Efeito da fração não-oleosa doRicinus communisna biodistribuição comTecnécio-99m em camundongos

Effect of non-oily fraction ofRicinus communis on the bio distribution with Technetium-99m in mice

RESUMO

Ricinus communisé uma planta pertence à família Euforbiaceae. A partir de seus frutos é extraído o óleo de rícino e outra fração altamente tóxica (fração não-oleosa). Neste estudo, foi avaliado o efeito da fração não oleosa de R. communis(FNORC) na biodistribuição do Tc-99m em camundongos sadios e em animais transplantados com Sarcoma-180 (S180). Para avaliação da biodistribuição do Tc-99m, o percentual de atividade radioativa total injetada (ATI%) foi mensurada utilizando um contador gama. Os resultados mostraram que, em animais sadios, houve aumento da captação do Tc-99m após o tratamento com FNORC pelos rins, cérebro e estômago. Apenas houve diminuição da absorção deste radioisótopo nos músculos. Em animais com tumor, houve redução significativa da captação do Tc-99m no coração, pulmões e tumor, e foi observado o aumento da captação apenas nos rins. Foi observada também a diminuição da concentração das proteínas plasmáticas totais em animais com tumor após tratamento com FNORC e atividade antitumoral significativa. Diante desses dados, conclui-se que fração não oleosa de R. communis possui atividade antitumoral significativa, porém altera a biodistribuição do Tc-99m, fato este que pode resultar em falhas nos processos de diagnóstico por imagem que utilizem este radioisótopo como marcador.

Palavras-chave
Ricinus communis; Tecnécio-99m; Biodistribuição; Proteínas totais; Atividade antitumoral

ABSTRACT

Ricinus communis is a plant belonging to the Euforbiaceae family. From its fruits, it is extracted the castor oil and another highly toxic fraction (non-oily fraction). In this study, we evaluated the effect of the non-oily fraction of R. communis (NOFRC) on the bio distribution of Tc-99m in healthy mice and in animals transplanted with Sarcoma-180 (S180). To evaluate the bio distribution of theTc-99m, the percentage of the total injected radioactivity (% TIR) was measured through a gamma counter. There was an increase in the capitation of Tc-99m after the treatment with NOFRC in the kidneys, brain, and stomach of healthy animals. A decrease in the reception of this radionuclide was only found in the muscles. In animals with tumour, there was a significant reduction in the uptake of Tc-99m in the heart, lungs and tumour. An increase in the capitation was only observed in the kidneys. It was also observed a reduction in the total plasma protein concentration in animals with tumours after the treatment with NOFRC, besides significant antitumor activity. We concluded that there is antitumor activity in the NOFRC, but that it alters the biodistribution of Tc-99m, a fact which may result in failures in the diagnostic imaging process using this radioisotope as a marker.

Keywords
Ricinus communis; Technetium-99m; Biodistribution; Total Protein; antitumor activity

INTRODUÇÃO

Os radiofármacos são compostos sem ação farmacológica, que têm na sua composição um radionuclídeo e são utilizados na Medicina Nuclear para diagnóstico e terapia de várias doenças (Oliveira et al., 2000). Estes são utilizados em quantidades traços (traçadores radioativos) com a finalidade de diagnosticar patologias e disfunções do organismo. Em menor extensão, são aplicados na terapia de doenças, particularmente no tratamento de tumores radiossensíveis (Murphy, 2003). Cerca de 95% dos procedimentos realizados na rotina clínica de um serviço de medicina nuclear faz o uso de radiofármacos com finalidade diagnóstica, sendo 80% dos radiofármacos marcados com Tecnécio meta estável (Murphy, 2003; Oliveira et al., 2000).

