Validação de metodologia analítica para a determinação de derivados do ácido o-hidroxicinâmico de Echinodorus grandiflorus

Validation of analytical methodology for the determination of derivatives of o-hydroxycinnamic acid from Echinodorus grandiflorus

Resumos

Este artigo descreve o desenvolvimento e a validação de método espectrofotométrico UV-Visível para quantificação de derivados do ácido o-hidroxicinâmico em folhas de Echinodorus grandiflorus. O método demonstrou ser linear (r² = 0,9974), preciso (DPR < 15%) na análise de matriz complexa e exata (recuperação = 107,56%).

Echinodorus grandiflorus; espectrofotometria UV-Vis; derivados do ácido o-hidroxicinâmico; controle de qualidade; validação de metodologia analítica

This paper describes the development and the validation of an UV-Vis spectrophotometric method for the quantification of derivatives of o-hydroxycinnamic acid in leaves of Echinodorus grandiflorus. The method showed to be linear (r² = 0.9974), precise (RSD < 15%) in the analysis of complex matrix and accurate (recovery = 107.56%).

Echinodorus grandiflorus; UV-Vis spectrophotometry; o-hydroxycinnamic acid derivatives; quality control; validation of analytical methodology

Validação de metodologia analítica para a determinação de derivados do ácido o-hidroxicinâmico de Echinodorus grandiflorus

Validation of analytical methodology for the determination of derivatives of o-hydroxycinnamic acid from Echinodorus grandiflorus

Lopes, G.C.^I; Santos, P.V.P.^I; Diciaula, M.C.^I; Blainski, A.^I; Gutierre, M.A.M.^II; Mello, J.C.P.^I,*

^IDepartamento de Farmácia

^IIDepartamento de Biologia, Universidade Estadual de Maringá, Avwnida Colombo, 5790, CEP: 87020-900, Maringá-Brasil

RESUMO

Este artigo descreve o desenvolvimento e a validação de método espectrofotométrico UV-Visível para quantificação de derivados do ácido o-hidroxicinâmico em folhas de Echinodorus grandiflorus. O método demonstrou ser linear (r² = 0,9974), preciso (DPR < 15%) na análise de matriz complexa e exata (recuperação = 107,56%).

Palavras-chave: Echinodorus grandiflorus, espectrofotometria UV-Vis, derivados do ácido o-hidroxicinâmico, controle de qualidade, validação de metodologia analítica

ABSTRACT

This paper describes the development and the validation of an UV-Vis spectrophotometric method for the quantification of derivatives of o-hydroxycinnamic acid in leaves of Echinodorus grandiflorus. The method showed to be linear (r² = 0.9974), precise (RSD < 15%) in the analysis of complex matrix and accurate (recovery = 107.56%).

Key words: Echinodorus grandiflorus, UV-Vis spectrophotometry, o-hydroxycinnamic acid derivatives, quality control, validation of analytical methodology

INTRODUÇÃO

Entre as inúmeras espécies vegetais de interesse medicinal encontram-se plantas do gênero Echinodorus pertencente à família Alismataceae que ocorrem, predominantemente, em terrenos brejosos e ácidos de todo o continente Americano. Em meio a quase 27 espécies de Echinodorus, as mais amplamente estudadas do ponto de vista químico e biológico são Echinodorus grandiflorus (Cham. & Schltdl.) Mich. e Echinodorus macrophyllus (Kunth) Mich., ambas conhecidas popularmente no Brasil como chapéu-de-couro (Lorenzi, 2000). Tradicionalmente as folhas dessas espécies têm sido empregadas pela população por propriedades medicinais, tais como diurética, depurativa e tônica (Lorenzi & Matos, 2002).

