Estudo fitoquímico e avaliação in vitro da atividade anti-Trypanosoma cruzi cepa Y de Pilocarpus spicatus St. Hil. (Rutaceae)

Phytochemical study and in vitro evaluation of the anti-Trypanosoma cruzi Y strain activity of Pilocarpus spicatus A. St. Hil.

Estudo fitoquímico e avaliação in vitro da atividade anti-Trypanosoma cruzi cepa Y de Pilocarpus spicatus St. Hil. (Rutaceae)

Phytochemical study and in vitro evaluation of the anti-Trypanosoma cruzi Y strain activity of Pilocarpus spicatus A. St. Hil.

Silva, C.V.I,^*; Bomfim, F.C.C.^II; dos Santos, M.A.V. ^II; Velozo, E.S.^I

^IDepartamento do Medicamento, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, Rua Barão de Jeremoabo, s/n - Ondina, CEP: 40170-115, Salvador-Brasil

^IIFundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Rua Waldemar Falcão, 121, Candeal, CEP: 40296-710, Salvador-Brasil.

RESUMO

A investigação química da espécie Pilocarpus spicatus, popularmente conhecida como jaborandi e usada na medicina tradicional para doenças como estomatite, febre, bronquite e psoríase, teve por objetivo o isolamento e/ou identificação de substâncias ativas e a avaliação da atividade antiparasitária dos extratos frente às formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi. O estudo resultou na identificação de nove substâncias, tais como: tridecanona, 2-heptadecanona, espatulenol, aromadendreno, β-cariofileno, ácido 3α-hidroxitirucala-7,24-dien-21-óico, (+)-isoangenomalina, episesamina e sesamina. As estr uturas dos compostos foram elucidadas por análises espectroscópicas e comparação com dados da literatura. Os extratos hexânico e metanólico de folhas e raízes foram testados in vitro contra o Trypanosoma cruzi cepa Y e apresentaram atividade tripanomicida.

Palavras-chave: Rutaceae, Pilocarpus spicatus, atividade tripanomicida

ABSTRACT

The chemical investigation of the species Pilocarpus spicatus – popularly known as jaborandi and used in traditional medicine for diseases, such as stomatitis, fever, bronchitis and psoriasis – aimed to isolate and / or identify the active substances and evaluate the antiparasitic activity of the extracts against the Trypanosoma cruzi epimastigote forms. The study resulted in the identification of nine substances, such as tridecanone, 2-heptadecanone, spathulenol, aromadendrene, β-caryophyllene, 3α-hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid, (+)-isoangenomaline, episesamin and sesamin. The structures were elucidated by spectroscopic analysis and comparison with literature data. The hexane and methanol extracts from leaves and roots were tested in vitro against Trypanosoma cruzi Y strain and showed trypanocidal activity.

Keywords: Rutaceae; Pilocarpus spicatus; trypanocidal activity.

INTRODUÇÃO

Pilocarpus Vahl é um gênero neotropical de plantas arbustivas e arbóreas, com distribuição geográfica que se estende desde o sul do México e América Central - incluindo as Pequenas e Grandes Antilhas - até o sul da América do Sul. É composto por 17 espécies e 14 são encontradas exclusivamente no território brasileiro (Skorupa,1996; Skorupa e Pirani, 2004; Sawaya et al., 2011).

Algumas espécies de Pilocarpus são chamadas popularmente como jaborandi, nome derivado da língua tupi-guarani, que significa planta que causa saliva. Este gênero é constantemente estudado devido às propriedades farmacológicas como potente estimulante de secreção e diurético (Corrêa, 1969). As folhas de Pilocarpus são usadas em infusões para o tratamento de febre, estomatite, bronquite e psoríase (Holmsted et al., 1979).

O isolamento da pilocarpina, um alcaloide imidazólico, em 1875 e o uso na oftalmologia para glaucoma mostram a importância desta planta da flora brasileira (Pinheiro, 1997).

Além dos alcaloides, um grande número de metabólitos secundários é reportado no gênero Pilocarpus, tais como: as cumarinas (Amaro-Luis et al., 1990), os flavonoides (Bertrand et al., 2001), os hidrocarbonetos oxidados (Negri et al., 1998), os terpenos (Andrade Neto et al.,1994), e as lignanas (Souza et al., 2003).