O Tecnécio-99m (Tc-99m) é utilizado na medicina nuclear para procedimentos de diagnóstico com imagem funcional de diferentes órgãos e estudos experimentais na dependência de sua biodistribuição (Hwang et al., 2002; Holanda, 2005; Pujatti et al., 2005). O Tc-99m possui características físicas aceitáveis, como meia-vida de 6 horas, emissão de fóton gama de 140 keV, impacto ambiental desprezível e baixa exposição da radiação para o paciente (Govindan et al., 1996; Dantas et al., 2005; Oliveira et al., 2000; Souza et al., 2005; Valença et al., 2005). Entretanto, vários fatores podem interferir na marcação e biodistribuição dos radionuclídio, e dentre eles estão os produtos naturais (Braga et al., 2000; Bernardo-Filho et al., 2005; Dantas et al., 2005).

Ricinus communis L. (Euphorbiaceae) é uma planta tropical, conhecida popularmente como mamona, distribuída amplamente em todo o mundo (Waffa et al., 2014; Assis Junior et al., 2011). É originária da antiga Abissínia, hoje Etiópia, com hábito arbustivo, contendo diversas colorações de caule e folhas e frutos tipo racemos (cachos) (Taur et al., 2011). R. Communis é largamente cultivada na região semiárida do nordeste do Brasil principalmente para a produção de óleo não-comestível usado na fabricação de biodiesel (Pandey, 2013; Assis Junior et al., 2011; Taur et al., 2011; César & Batalha 2010). Porém, essa espécie também é utilizada largamente na medicina tradicional, principalmente na Índia, para o tratamento de inflamação, doenças hepáticas (Taur, et al., 2011), como contraceptivo (Nath et al., 2013) e como laxante (Feijão, 1963; Corrêa, 1984; Souza et al., 1994; Olsnes & Kozlov 2001; Olsnes, 2004). Estudos realizados em diversos laboratórios demonstram a atividade hepatoprotetora (Yanfg et al., 1987; Visen et al., 1992), anti-inflamatória (Ilavarasan et al., 2005), antidiabética (Poonam et al., 2008; Shokeen, 2008), laxante (Capasso et al., 1994), antifertilidade e contraceptiva (Nath et al., 2013; Sandhyakumary et al., 2003); larvicida (Wafa et al., 2014), diurética (Nath et al., 2011), antitumoral (Souza et al., 1994), anti-bacteriana (Khan et al., 1978), inseticida (Sharma et al., 1990), e antioxidante (Wafa et al., 2014; Ilavarasan et al., 2005) desta espécie.

Em experimentos realizados por Mousinho et al. (2008) foi encontrado que o extrato bruto da R. communis é capaz de alterar a captação in vitro do Tc-99m por hemácias, o que gera a proposição de que esta espécie pode interferir na biodistribuição e marcação do Tc-99m no organismo. Porém, apesar deste achado, não existem relatos na literatura de possível interação entre esta espécie e a biodistribuição do Tc-99m. Diante disto, foi avaliado o efeito da fração não oleosa do R. communis L. (FNORC) na biodistribuição do Tc-99m em camundongos normais e em animais com tumor, bem como seu possível efeito antitumoral.

MATERIAL E MÉTODO

Animais: Foi utilizado um total de 40 camundongos Swiss (mus musculus) (machos, 25-30 g), provenientes do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (Fiocruz/PE), Brasil. Os animais foram alojados em gaiolas com livre acesso a água e comida. Todos os animais foram mantidos sob um ciclo claro-escuro 12 h: 12h (luzes acesas às 06:00). Os animais foram tratados de acordo com os princípios éticos da experimentação animal de SBCAL (Sociedade Brasileira de Ciências de Animais de Laboratório), Brasil. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Uso de Animais da Universidade Federal de Pernambuco (n º 011553/2005).

Material vegetal: R. communis L. foi coletada em uma plantação localizada em Paulista, Pernambuco, Brasil, em 2005 e identificado pela Dra. Marlene Barbosa. Um espécime (No. 52116) foi depositado no Herbário Geraldo Mariz do Departamento de Biologia da Universidade Federal de Pernambuco.

