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Revista Brasileira de Plantas Medicinais

Print version ISSN 1516-0572

Rev. bras. plantas med. vol.17 no.1 Botucatu Jan./Mar. 2015

http://dx.doi.org/10.1590/1983-084X/12_165 

Artigos

Determinação da capacidade antioxidante de produtos naturais in vitro pelo método do DPPH•: estudo de revisão

Determination in vitro of the antioxidant capacity of natural products by the DPPH•method: review study

G.L.S. OLIVEIRA1 

1Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Piauí, Praça da Liberdade, 1597, 64000-040, Centro, Teresina (PI) - Brasil.

RESUMO

Os antioxidantes podem ser de grande benefício para a melhoria da qualidade de vida, já que eles têm a capacidade de proteger um organismo dos danos causados pelos radicais livres, prevenindo ou adiando o início de várias doenças. Uma das técnicas atualmente utilizada para detectar a presença de compostos antioxidantes, é um método baseado na eliminação do radical livre estável 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH•). Este método é considerado fácil, preciso, rápido, simples, e econômico, sendo adequado para a determinação da capacidade antioxidante de substâncias puras e misturas. O objetivo deste artigo de revisão é fornecer informações sobre esse método. A pesquisa foi realizada usando o termo radical DPPH•, capacidade antioxidante-DPPH• e método DPPH• em periódicos, tais como: Pubmed, Wiley Online Library, ACS Publications, SpringerLink e ScinceDirect até janeiro de 2014.

Palavras-Chave: Antioxidantes; método DPPH•; capacidade antioxidante

MÉTODO DO DPPH•

Um amplo acervo de métodos está disponível na literatura científica para mensurar a capacidade antioxidante de vários tipos de substâncias. O interesse em avaliar a capacidade antioxidante é resultado de vários estudos sobre a importância dos antioxidantes em sistemas biológicos (Karadag; Ozcelik; Saner, 2009; Pérez-jiménez et al., 2008). Os antioxidantes podem ser de grande benefício para a melhoria da qualidade de vida, já que eles têm a capacidade de proteger um organismo dos danos causados pelos radicais livres, prevenindo ou adiando o início de várias doenças, como cardiovasculares, crônicas (câncer, aterosclerose, artrite reumática, hipertrofia muscular) e neurodegenerativas (Mal de Alzheimer) (Alam; Bristi; Rafiquzzaman, 2012; Halliwell e Gutteridge, 2007; Tinkel; Hassanain; Khouri, 2012; Borut e Raja, 2012).

Há um crescente interesse de pesquisadores no desenvolvimento de substâncias antioxidantes, principalmente a partir de produtos naturais como plantas. Assim, uma das técnicas atualmente utilizada para detectar a capacidade antioxidantes de compostos, é o método baseado na eliminação do radical livre estável 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH•) (Figura 1). A molécula de DPPH• é bastante conhecida por caracteriza-se como um radical orgânico livre estável e tem muitas vantagens, tais como uma boa estabilidade na ausência da luz, aplicabilidade, simplicidade e viabilidade (Deng; Cheng; Yang, 2011; Scherer; Godoy, 2009). Segundo Moon; Shibamoto (2009), o método DPPH• é utilizado em mais de 90% dos estudos de avaliação antioxidante de substâncias puras, misturas ou matrizes complexas.

O método DPPH• é bastante utilizado para avaliação da capacidade antioxidante, mas essa avaliação antioxidante não deve se basear apenas em uma única metodologia, sendo necessários outros métodos para caracterizar completamente um composto como antioxidante, como o método TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) ou ABTS•+ (ácido 2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico), ORAC (Oxygen radical absorbance capacity), FRAP (Ferric-Reducing Ability of Plasma), TRAP (Total Radical - Trapping Antioxidant Parameter), CUPRAC (Cupric ions Cu2+ reducing antioxidant power) e métodos de peroxidação lipídica (Ciesla et al., 2012; Moon; Shibamoto, 2009). A maioria das metodologias antioxidantes emprega basicamente o mesmo princípio, onde um radical sintético é gerado e a capacidade de uma amostra para eliminar ou neutralizar o radical é monitorada através de um espectrofotômetro UV/visível (Arnao, 2000).