Neste gênero, destaca-se Pilocarpus spicatus, espécie encontrada apenas no Brasil, nos estados de São Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo e Bahia. O estudo fitoquímico da espécie demonstrou a presença da cumarina chalepina, a qual apresentou atividade tripanomicida, além de vários terpenos, tais como: α e β-pineno, canfeno, Z,Z-farnesol, E-nerolidol e allo-aromadendreno (Andrade et al. 1994; 2002; Pavão et al., 2002; Santos e Moreno, 2004).

As atividades antibacterianas e imunomodulatórias do extrato de folhas desta espécie foram estudadas, bem como, a atividade dos extratos brutos de caule de P. spicatus e suas frações, frente à forma tripomastigota de T. cruzi com resultados superiores a 80% de inibição do parasita (Costa et al., 2009; Mafezoli et al., 2000).

Sabe-se que a composição química de espécimes de uma mesma espécie varia a depender das condições geográficas do local de coleta, bem como da parte estudada. Por este motivo, o presente trabalho teve por objetivo o isolamento, a identificação de substâncias ativas de um espécime de Pilocarpus spicatus coletado no semiárido baiano e a avaliação da atividade antiparasitária dos extratos frente à forma epimastigota do Trypanossoma cruzi cepa Y, agente etiológico da Doença de Chagas.

MATERIAL E MÉTODO

O espécime de Pilocarpus spicatus A. St. Hil. estudado foi coletado nas margens da estrada que liga o município de Piatã ao distrito Inúbia, Chapada Diamantina – BA, em 26 de Março de 2005. A identificação botânica foi realizada pela Profª Maria Lenise da Silva Guedes, curadora do Herbário Alexandre Leal Costa (ALCB), no Instituto de Biologia da Universidade Federal da Bahia e uma exsicata encontra-se catalogada no ALCB, sob o número 69167.

As raízes (1,40 Kg), caule (1,20 Kg) e folhas (186,32 g) de Pilocarpus spicatus foram secos, triturados e submetidos às extrações sucessivas com n-hexano e metanol (3 X 3,0 L/ solvente) em temperatura ambiente. O caule seco foi moído e macerado à frio com n-hexano e metanol por três vezes.

As folhas foram secas ao ar livre, trituradas e extraídas por três vezes com n-hexano e metanol (MeOH). Todos os extratos foram concentrados sob pressão reduzida.

O extrato hexânico das raízes foi separado por coluna cromatográfica filtrante, empacotada a seco com gel de sílica 60, utilizando-se como fase móvel misturas de diclorometano (DCM), acetato de etila (AcOEt) e MeOH em gradiente de polaridade crescente (n-hexano puro, n-hexano-AcOEt nas proporções: 99:1, 9:1, 8:2, 7:3 e 1:1, além de MeOH puro), obtendo-se 7 frações de aproximadamente 200 mL cada. Após a evaporação dos solventes, todas as frações desta coluna foram submetidas à cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), analisadas e agrupadas em 06 frações.

A fração 01 da coluna filtrante (6,23 g) apresentou-se como um óleo de coloração amarela e, quando analisada em cromatografia em camada delgada (CCD) e revelada na luz ultravioleta (UV) e em vapores de iodo apresentou uma única mancha, a qual, em seguida, foi submetida à cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG/EM), sendo possível a identificação da mistura das substâncias 1, 2, 3, 4 e 5.

A fração 02 (6,85 g) foi fracionada por coluna cromatográfica de sílica gel 60, utilizando como eluentes, misturas de n-hexano e acetato de etila em gradiente crescente de polaridade a começar com n-hexano puro e terminar com AcOEt puro. Foram obtidas 18 frações, que depois de analisadas por CCD, resultaram em 8 frações. Na fração 3 desta coluna foi determinada a substância 6.

A fração 04 (5,65 g) foi purificada por cromatografia em coluna (CC), utilizando como fase móvel solventes em ordem crescente de polaridade: n-hexano, DCM e MeOH. Este procedimento levou à obtenção de 40 frações, que foram reunidas em 9 frações, após análise com CCD. Da fração 04 desta coluna foi identificada a substância 7.

O extrato hexânico de caule, com massa de 31,20 g, foi separado em coluna de sílica gel 60, eluído com misturas de clorofórmio (CHCl₃) e MeOH nas concentrações: CHCl₃ puro, CHCl₃-MeOH – 99:1, 98:2, 97:3, 95:5, 9:1; 85:15, 7:3, 6:4, 1:1, 4:6, 3:7, 2:8, 15:85, 1:9, MeOH puro; resultando em um total de 16 frações . Destas, a fração 3 (1,13 g) foi usada para separação cromatográfica, utilizando misturas de n-hexano e DCM em gradiente crescente de polaridade, desta coluna foram obtidas 32 frações separadas a partir do acompanhamento da coluna com luz ultravioleta. Da fração 07 desta coluna (56,12 mg) foi isolada a substância 8.