Preparação da fração não oleosa: As sementes da R. communis L. (500g) foram trituradas e extraídas com solução hidroalcoólica 8:2 (v/v) por 2 dias. O extrato foi parcialmente evaporado utilizando um evaporador rotativo, até à formação de um material sólido. Posteriormente o material foi filtrado sob vácuo e nele foi adicionado acetona (300 mL), para retirada do óleo de rícino. O extrato foi evaporado utilizando um evaporador rotativo, até à formação da fração não oleosa da R. communis (200 mg).

Obtenção do tecnécio-99M (TC-99M): O Tc-99m foi obtido, no momento de sua utilização na forma de pertecnetato de sódio pelo gerador de ⁹⁹Mo/^99m Tc, no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco.

Ensaio de biodistribuição

Camundongos normais: Neste estudo foram utilizados 20 camundongos divididos em quatro grupos: grupo controle (solução salina 0,9% i.p., diariamente) e três grupos tratados com a fração não oleosa de R. communis L. (FNORC) (0,1, 0,3 e 1,0 mg/kg, i.p., diariamente). Os animais foram tratados durante 7 dias consecutivos. No 8º dia foi administrado em todos os animais o pertecnetato de sódio e cloreto estanoso (Tc-99m -0,1 mL, i.p.) com atividade radioativa inicial de 100 μCi (37 x 10⁵ Bq). Após 20 minutos da administração do Tc-99m, os animais foram sacrificados e retirados os seguintes órgãos: coração, pulmão, pâncreas, estômago, fígado, intestino grosso e delgado, rins, músculo, osso e cérebro. Uma amostra de sangue foi retirada dos animais por punção cardíaca sem o uso de anticoagulante. O percentual de atividade radioativa total injetada (%ATI) foi mensurada utilizando contador gama (modelo DPC - Gambyt CR. Série: 95-3/1122). O experimento foi realizado em triplicata.

Camundongos portadores de tumor: Os ensaios de atividade antitumoral foram realizados de acordo com a metodologia descrita por Stock (1965); Funayama & Kumaiyama (1993). Camundongos com tumor do tipo Sarcoma180 (S180) foram sacrificados, os tumores foram removidos e fragmentados em solução de Ringer-Lactato contendo antibiótico (80 mg/mL de Gentamicina). Fragmento tumoral com cerca de 3 mm de diâmetro foi transplantado em quinze camundongos machos Swiss (mus musculus) via subcutânea, na região axilar, segundo a técnica descrita por Stock (1965); Funayama & Kumaiyama (1993).

Estudo da atividade antitumoral da FNORC e biodistribuição do tecnécio-99m em camundongos portadores de tumor: Após 48 horas do implante tumoral os camundongos foram divididos em três grupos de cinco animais: grupo controle (solução salina 0,9%, i.p.) e dois grupos tratados com FNORC (1,0 e 3,0 mg/kg, i.p., diariamente). Os animais foram tratados durante 7 dias consecutivos. No 8º dia foi administrado em todos os animais o Tc-99m (0,1 mL, i.p.) com atividade radioativa inicial de 100 μCi (37 x 10⁵ Bq). Após 20 minutos da administração do tecnécio-99m, os animais foram sacrificados e deles foram retirados os seguintes órgãos: coração, pulmões, rins, músculo e tumor. Amostras de sangue foram obtidas por punção cardíaca para análise de proteínas totais. Foi realizada a contagem do percentual de atividade radioativa total injetada (%ATI) utilizando o contador gama (modelo DPC-Gambyt CR. Série: 95-3/1122). O experimento foi realizado em triplicata. O índice de inibição tumoral foi calculado através da fórmula de Machon et al. (1981):

Análise das proteínas totais:Após a formação completa do coágulo dos sangues coletados dos animais com tumor, o soro foi retirado para quantificação das proteínas totais. A quantidade de proteínas totais foi mensurada utilizando a técnica do biureto, utilizando o kit da Katal^® seguindo as instruções do fornecedor. A absorbância foi lida em 545 nm utilizando espectrofotômetro digital (Instrutherm^®) da Universidade Federal Rural de Pernambuco.