A composição química de folhas das espécies de Echinodorus avaliada até o presente sugere um conteúdo químico constituído por ácido trans-aconítico, glicosilflavonas e ácido hidroxitartárico (Schnitzler et al., 2007), sesquiterpenos (Pimenta et al., 2006) e, principalmente, diterpenos dos tipos clerodano, cembrano e labdano (Manns & Hartmann, 1993; Tanaka et al., 1997; Costa et al., 1999; Kobayashi et al., 2000a; b), substâncias estas presentes nos extratos avaliados e que, provavelmente, estão envolvidas nas atividades biológicas relatadas até o momento, tais como atividade anti-hipertensiva (Lessa et al., 2008), imunossupressora (Pinto et al., 2007), vasodilatadora (Tibiriçá et al., 2007), hipocolesterolemiante (Cardoso et al., 2005), antimicrobiana (Coelho de Souza et al., 2004), diurética (Ribeiro et al., 1988; Cardoso et al., 2003) e analgésica e antiinflamátoria (Cardoso et al., 2003; Dutra et al., 2006). No entanto, Garcia et al. (2010) demonstraram que a fração contendo derivados do ácido tartárico não possui atividade antiedematogênica. Pela importância terapêutica das espécies medicinais do gênero Echinodorus, estudos toxicológicos têm sido realizados (Lopes et al., 2000; Moreti et al., 2006; Da Silva et al., 2010) e sugerem a ausência de toxicidade nos critérios avaliados.

Apesar do grande número de estudos sobre a composição química e a atividade biológica de espécies do gênero Echinodorus, não foram encontrados na literatura dados de controle de qualidade físico-química sobre as espécies usadas para fins medicinais.

Considerando a necessidade do mercado e a falta de especificação de controle de qualidade, o presente trabalho destaca o desenvolvimento e a validação de metodologia analítica para a determinação de derivados do ácido o-hidroxicinâmico de Echinodorus grandiflorus (Cham. & Schltdl.) Mich.

MATERIAL E MÉTODO

Material vegetal: Folhas rasuradas de Echinodorus grandiflorus (Cham. & Schltdl.) Mich. foram fornecidas por Santosflora Comércio de Ervas Ltda (São Paulo, Brasil), com laudo da autenticidade fornecido pela empresa. A espécie vegetal foi identificada pelo Prof. Dr. Lin Chau Ming e a exsicata encontra-se depositada no Herbário da Universidade Estadual de Maringá sob o número HUEM 20810. A autenticidade da droga rasurada foi estabelecida por comparação pela Profª Drª Maria Auxiliadora Milaneze Gutierre e duplicatatas foram depositadas no Herbário da Universidade Estadual de Maringá. A droga vegetal foi moída em moinho de martelos (Tigre ASN5) e a granulometria definida.

Instrumentação: Medições espectrofoto-métricas foram realizadas em um espectrofotômetro Shimadzu UV-Vis, modelo PC-1650, com cubetas de quartzo QS.

Preparação da amostra: Pesaram-se cerca de 0,500 g da droga vegetal pulverizada (0,210 mm) (n=3), adicionaram-se 90 mL de álcool 50% (v/v) em balão de fundo redondo de 250 mL que foi submetido a refluxo por 30 min. Após esfriar, os extratos foram filtrados para balão volumétrico de 100 mL, lavando-se o balão de fundo redondo e o filtro com 10 mL de álcool 50% para o balão volumétrico. Por fim, o volume da solução foi ajustado com álcool 50% para o balão volumétrico (SM).

Determinação de derivados do ácido o-hidroxicinâmico: Adicionaram-se volumetricamente, para balão volumétrico de 10 mL, 1 mL da SM, 2 mL de ácido clorídrico 0,5 mol L^-1, 2 mL da solução reagente (10 g de nitrito de sódio R, 10 g de molibdato de sódio R em 100 mL de água destilada) e 2 mL de solução de hidróxido de sódio R 8%, ajustando o volume com álcool 50% para o balão volumétrico. A absorbância foi medida imediatamente após o preparo da solução no comprimento de onda de 525 nm, utilizando como solução de compensação, 1 mL da SM, 2 mL de ácido clorídrico 0,5 mol L^-1 e 2 mL de solução de hidróxido de sódio R 8% em balão volumétrico de 10 mL que foi completado com álcool 50% (European Pharmacopoeia, 2005). A análise foi realizada em triplicata.

A porcentagem do teor de derivados do ácido o-hidroxicinâmico expresso em verbascosídeo (absortividade específica=185) foi calculada pela expressão:

Em que:

TA = Teor de derivados do ácido o-hidroxicinâmico (%)

Abs = Absorbância da solução amostra;

m = massa da amostra utilizada no ensaio, em gramas, considerando a determinação de água.