Com o objetivo de isolar alcaloides, o extrato hexânico de folhas (15 g) foi tratado com uma solução de KOH 5% (p/v) e extraído com diclorometano. Esta fração resultou em resíduo de 4,50g, que foi submetido a coluna isocrática com clorofórmio/metanol (99:1) fornecendo 19 frações. A fração 01 obtida nesta coluna foi separada por uma CC em sílica gel 60, eluída com misturas de clorofórmio e acetato de etila em gradiente crescente de polaridade (n-hexano; 99:1, 98:2, 95:5, 9:1, 8:2, 7:3: 6:4, 1:1 e AcOEt), onde foram obtidas 10 frações. A fração 6 desta coluna foi identificada como o composto 9.

Os ensaios Anti-Trypanosoma cruzi foram realizados no Laboratório de Biomorfologia Parasitária (LBP) do Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz (Fiocruz). A cultura de formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi cepa Y foi mantida em meio LIT (Liver Infusion Tryptose) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF), numa temperatura de 28ºC. Uma concentração inicial de 5 x 10⁶ de parasitas/mL foi utilizada e incubada em placas de 24 poços, utilizando-se 40 µL de uma solução dos extratos com dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 10 mg mL^-1 e completando com 2 mL de meio/poço.

Os experimentos foram realizados em triplicata e para o controle do experimento foi utilizado DMSO e meio de cultura. O número de parasitas foi apurado após 96 horas de tratamento, por contagem em hemocitômetro de Neubauer.

Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de ¹H (300 MHz), ¹³C (75 MHz) e de melhoramento sem distorção por transferência de polarização a 135º (DEPT 135º) foram obtidos nos espectrômetros Varian Gemini 300 e Mercuri 300. Os cromatogramas foram revelados através de irradiação de lâmpada U.V. nos comprimentos de onda de 254 nm e 366 nm, vapores de iodo e reveladores químicos como Dragendorff, Lieberman-Burchard e solução de FeCl₃. Nas separações cromatográficas em coluna, foram usadas sílica gel 60 (70-230 mesh/ 0,063-0,200 mm/ 40-63 mm) das marcas Merck e Vetec. Os espectros de massas foram registrados por impacto eletrônico (70 eV) em CG-EM de marca Shimadzu, modelo GC-17A equipado com injetor e divisor de fluxo e partição da amostra de 1:50 e coluna capilar (30 m x 0,25 mm x 0,1 mm) e Tinj 60ºC com elevação de 3ºC min^-1 até 200ºC e depois 10ºC/min até 280ºC com tempo total de análise de 100 min. A quantificação dos constituintes foi obtida por integração eletrônica pela técnica de normalização. Na análise qualitativa, se utilizou as mesmas condições e, como detector, o espectrômetro de massas GC/MS - QP5000 (Shimadzu).

RESULTADO E DISCUSSÃO

Uma alíquota da fração 01, originada da coluna filtrante do extrato hexânico de raiz, foi injetada em cromatógrafo à gás acoplado à espectrometria de massa (CG/EM) nas condições de Adams. Após a determinação dos índices de retenção (IK) e comparação dos espectros de massa com dados da literatura foi possível a identificação dos sesquiterpenos ß-cariofileno (1) – IK1409, aromadendreno (2) - IK1441, espatulenol (3) – IK1484 e dos hidrocarbonetos oxidados 2-tridecanona (4) – IK1578 e 2-heptadecanona (5) – IK1700 (Adams, 1995).

A segunda fração da coluna filtrante do extrato hexânico de raiz forneceu 56,12 mg de um sólido branco amorfo. O espectro de RMN ¹H desta substância apresentou sete simpletos em δ 1,67; δ 1,58; δ 0,95; δ 0,93; δ 0,91; δ 0,88 e δ 0,72, indicando a presença de sete grupos metílicos na molécula e sugerindo tratar-se de triterpeno. O espectro de RMN ¹H apresentou ainda um simpleto largo em δ 3,50 atribuído ao H-3, em axial. O dupleto largo em δ 5,23 (J= 3,3 Hz) e o tripleto em δ 5,08 indicam a presença de próton vinílico em ligação dupla endo-cíclica Δ⁷, além de uma ligação dupla na cadeia lateral Δ²⁴, apontando para esqueleto do tipo tirucalano.