Análise estatística: Os dados foram apresentados como média ± SEM. As diferenças entre os grupos experimentais foram comparadas pelo teste T-Student (P≤0,05), utilizando Microsoft Excel^®.

RESULTADOS

Como pode ser observado na Tabela 1, houve um aumento significativo (p≤0,05) da captação (%ATI) do Tc-99m nos animais normais que foram tratados com FNORC nos seguintes órgãos: rins (0,1 e 1,0 mg/kg, i.p.), estômago (0,3 mg/kg, i.p.) e cérebro (1,0 mg/kg) (p≤0,05). Contudo, foi observado uma diminuição da %ATI no músculo dos animais tratados com FNORC (0,3 mg/kg, i.p.) (p≤0,05). Nos demais órgãos, não foram observados alterações significativas (p>0,05).

TABELA 1
Efeito da Fração Não-Oleosa da R. Communis (FNORC) na biodistribuição do Tc-99m em camundongos swiss sadios. Os animais foram tratados durante 7 dias consecutivos com FNORC (0,1, 0,3 e 1,0 mg/kg, i.p., diariamente). No 8º dia foi administrado em todos os animais o pertecnetato de sódio e cloreto estanoso (Tc-99m - 0,1 mL, i.p.) com atividade radioativa inicial de 100 μCi (37 x 10⁵ Bq). Após 20 minutos da administração do tecnécio-99m, os animais foram sacrificados e deles foram retirados os órgãos. Uma amostra de sangue foi retirada dos animais por punção cardíaca sem o uso de anticoagulante. O percentual de atividade radioativa total injetada (%ATI) foi mensurada utilizando contador gama (modelo DPC - Gambyt CR. Série: 95-3/1122). * = p≤ 0,05. n = 10.

Órgãos	Controle	FNORC	FNORC	FNORC
	(salina 0,9%)	(0,1 mg/kg)	(0,3 mg/kg)	(1,0 mg/kg)
Coração	0,162 ± 0,048	0,186 ± 0,069	0,166 ± 0,015	0,160 ± 0,048
Pulmão	0,111 ± 0,072	0,072 ± 0,03	0,077 ± 0,065	0,150 ± 0,072
Pâncreas	0,727 ± 0,285	0,739 ± 0,366	0,896 ± 0,349	0,628 ± 0,285
Estômago	0,21 ± 0,268	0,344 ± 0,228	0,488 ± 0,204*	0,408 ± 0,268
Fígado	2,058 ± 1,183	1,631 ± 0,501	1,483 ± 1,077	2,138 ± 1,183
I. Grosso	0,215 ± 0,157	0,093 ± 0,095	0,196 ± 0,113	0,312 ± 0,157
I. Delgado	0,318 ± 0,209	0,183 ± 0,086	0,195 ± 0,057	0,316 ± 0,209
Rins	1,925 ± 0,964	1,301 ± 0,524*	1,604 ± 1,148	2,98 ± 0,964*
Músculo	0,465 ± 0,167	0,396 ± 0,05	0,263 ± 0,053*	0,621 ± 0,167
Osso	0,025 ± 0,011	0,031 ± 0,018	0,028 ± 0,027	0,021 ± 0,011
Cérebro	0,014 ± 0,011	0,019 ± 0,009	0,018 ± 0,008	0,03 ± 0,011*

• Valores em: %ATI (média ± DP )

Quando analisado os efeitos da FNORC nos camundongos transplantados com o tumor Sarcoma-180 (Tabela 2), pode-se observar uma redução significativa (p≤0,05) do %ATI no coração, pulmão, tumor (1,0 mg/kg e 3,0 mg/kg, i.p.). Porém, foi observado aumento da captação do Tc-99m nos rins desses animais (1,0 mg/kg, i.p.). Também foi observado diminuição na concentração de proteínas totais destes animais em 34 % nos animais tratados com FNORC (1,0 e 3,0 mg/kg, i.p.), quando comparado ao controle (Figura 1).