FIGURA 1. Estrutura do radical livre estável DPPH• 

Existem dois tipos de mecanismos de reação que acontecem na determinação da capacidade antioxidante, ambos resultando de neutralização ou redução de um radical. Um desses mecanismos se baseia na transferência de elétrons (TE) e o outro na transferência de um átomo de hidrogênio (TAH) (Gülçin, 2012; Huang; Prior, 2005; Karadag et al., 2009; Amatatongchai et al., 2012). Ambos os mecanismo de transferência de hidrogênio e elétrons para o radical DPPH• podem ser vistos na equação 1 e 2, respectivamente;

Para Karadag et al (2009), é difícil diferenciar esses dois mecanismos de reação para o método DPPH• e segundo Huang et al. (2005), o principal mecanismo para o método DPPH• acontece pela transferência de elétron e que a transferência de hidrogénio é uma via de reação marginal (Figura 2). Além disso, o mecanismo de reação de transferência de hidrogênio entre o radical DPPH• e o antioxidante (AH) pode ser reversível, sendo que o DPPH-H poderá se converter na forma de DPPH• (Bondet; Brand-Williams; Berset, 1997; Foti; Daquino, 2006). Esse mecanismo pode ser observado na equação 3.

O método DPPH• é considerado fácil, altamente sensível, preciso, rápido, simples, econômico e o radical DPPH• não precisa ser gerada e o sistema de reação envolve somente o radical e o antioxidante (Figura 2) (Kedare; Singh, 2011; Moon; Shibamoto, 2009). O método DPPH• foi desenvolvido por Blois (1958) para determinar a atividade antioxidante de varias substâncias utilizando um radical livre estável semelhante, α-difenil-β-picrilhidrazila. Esse método foi depois modificado por Brand-Williams; Cuvelier; Berset (1995) para determinar o potencial antioxidante de compostos fenólicos e de amostras biológicas, simplificando a interpretação do resultado realizado por Blois (1958) e utilizando o termo concentração eficaz que inibi 50% da concentração inicial do radical DPPH• (CE50) para a interpretação dos resultados do método de DPPH•.

FIGURA 2. Mecanismos de reação entre o radical DPPH• e um antioxidante através da transferência de um átomo de hidrogênio. 

Esse método continua sofrendo muitas modificações ou adaptações e por isso vários procedimentos ou protocolos para o DPPH• têm sido relatados, incluindo diferentes solventes para dissolver o radical DPPH•, diferentes concentrações iniciais da solução de DPPH•, diferentes alíquotas das várias substâncias utilizadas e da solução inicial de DPPH•, diferentes tempos de reação com o radical DPPH• e diferentes absorbâncias também têm sido relatadas (Tabela 1).

