiores níveis de NPK aliada à utilização da rizobactéria, dificultou a contaminação por parte desses microrganismos. As rizobactérias são conhecidas por colonizarem rapidamente a rizosfera e reduzir microrganismos nocivos, bem como fitopatógenos na superfície radicular (Rangajaran et al., 2003).

Em condições de campo, Khan & Doohan (2009) demonstraram a capacidade de duas cepas de P. fluorescens (MKB 158 e MKB 249) e de P. frederiksbergensis (MKB 202) na redução da contaminação de grãos de trigo por desoxinivalenol (DON), micotoxina produzida sobremaneira por Fusarium graminearum; os autores verificaram diminuição de 12 e 21% de DON em plantas borrifadas com suspensão de P. frederiksbergensis (24 h pré-inoculação do patógeno) e 74-78% com o uso das duas cepas de P. fluorescens.

Observou-se correlação significativa, porém negativa, entre a contagem de leveduras e Fusarium spp., indicando haver competição entre esses dois microrganismos (ρ = -0,40; p < 0,05; Tabela 4). Desta maneira, os resultados demonstram que, simultaneamente à redução da contagem de leveduras, com o aumento da dose de adubação e inoculação com P. fluorescens, há condições propícias ao crescimento de Fusarium spp.

Além de comprometer o desenvolvimento e o potencial produtivo da cultura do milho, supõe-se que as condições climáticas desfavoráveis (restrições hídricas e geadas, Figura 1) também afetaram a sobrevivência, a estabilidade, a multiplicação e a associação das rizobactérias com a cultura; desta forma, torna-se imprescindível dar continuidade aos estudos com P. fluorescens na cultura do milho em condições climáticas favoráveis, em que a adubação e a inoculação com P. fluorescens possam expressar seus possíveis efeitos sobre o desenvolvimento e nutrição da planta, proteção contra patógenos e, consequentemente, sobre a qualidade do grão.

CONCLUSÕES

1. A inoculação com P. fluorescens e a adubação NPK não resultaram em efeito individual significativo na composição química (proteína e cinzas), contaminação fúngica (bolores e leveduras) e fumonisinas B₁ (FB₁) e B₂ (FB₂) (p > 0,05).

2. O incremento na adubação NPK resultou, aliado ao uso de P. fluorescens, em aumento no teor de cinzas (p<0,05) e redução na contaminação do grão por leveduras (p < 0,05) o que favoreceu o crescimento de Fusarium spp. (r = -0,40; p < 0,05).

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico Tecnológico (CNPq) em associação com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), à Fundação Araucária, ao UGF - Fundo Paraná-SETI e à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) - Projeto Nanobiotecnologia nº 23, pelo suporte financeiro.

LITERATURA CITADA

Protocolo 355.13 – 06/11/2013

Aprovado em 04/07/2014

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Parte da Tese de Doutorado em Ciência de Alimentos do primeiro autor, apresentada à Universidade Estadual de Londrina, UEL, Londrina, PR

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Nov 2014
• Data do Fascículo
  Dez 2014

Histórico

• Aceito
  04 Jul 2014
• Recebido
  06 Nov 2013