TABELA 2
Efeito da Fração Não-Oleosa da R. Communis (FNORC) na biodistribuição do Tc-99m em camundongos transplantados com tumor Sarcoma - 180. Fragmentos de 3 mm de tumor foram inoculados na região axilar dos animais e após 7 dias de tratamento com FNORC (0,3 e 1,0 mg/kg, i.p., diariamente) foi administrado, em todos os animais, o pertecnetato de sódio e cloreto estanoso (Tc-99m - 0,1 mL, i.p.) com atividade radioativa inicial de 100 μCi (37 x 10⁵ Bq). Após 20 minutos da administração do tecnécio-99m, os animais foram sacrificados e tiveram seus órgãos retirados. Uma amostra de sangue foi retirada dos animais por punção cardíaca sem o uso de anticoagulante. O percentual de atividade radioativa total injetada (%ATI) foi mensurada utilizando contador gama (modelo DPC - Gambyt CR. Série: 95-3/1122). * = p≤ 0,05. n=10.

Órgãos	Controle	FNORC	FNORC
	(salina 0,9%)	(0,3 mg/kg)	(1,0 mg/kg)
Coração	0,677 ± 0,161	0,045 ± 0,012	0,08 ± 0, 1*
Pulmão	0,59 ± 0,162	0,175 ± 0,037*	0,084 ± 0,011*
Rins	0,703 ± 0,097	1,086 ± 0,224*	0,167 ± 0,026*
Músculo	0,304 ± 0,16	0,198 ± 0,066	0,417 ± 0,167
Tumor	6,019 ± 0,924	1,147 ± 0,267*	1,191 ± 0,327*

• Valores em: %ATI (média ± DP)

FIGURA 1
Determinação de proteínas totais de camundongos transplantados com tumor tratados com a fração não-oleosa da R. communis nas doses de 1,0 mg/kg (gr1) e 3,0 mg/kg (gr2).Fragmentos de 3 mm de tumor foram inoculados na região axilar dos animais e após 7 dias de tratamento com FNORC (0,3 e 1,0 mg/kg, i.p., diariamente) o sangue foi retirado. Após a formação completa do coágulo o soro foi retirado para quantificação das proteínas totais. A quantidade de proteínas totais foi mensurada utilizando a técnica do biureto. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão com Teste-T-Student, *p≤0,05.

Quando avaliado o índice de inibição tumoral, a FNORC foi capaz de reduzir em 29,59 e 74,55% (1,0 e 3,0 mg/kg, i.p., respectivamente) o tamanho do tumor, demonstrando um potencial antitumoral.

DISCUSSÃO

Há evidências que muitas drogas podem alterar a biodistribuição ou a farmacocinética dos radiofármacos (Hesslewood & Leung, 1994; Murugesan, 2001; Gomes et al., 2002; Bernardo-Filho et al., 2005), podendo alterar a qualidade dos diagnósticos por imagem que utilizam os radiofármacos como marcadores. Um exemplo é o antineoplásico vincristina, alcaloide utilizado para o tratamento de diversos cânceres, como leucemia, câncer de pulmão e mama. Este alcaloide possui forte interação medicamentosa entre radiobiocomplexo, promovendo aumento da captação do radiobiocomplexo 99mTc-DTPA (ácido dietileno) pelo timo, ovário, útero, baço, rins, coração, estômago, pulmão, fígado e ossos (Brito et al., 1998). A vincristina também é capaz de alterar a biodisponibilidade do 99mTc-fitato em camundongos Balb/c (Mattos et al, 1999a); diminuir a absorção de 99mTc-MDP (ácido metilenodifosfónico) pelo útero, ovário, baço, timo, nódulos linfáticos (inguinal e mesentheric), rim, fígado, pâncreas, estômago, coração, cérebro e osso in vivo (Mattos et al., 1999b); reduzir a absorção de 99mTc-PYP (pirofosfato de sódio) pelo baço, timo, nódulos linfáticos (inguinal e mesentérico), rim, pulmão, fígado, pâncreas, estômago, coração e cérebro, porém aumentando a absorção do tecido ósseo e da tiróide em animais (Mattos et al., 1999b) e, por fim, diminuir a absorção do 99mTc-GHA (ácido glucoheptónico) pelo útero, ovário , baço, timo, nódulos linfáticos (inguinal e mesentérico), do rim e do coração (Mattos et al., 2001).