TABELA 1. Modificações ou adaptações do método DPPH• 

Método DPPH•
Concentração inicial da solução de DPPH• Tempo de Reação (minutos) Quantidade da solução de DPPH• utilizado Tipos de solventes utilizados Absorbância Referência
0,1 mM 30 50 uL Metanol 515 nm (Yao et al., 2012)
0,5 mM 30 2 mL Metanol 517 nm (Alam et al., 2012)
6 × 10-5 M 1 e 5 975 uL Etanol 515 nm (Amira et al., 2012)
31,5 uM 0 a 120 1 mL Etanol 518 nm (Fagali; Catalá, 2008)
0,06 mM 0 a 9 3,9 mL Metanol 515 nm (Rufino et al., 2009)
3,8 mM 6 20 uL Etanol 520 nm (Moţ; Silaghi-Dumitrescu; Sârbu, 2011)
100 mM 20 700 uL Metanol 515 nm (Locatelli et al., 2009)
60 uM Monitorado a até o estado de equilíbrio (6 horas) 1,95 mL Metanol 515 nm (López-Giraldo et al., 2009)
0.4 mM/L Monitorado no tempo de 30 minutos, 2, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120 e 144 horas 0,5 mL Etanol 517 (Liang et al., 2010)
100 mM Monitorado ao longo de 5 h 2,9 mL Etanol 516 (Ordoudi et al., 2006)
0,3 mM A cada 10 minutos até 1 hora 1 mL Etanol 540 (Liu et al., 2008)
0,1 mM A cada 15 minutos até o estado de equilíbrio 2 mL Metanol 517 (Lu; Yeap Foo, 2000)
100 μM 30 2,95 Acetato de etila 520 (Prevc et al., 2013)
0.025 mM 180 20 mL Tampão fosfato de sódio em pH 7.0 517 (Niu et al., 2012)
1.55 × 10− 4 M 60 - Agua e etanol em uma mistura de 1/1 524 (Friaa et al., 2008)
3.8 mg/50 mL 30 0,975 mL Acetona, hexano e metanol 515 (Fernandez-Orozco et al., 2011)
0,4 mM 30 3 mL Solução metanólica 0,004% 517 (Liang; Jin; Liu, 2011)
0.05 mM 5 0,5 mL Solução aquosa de micela 528 (Noipa et al., 2011)

Os radicais livres contém elétron desemparelhado, sendo instáveis e bastantes reativos, mas o DPPH•, devido a sua estrutura química é um radical livre estável, pois possui três anéis aromáticos apresentando efeito de ressonância que é importante para estabilizar a carga eletrônica do radical DPPH•. A estabilização do radical DPPH• é atribuído também ao deslocamento do elétron desemparelhado sobre o radical DPPH•, nos três grupos de NO2 e nos dois átomos de nitrogênio, que são grupos que permitem o deslocamento de elétrons (FIGURA 3) (Martinez et al., 2006).

FIGURA 3. Estabilização do radical DPPH• pelo deslocamento do elétron desemparelhado. 

Por causa da localização do elétron livre ao longo da molécula de DPPH• (Figura 1 e 3), o radical possui à cor púrpura ou violeta com uma absorção em solução de etanol ou metanol a 515-520 nm (Deng et al., 2011). Uma substância antioxidante pode doar um átomo de hidrogênio ou transferir um elétron para a molécula de DPPH•, que aceita para se tornar uma molécula estável diamagnético originando a forma reduzida DPPH-H com a perda da cor violeta de acordo com o tempo para amarelo pálido ou violeta claro (Cieśla et al., 2012; Kedare; Singh, 2011; Amatatongchai et al., 2012; Musa et al., 2013). A mudança da cor violeta escuro para violeta claro, que resulta na diminuição da absorbância do radical DPPH•, pode ser monitorada por um espectrofotômetro UV/visível para a determinação capacidade antioxidante. Esse monitoramento tem que ser realizado sempre no escuro, por que a luz é um fator que interfere diretamente na reação do radical DPPH• com uma substância, acelerando a diminuição da absorbância e consequente alterando os resultados finais (Scherer; Godoy, 2009; Mishra; Ojha; Chaudhury, 2012).

Vários métodos de avaliação antioxidante in vitro e in vivo em amostras (extratos de plantas, alimentos e antioxidantes sintéticos) são utilizados pela comunidade cientifica. Dentre os métodos de avaliação antioxidante in vitro, o DPPH• é bastante utilizado e por isso, o objetivo deste artigo de revisão é fornecer informações desse método como princípios químicos, limitações, desvantagens e interpretação dos resultados. Esta revisão não será tão abrangente, já que apenas alguns tópicos importantes sobre o método DPPH• serão abordados, de modo que muitos artigos não serão citados. A pesquisa foi realizada usando o termo radical DPPH•, capacidade antioxidante-DPPH• e método DPPH• em periódicos como o da Pubmed, Wiley Online Library, ACS Publications, SpringerLink e ScinceDirect até janeiro de 2014.