Parâmetros de validação: Para a validação do método foram seguidas as determinações da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Brasil, 2003), com a construção da curva de analítica da amostra e a obtenção dos parâmetros analíticos: exatidão, precisão e reprodutibilidade interlaboratorial.

Linearidade: O teste de linearidade foi realizado através da construção de curva analítica da amostra. Foram empregadas cinco diferentes concentrações de amostra, 0,25; 0,40; 0,50; 0,75; 0,90 μg mL^-1. Os valores de absorbância medidos foram tratados por métodos estatísticos para a determinação da linearidade do método através do coeficiente de variação relativo e da análise de regressão linear. Todos os procedimentos foram realizados em triplicata.

Precisão: Para o estudo de repetibilidade (precisão intra-corrida) foi utilizada a concentração de 0,50 μg mL^-1 (concentração teste) em seis determinações, realizadas pelo mesmo analista, no mesmo laboratório, com a finalidade de verificar se os resultados encontravam-se dentro da diferença máxima aceitável. A precisão intermediária foi expressa através de variações do mesmo laboratório (equipamento), em dias diferentes e determinadas em três replicatas.

Exatidão: A exatidão do método foi determinada pela concentração do ativo na amostra em três diferentes níveis (0,75; 0,82 e 0,90 μg mL^-1). Foram realizadas três determinações de cada nível. Para a concentração teórica foi utilizada a média das análises de precisão da amostra na concentração de 0,50 μg mL^-1 (concentração teste), uma vez que se trata de um conjunto de substâncias (derivados do ácido o-hidroxicinâmico) e o resultado da exatidão foi dado pela expressão:

Ensaio interlaboratorial: Nesta avaliação participaram três laboratórios, sendo eles dos estados do Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Brasil): Departamento de Farmácia e Farmacologia, Universidade Estadual de Maringá, Paraná (UEM); Centro de Ciências da Saúde, Universidade do Vale do Itajaí, Santa Catarina (UNIVALI); Departamento de Farmácia Industrial, Universidade Federal de Santa Maria, Rio Grande do Sul (FATECIENS). Os estudos foram organizados e os protocolos foram criados de acordo com a norma ISO 5725 para determinar a repetibilidade e reprodutibilidade do método de medição.

As amostras foram especialmente preparadas para este fim no Laboratório de Farmacognosia da Universidade Estadual de Maringá, sendo distribuídas com a homogeneidade comprovada e material com granulometria de 0,210 mm. Cada laboratório recebeu uma amostra de 10 g e efetuou três replicatas.

Analise estatística: A análise estatística dos dados foi realizada através de análise de variância ANOVA, onde os resultados são considerados significativos quando a probabilidade é inferior a 5% (p<0,05) e pelo teste t de Student, com nível de significância α=0,05. A avaliação estatística dos resultados foi realizada através do Software Prisma^®, STATISTICA^® e Excel^®.

RESULTADO E DISCUSSÃO

Diversas técnicas podem ser empregadas para a detecção e doseamento de substâncias químicas em amostras vegetais, tais como a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia gasosa (CG), cromatografia líquida associada à espectrometria de massas (CL-EM), espectrofotometria UV/Vis, entre outras.

A espectrofotometria é um processo de medida que basicamente emprega as propriedades dos átomos e moléculas de absorverem e/ou emitirem energia eletromagnética em uma das regiões do espectro eletromagnético, sendo uma das técnicas analíticas mais amplamente empregadas, em função da robustez, custo relativamente baixo, e grande número de aplicações desenvolvidas (Lobinski & Marczenko, 1992).

O desenvolvimento de metodologias menos onerosas, mais facilmente exequível e que normalmente empregam menor aparato instrumental, requerem a realização de estudos de validação destas técnicas para cada espécie vegetal específica a fim de garantir a confiabilidade nos resultados obtidos (Pelozo et al., 2008; Silva-Corazza et al., 2010). As metodologias de ordem geral não têm apresentado resultados coerentes quando empregadas a diferentes famílias, gêneros e até espécies de plantas, que apresentam na composição os mesmos grupos de substâncias.

A faixa de trabalho do método em estudo foi determinada através do intervalo de concentrações das amostras usadas na composição da curva analítica e que, obrigatoriamente, apresentou linearidade.