O espectro de RMN de ¹³C desta substância apresentou 30 sinais de carbonos, confirmando a estrutura triterpênica. Além do sinal em δ 181,65, referente ao carbono carboxílico, foram encontrados: sinais em δ 118,13 e δ 145,62 relativos aos carbonos olefínicos da insaturação entre carbonos C-7 e C-8, sinais em δ 132,09 e δ 123,65 dos carbonos olefínicos C-25 e C-24 da cadeia lateral e o sinal em δ 76,47, atribuído ao carbono carbinólico, com deslocamento característico de OH na posição equatorial. Através do experimento DEPT-135 foi possível confirmar a presença de 8 carbonos metínicos, 9 carbonos metilênicos e 7 metílicos. Estes dados comparados com aqueles fornecidos pela literatura identificam esta substância como ácido 3α-hidroxi-tirucala-7,24-dien-21-óico (Mora et al., 2001).

A fração 04 foi submetida à purificação por cromatografia em coluna clássica (C.C) com sílica gel, utilizando como fase móvel misturas de hexano, diclorometano e metanol, em ordem crescente de polaridade. Este procedimento forneceu 9,0 mg de um sólido branco. Os dados dos espectros de RMN de ¹H, ¹³C apresentados na Tabela 1 e o espectro de correlação homonuclear de H^1- H¹ (COSY), que confirmou as multiplicidades observadas no espectro de RMN de H¹ (Figura 1), foram comparados com a literatura (Yamaguchi et al., 1989) e possibilitaram a identificação da cumarina(+) – isoangenomalina.

Após o fracionamento por cromatografia em coluna, o extrato hexânico de caule forneceu 15,20 mg de uma substância 8 e foi identificada por RMN ¹H , ¹³C e DEPT-135 e dados da literatura (Hsieh et al., 2005) como a lignana sesamina, já isolada de outras espécies de Rutaceae (Tabela 2).

Uma massa de 36,0 mg da substância 9 foi obtida do extrato hexânico de folhas, após fracionamento. A análise dos dados de RMN ¹³C e ¹H e comparação destes com a literatura (Brown et al., 2001) permitiu a identificação da episesamina (Tabela 2).

Os testes de atividade anti- T. cruzi foram realizados com extrato hexânico e metanólico das folhas, e com o extrato metanólico das raízes. As amostras apresentaram atividade tripanomicida (Figura 2). Todos os extratos apresentaram inibição maior que 50%, sendo que o extrato hexânico das folhas inibiu 79%, o extrato metanólico das folhas inibiu 56% e o extrato metanólico das raízes inibiu 62% do crescimento de parasitas.

Em trabalho anterior, os extratos brutos de P. spicatus apresentaram inibição dos parasitas maior que suas frações, sugerindo o efeito sinérgico entre os componentes do extrato (Mafezoli et al, 2000). Apesar dos estudos, até o momento, não detectarem a presença da chalepina, piranocumarina que apresenta atividade inibitória da enzima GAPDH fundamental para o Trypanosoma cruzi (Pavão et al., 2002); a presença de outros componentes com possível ação anti- T. cruzi a exemplo de terpenos, cumarinas e lignanas pode explicar os resultados obtidos. Porém, estes resultados serão investigados para elucidar qual ou quais metabólitos presentes são responsáveis por tal atividade.

Figura 3

O presente trabalho com a espécie P. spicatus permitiu identificar 09 compostos: 2-tridecanona (1), 2-heptadecanona (2), espatulenol (3), aromadendreno (4), beta-cariofileno (5), o ácido 3a-hidroxi-tírucala-7,24-dien-21-óico (6) isoangenomalina (7), episesamina (8) e sesamina (9). As substâncias 6, 7, 8 e 9 ainda não haviam sido isoladas do gênero Pilocarpus, contribuindo, portanto, para a quimiotaxonomia deste gênero.

AGRADECIMENTO

Os autores agradecem a CAPES, FAPESB e CNPq pelas bolsas e apoios financeiros concedidos.

Recebido para publicação em 04/07/2010

Aceito para publicação em 29/04/2014

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Dez 2014
• Data do Fascículo
  Dez 2014

Histórico

• Recebido
  04 Jul 2010
• Aceito
  29 Abr 2014