Limitações e desvantagens da aplicação do método DPPH para avaliar a capacidade antioxidante

Desde a primeira aplicação até os dias atuais, o método DPPH• sofreu muitas modificações e consequentemente diferentes protocolos tem sido usado, tornando complicado fazer comparações com resultados de avaliação antioxidante por diferentes protocolos. Durante o desenvolvimento desta pesquisa nos periódicos da Pubmed, Wiley Online Library, ACS Publications, SpringerLink e ScinceDirect, os artigos que abordavam o método DPPH• utilizavam procedimentos bastantes diferentes (Tabela 1). Levando em consideração os diferentes protocolos desenvolvidos, confirma-se a necessidade de se padronizar o método DPPH•. Autores como Cieśla et al. (2012), Cheng; Moore; Yu (2006); Chandrasekar et al. (2006), Polášek et al. (2004), Sharma; Bhat (2009), Deng et al. (2011), Locatelli et al. (2009), Noipa et al. (2011) e Scherer; Godoy (2009) buscaram desenvolver procedimentos com o objetivo de padronização para avaliação da capacidade antioxidante pelo método DPPH•.

A padronização do método DPPH• elimina umas das principais desvantagens desse método, que seria as diferentes maneiras de interpretar e determinar a capacidade antioxidante de uma determinada substância. Nem sempre o mesmo método utiliza o mesmo procedimento e como consequência os diferentes resultados obtidos em varias pesquisas não podem ser comparados (Cheng; Moore; Yu 2006; Alam; Bristi; Rafiquzzaman, 2012; Pérez-jiménez et al., 2008). Segundo os trabalhos de Pérez-Jiménez; Saura-Calixto (2006), os resultados obtidos da capacidade antioxidante só deve ser comparada quando as medições foram feitas pelo mesmo procedimento, como a utilização do mesmo tipo de solvente.

Apesar de o método DPPH• ser fácil e simples de realizar existe alguns inconvenientes que limitam a sua aplicação, como por exemplo, o tipo de solvente utilizado para dissolver o radical DPPH•, que tem maior solubilidade em meios orgânicos como etanol e metanol (Arnao, 2000). Em meios alcoólicos, há uma maior facilidade da doação de um átomo de hidrogênio do próprio álcool (etanol ou metanol), que aumenta a solubilidade e a taxa constante de transferência de hidrogênio para o radical DPPH•, principalmente para o átomo de nitrogênio que está ligado aos dois anéis aromáticos. Assim, a carga eletrônica que antes estava se deslocando sobre o radical DPPH• (Figura 3), se restringe mais ao átomo de nitrogênio (N•a) localizado no meio do radical DPPH•, aumentando a reatividade do radical com uma substância antioxidante (AH) (Figura 4) (Tsimogiannis; Oreopoulou, 2004; Valgimigli et al., 1995).

FIGURA 4. Ligação química do metanol com o radical DPPH• e o aumento da localização do elétron desemparelhado no átomo de nitrogênio (N•a) do radical DPPH• 

Em meios aquosos a solubilidade é bem menor e pode interferir na avaliação da capacidade antioxidante, tornando o radical DPPH• pouco acessível para a reação com as amostras antioxidantes, afetando assim a transferência de elétron ou de hidrogênio (Karadag et al., 2009; Magalhães et al., 2008). Consequentemente, a cinética de reação do radical DPPH• com o antioxidante depende bastante do tipo de solvente, sendo que a influência do tipo de solvente é geralmente omitida em vários procedimentos de avaliação antioxidante (Dawidowicz; Wianowska; Olszowy, 2012). Noipa et al. (2011) desenvolveu um método DPPH• em solução aquosa usando agregados de surfactante ou sistemas de micelas, demonstrando que esse método pode ser usado para determinar a capacidade antioxidante tanto em meio orgânico quanto em meio aquoso.