No parâmetro de linearidade do extrato, os pontos da curva foram plotados em um gráfico de concentração (μg mL^-1) versus absorbância e obtida a curva analítica (Tabela 1) e a respectiva equação da reta pela regressão linear usando o método dos mínimos quadrados, bem como o correspondente coeficiente de correlação linear (Figura 1).

A construção da curva analítica através do método dos mínimos quadrados permite a quantificação do analito caso a curva obedeça a todos os critérios de desempenho. Portanto, a avaliação da homogeneidade na variância dos resíduos (homo/ heterocedasticidade) indica se em todo o intervalo de trabalho considerado o método dos mínimos quadrados pode ou não ser usado na análise de regressão da reta. De acordo com a planilha de cálculo desenvolvida para avaliação dos resultados analíticos e tratamento estatístico da linearidade do método, não houve falta de ajuste no intervalo estudado, demonstrando a linearidade do método. Ou seja, os resultados demonstraram que o método foi linear, sugerindo a eficiência no processo de extração empregado e na concentração do reagente colorimétrico utilizado na avaliação dos derivados do ácido o-hidroxicinâmico.

O resultado do teste de repetibilidade está representado na Tabela 2. A precisão intermediária, que avalia a variação de ensaios realizados em dias diferentes, mostrou valor de coeficiente de variação de 15%. Através do teste t de Student foi avaliada a possível existência de diferença estatisticamente significativa entre as médias obtidas para os ensaios realizados em dias diferentes. No entanto, o t calculado (-0,9363) foi menor do que o t tabelado (2,776), demonstrando não existir diferença estatisticamente significativa entre as médias, ou seja, os resultados obtidos expressam o mesmo valor no diferentes dias (p<0,05).

A exatidão foi verificada para três níveis de amostragem, baixa, média e alta. Os dados experimentais obtidos revelaram recuperação média de 107,56 ± 4,85 (4,51) e que o maior coeficiente de variação foi de 1,95% (Tabela 3). Os resultados do estudo de exatidão demonstram que possíveis variações da concentração de derivados do ácido o-hidroxicinâmico, em virtude de variações no padrão da matéria-prima, podem ser prontamente quantificadas pelo método, portanto, o método analítico desenvolvido é suficientemente exato.

A informação interlaboratorial é extremamente útil para estimar a incerteza da medição visto que reflete a variação do desempenho do método analítico em função de fatores extremamente importantes, alguns dos quais dificilmente estudados em ambiente intralaboratorial. Além disso, o benefício mais importante a ser usufruído pelos participantes é ter meios de se comparar com laboratórios similares e identificar problemas entre os mesmos quando, trabalhando isolados, não poderiam descobrir (Chui et al., 2009).

No protocolo criado para a análise interlaboratorial foi solicitado a cada laboratório que fizesse três leituras da amostra enviada. Além disso, regulamentou-se que os laboratórios participantes especificassem as dificuldades encontradas na execução do método e no procedimento de análise.

O resultado obtido para o ensaio interlaboratorial está descrito na Tabela 4. O método é reprodutível, uma vez que, através do ensaio interlaboratorial entre os participantes obteve-se desvio padrão relativo de 9,64%, sendo este valor inferior ao preconizado como limite máximo de significância segundo o Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos (RE 899/2003) (Brasil, 2003) para drogas com matriz complexa. Comparando-se os valores entre as Instituições UEM e FATECIENS o desvio padrão relativo foi de 3,00% e entre a UEM e UNIVALI o DPR foi de 10,31%.

O método desenvolvido cumpriu todos os parâmetros de validação e mostrou-se, rápido, viável, e de baixo custo. Assim, ele pode ser aplicado por farmácias de manipulação e laboratórios de pequeno porte para a rotina de análise de controle de qualidade de Echinodorus grandiflorus.

AGRADECIMENTO

Os autores agradecem a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e a Farmacopeia Brasileira. O estudo foi financiado pelo edital no 001/2007-ANVISA, Farmacopeia Brasileira. Agradecemos também a Profª Drª Melânia Palermo Manfron e Luciana Cátia Block pela colaboração no ensaio interlaboratorial.

Recebido para publicação em 10/07/2010

Aceito para publicação em 01/01/2011

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Dez 2012
• Data do Fascículo
  2012

Histórico

• Recebido
  10 Jul 2010
• Aceito
  01 Jan 2011