De forma semelhante a vincristina, neste estudo foi possível observar que a fração não-oleosa da Ricinus communis (FNORC) altera a biodistribuição do Tc-99m no estômago, rim e cérebro de animais sadios, aumentando a sua captação nestes órgãos e diminuindo nos músculos. Possivelmente, essa alteração na captação pode ser explicada por uma possível interação entre a FNORC e o sítio de ligação do pertecnetato de sódio no tecido, facilitando sua ligação ou até mesmo deixando-a mais estável. Em estudos realizados anteriormente por Mousinho et al. (2009), foi encontrado que o extrato bruto da R. communis compete com o Tc-99m na ligação com as hemácias, deixando um porcentual maior livre. Uma fração maior de Tc-99m na forma livre na corrente sanguínea pode resultar num aumento da força molar entre o compartimento intravascular e tecidual, com consequente aumento da passagem do radioisótopo para dentro dos tecidos, mecanismo o qual pode explicar o aumento da captação do Tc-99m nos tecidos dos animais tratados com FNORC.

Porém, a diminuição observada na absorção do Tc-99m pelos músculos dos animais pode ser explicada por uma possível competição entre a FNORC e o Tc-99m no transporte do isótopo para o interior de tecido. Além disso, Mousinho et al. (2008) demonstrou que o extrato de R. communis promove alterações inespecíficas na membrana celular, apesar de não provocar danos morfológicos graves na célula. Esta ação sobre a membrana celular também pode estar relacionada com a dificuldade de absorção do Tc-99m pelas células musculares.

Entretanto, quando avaliado alterações na biodistribuição do Tc-99m em animais transplantados com tumor Sarcoma - 180 foi encontrado um perfil diferente. Quando os animais foram tratados com FNORC foi observada uma redução da captação do Tc-99m no coração, pulmão e inclusive no próprio tumor. Possivelmente essa diferença pode ser explicada por possíveis alterações metabólicas ocorridas pela FNORC em animais transplantados com tumor. Este pensamento é embasado quando se observam alterações na concentração proteica sérica, nas quais ocorrem uma diminuição destas após o tratamento com a FNORC nos animais com tumor. Essas alterações podem repercutir tanto no transporte de drogas, ao longo da corrente sanguínea, como na própria eficácia da marcação do Tc-99m. Em contrapartida, quando avaliado o efeito da FNORC no crescimento tumoral destes animais, pode ser observado que houve uma diminuição do tamanho do tumor em 29,59 e 74,55% para as concentrações de 1,0 e 3,0 mg/kg, respectivamente, o qual corrobora com estudos que comprovam o potencial antitumoral desta espécie (Souza et al., 1994; Dethiollaz, 2003), tornando esta espécie como um grande potencial para o desenvolvimento de novos protótipos antitumorais.

Diante de todos esses achados, a evidência de que a FNORC pode alterar a biodistribuição do Tc-99m pode ser de grande relevância no que concerne à interpretação de imagens cintilográficas. Por outro lado, deve-se considerar que os achados experimentais obtidos nesse trabalho foram em condições experimentais controladas e realizadas em camundongos.

CONCLUSÃO

De acordo com os resultados obtidos nesse estudo pode-se especular que a fração não-oleosa da R. Communis (FNORC) é capaz de alterar a biodistribuição do Tc-99m, além de possuir um potencial antitumoral significante. Embora os resultados tenham sido obtidos em animais, sugere-se precaução com os exames em medicina nuclear em pacientes que utilizem desta espécie como medicamento.

AGRADECIMENTOS

À Vitor Ferreira pela imensa colaboração na formatação deste artigo e ao Victor Araújo pela correção gramatical.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Set 2015

Histórico

• Recebido
  19 Set 2013
• Aceito
  12 Ago 2014