Além do inconveniente do tipo de solvente, o método DPPH• sofre bastante influência da luz e do pH do solvente utilizado para dissolver o radical DPPH•, sendo que todo o procedimento de avaliação antioxidante tem que ser realizado no escuro (Magalhães et al., 2008; Gülçin, 2012; Cieśla et al., 2012). No trabalho desenvolvido por Ozcelik; Lee; Min (2003), foi observado que há uma perda da absorbância da reação entre a solução de DPPH• e o antioxidante, em torno de 20 a 35% na presença de luz. Essa perda ainda pode ser maior de acordo com o tempo. A presença de compostos não antioxidantes nas soluções testadas podem também interferir na avaliação antioxidante, alterando principalmente os resultados obtidos (Karadag et al., 2009; Kedare; Singh, 2011; Pérez-jiménez et al., 2008; Dawidowicz; Wianowska; Olszowy, 2012).

Como dito anteriormente, o DPPH• é um radical livre estável e não apresenta semelhança com os radicais livres mais reativos e não pode ser correlacionados a sistemas biológicos, ou seja, não é fisiologicamente relevante. (Huang et al., 2005; Prior; Wu; Schaich, 2005). O método DPPH• não é apropriado para medir a capacidade antioxidante de plasma e soro humano, porque as proteínas podem precipitar no meio da reação em solução alcoólica (Karadag et al., 2009). No entanto, o método DPPH• tem aplicação em soro desproteinado, sendo o estudo antioxidante em soro humano uma ferramenta importante (Chrzczanowicz et al., 2008; Magalhães et al., 2008; Martinez et al., 2006; Rysz et al., 2010).

Interpretação dos resultados experimentais da capacidade antioxidante pelo método DPPH.

Os resultados obtidos da capacidade antioxidante pelo método DPPH• têm sido apresentados de diversas formas e a falta de padronização dos resultados torna difícil comparar a capacidade antioxidante de uma mesma amostra, ou diferentes amostras (Deng et al., 2011). A maioria dos resultados é apresentada como valor de CE50 ou CI50, que é definida como a quantidade de antioxidante necessário para diminuir ou reduzir a concentração inicial do radical DPPH• em 50% (Brand-Williams et al., 1995; Chen; Bertin; Froldi, 2012). Este valor é calculado através da representação gráfica da inibição percentual do radical DPPH• em função da concentração do antioxidante (Brand-Williams et al., 1995). Apesar dos resultados antioxidante ser expresso como CE50, os estudos experimentais realizados por Eklund et al. (2005) e Villano et al. (2005) indicaram uma relação não linear entre a concentração do antioxidante e a atividade sequestradora do radical DPPH•, e por isso, a interpretação dos resultados antioxidante pelo valor da CE50 pode não ser adequado. Levando em consideração esse problema, Locatelli et al. (2009) desenvolveu um método para calcular com precisão o valor da CE50 de substâncias que inibi o radical livre DPPH•. Um software matemático foi desenvolvido para interpretar os dados e obter uma relação entre a atividade antioxidante e a concentração da amostra. Três diferentes modelos de regressão (Probit, Logit e Angular) foram consideradas para o cálculo dos valores do CE50. A regressão probit foi a mais eficaz para calcular os valores da CE50 de extratos naturais, alimentos e de compostos como ácido gálico e quercetina, mostrando altos coeficientes de correlação. Para Chen; Bertin e Froldi (2013), esse problema também poderia ser solucionado por meio de uma equação matemática adequada e por isso, em seu estudo, a CE50 da quercetina, catequina, ácido ascórbico, ácido caféico, ácido clorogênico e acetilcisteína foram determinados utilizando uma abordagem comparativa entre vários modelos de regressão nos programas de estatísticas GraphPad Prism(r) 5.01, BLeSq, OriginPro(r) 8.5.1, SigmaPlot(r)12, BioDataFit(r) 1.02 e IBM SPSS Statistics(r) Desktop 19.0., em que foi observado que na análise dos parâmetros de regressão, o GraphPad Prism(r) apresentou um melhor desempenho e uma menor variação em relação ao valor real da CE50.

Scherer; Godoy (2009) consideram que não existe uma avaliação da capacidade antioxidante universal para o método DPPH• e por isso desenvolveu um procedimento padrão através da fórmula que expressa os resultados da capacidade antioxidante como "Índice de atividade antioxidante-(IAA)", que pode ser calculada pela seguinte fórmula:

Scherer; Godoy (2009) consideraram que as amostras em análise apresentam atividade antioxidante pobre quando IAA for menor que 0,5, atividade antioxidante moderada quando IAA estiver entre 0,5 e 1,0, atividade antioxidante forte quando IAA estiver entre 1,0 e 2,0, e atividade antioxidante muito forte quando IAA for maior que 2,0. O IAA mostrou-se adequado para a interpretação dos resultados da capacidade antioxidante de extratos de plantas e de compostos puros, sendo que não houve diferença significativa no IAA quando diferentes soluções e concentrações do DPPH• e de várias substâncias foram utilizadas.

Deng et al. (2011) propôs a interpretação dos resultados da capacidade antioxidante de produtos naturais utilizando o método DPPH• como Unidade de Atividade Antioxidante (UAA). Sua definição é que um mol de radical DPPH• é completamente reduzida por um mol de antioxidante. Ele considera que UAA é adequado para comparar a capacidade antioxidante de extratos de plantas e de compostos puros, mesmo quando diferentes concentrações são usadas, o que torna este método muito prático e permite sua padronização.

Utilizando o método DPPH•, Sánchez-Moreno; Larrauri; Saura-Calixto (1998) classificaram a capacidade antioxidante de alguns compostos fenólicos de acordo com o comportamento cinético, baseado no valor de TCE50, como rápido quando o comportamento cinético for menor que 5 minutos, intermediário no intervalo entre 5 e 30 minutos, e lento quando é maior que 30 minutos. O tempo necessário para atingir o estado de equilíbrio com a CE50 é definido como TCE50. Levando em consideração o valor do TCE50, foi proposta uma fórmula para expressar a capacidade antioxidante de uma determinada substância, denominado de Eficiência Antiradical (EA), que pode ser calculado pela seguinte fórmula:

O valor da EA foi utilizado para classificar a capacidade antioxidante em baixa (quando o valor do EA é menor que 1 x 10-3), média (quando o valor do EA está entre 1 x 10-3 e 5 x 10-3), alta (quando o valor do EA está entre 5 x 10-3 e 10 x 10-3) e super alta (quando o valor do EA é maior que 10 x 10-3). Uma das desvantagens dessa interpretação, é que o AE e o TCE50 não foram totalmente definidos, sendo que o TCE50 foi determinado a partir de um gráfico secundário que leva em consideração o tempo do estado estacionário e a concentração do antioxidante. Logo, pode existir uma grande variação nos valores de TCE50, já que não há uma relação linear entre o tempo no estado de equilíbrio e a concentração do antioxidante (Cheng et al., 2006).

Mishra; Ojha; Chaudhury (2012) utilizaram quase o mesmo parâmetro estabelecido por Sánchez-Moreno; Larrauri; Saura-Calixto (1998), mas não utilizou o valor da TCE50 e obteve os resultados antioxidantes como Antioxidant Reducing Power (ARP), que pode ser calculada pela seguinte fórmula:

em que, ARP é definido como o inverso da CE50. Mishra; Ojha; Chaudhury (2012) também classificaram a capacidade antioxidante de determinados compostos considerando a cinética de reação do radical DPPH• com o antioxidante, nas categorias de rápido (tempo de reação menor que 30 minutos), médio (tempo de reação entre 30 minutos e uma 1 hora) e lento (tempo de reação maior que 1 hora).

A interpretação da absorbância de uma reação entre o radical DPPH• e um antioxidante pode ser determinado, de acordo com o tempo, como porcentagem de radical DPPH• remanescente, que pode ser calculado pela seguinte fórmula:

em que, (DPPH•)T=t é o valor da concentração do DPPH• após a reação com uma substâncias e (DPPH•)T=0 é o valor da concentração inicial da solução de DPPH• no tempo de 0 minuto (Brand-Williams et al., 1995; Dawidowicz et al., 2012; Huang et al., 2005; Karadag et al., 2009; Sánchez-Moreno; Larrauri; Saura-Calixto, 1998). Cheng et al. (2006) obteve a porcentagem de radical DPPH• remanescente, no tempo de 40 minutos, de acordo com a seguinte fórmula:

em que, Aamostra é o absorbância da reação entre a solução do radical DPPH• e a amostra antioxidante, Abranco é a absorbância da solução de solvente utilizado para preparar a amostra antioxidante, Acontrole é a absorbância do radical DPPH• com uma pequena alíquota do solvente utilizado para preparar a amostra, em substituição à solução da própria amostra em estudo.

A monitoração da diminuição da absorbância da reação entre a solução de DPPH• e uma amostra pode ser determinada também como porcentagem de inibição, sequestro ou eliminação do radical DPPH•, que pode ser obtido pela fórmula:

Cheng et al. (2006) estimou a porcentagem de inibição ou varrimento de radical DPPH• de acordo com a seguinte fórmula;

Dawidowicz et al. (2012) determinou a porcentagem de inibição do radical DPPH• através da seguinte fórmula;

Trabalhando com várias mistura de compostos antioxidantes puros, Liu et al. (2008) expressou a capacidade antioxidante como Efeito Sinérgico (ES). O ES significa que as misturas de dois ou três compostos podem resultar numa maior capacidade antioxidante do que o apresentado por cada composto individualmente (Castro et al., 2006). Para o cálculo do ES das misturas antioxidantes, Liu et al. (2008) obteve primeiro o valor da capacidade de eliminação experimental (CEE), que pode ser determinado pela seguinte fórmula;

Depois de obter o valor do CEE, Liu et al. (2008) calculou o valor da capacidade de eliminação teórica (CET), que é a soma do valor CEE (CEE1, CEE2, CEE3, CEE4) referente a cada composto antioxidante, pela seguinte fórmula;

Logo, o valor do ES de uma mistura de antioxidante pode ser determinado pela seguinte fórmula;

onde, uma mistura antioxidante apresenta efeito sinérgico se o valor do ES for maior que 1. Vale ressaltar que a capacidade antioxidante expressa como ES, é utilizado somente para misturas de compostos puros e por isso não é utilizado para extratos de plantas.

O valor da absorbância pode ser ainda interpolado em uma curva de dose-resposta de um antioxidante padrão, como ácido ascórbico ou Trolox, ácido tânico e ácido gálico e os resultados são expressos como concentração equivalente (Kedare; Singh, 2011; Magalhães et al., 2008; Arnao, 2000).

Soler-Rivas; Espín; Wichers (2000) sugeriu uma versão mais rápida e simples do método DPPH• em cromatografia de camada delgada (CCD). O surgimento de um halo branco ou manchas amareladas no fundo roxo ao redor da amostra colocada na CCD, quando se aplica o radical DPPH• sobre o CCD, se torna um indicativo da capacidade antioxidante. Cieśla et al. (2012) buscou desenvolver um procedimento padrão para o DPPH• em CCD, levando em consideração a influência do tipo de adsorvente, o tempo entre a imersão e a reação e o solvente utilizado para dissolução do DPPH•. Os resultados obtidos desse procedimento foram interpretados de forma qualitativa através de imagens e videoscans, obtidos por meio de um programa de processamento de imagem.

REFERENCES

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Received: December 03, 2012; Accepted: May 28, 2014

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