INTRODUÇÃO

A presença de microrganismos nos alimentos pode, além de reduzir a vida de prateleira, causar toxinfecções nos consumidores (^{Melo et al., 2005}). Bactérias do grupo dos coliformes fecais são utilizadas como indicadores de condições higiênico-sanitárias de água e alimentos. A Escherichia coli é uma bactéria Gram-negativa que faz parte dos coliformes termotolerantes e ocorre em fezes de animais de sangue quente, assim como o homem (^{Silva et al., 2014}). A presença de microrganismos indicadores como Escherichia coli em produtos processados indica, provavelmente, contaminação posterior ao processamento e pode sugerir uso de práticas inadequadas de manipulação e higiene (^{Lima et al., 2007}).

Apesar de E. coli serem largamente consideradas como comensais, alguns isolados têm o potencial de provocar infecções. E. coli patogênicas podem ser divididas em três subgrupos principais dependendo de sua patogenicidade: comensais ou não patogênicas, E. coli patogênicas intestinais e E. coli patogênicas extraintestinais. As E. coli patogênicas intestinais incluem diferentes patotipos, dos quais se inclui a E. coli enterotoxigênica (^{Moriel et al., 2010}). A ETEC causa a gastroenterite conhecida como diarreia dos viajantes, que tem como quadro clínico diarreia líquida, dor abdominal, febre baixa, náusea e mal-estar. A ETEC, normalmente não é responsável por toxinfecções alimentares em países com bom padrão sanitário e boas práticas de preparação dos alimentos. Porém, em países com precárias condições higiênico-sanitárias a contaminação da água com esgoto pode levar à contaminação destes (^{CVE, 2002}).

O interesse em antimicrobianos naturais tem se expandido nos últimos anos em resposta a demanda dos consumidores por aditivos naturais. Durante as duas últimas décadas, conservantes naturais têm sido investigados para aplicações práticas (^{Tiwari et al., 2009}). Dentre diversos outros produtos naturais, extratos vegetais e óleos essenciais vêm sendo largamente estudados para uso como conservantes naturais de alimentos e, têm demonstrado promissoras propriedades antioxidantes, antimicrobianas e antiparasitárias (^{Okpekon et al., 2004}; ^{Sokmen et al., 2004}; ^{Sacchetti et al., 2005}; ^{Ferreira et al., 2006}; ^{Boulanouar et al., 2013}).

Em particular, os óleos essenciais podem afetar tanto o invólucro externo quanto o citoplasma das células bacterianas, sendo a membrana celular o primeiro alvo. Isto ocorre devido à hidrofobicidade destes e de seus componentes, que permitem que eles se difundam através da bicamada fosfolipídica (^{Nazzaro et al., 2013}). O mecanismo de ação dos óleos essenciais sobre as bactérias está relacionado à perturbação da membrana citoplasmática, danos nas proteínas da membrana, coagulação do citoplasma, alteração no fluxo de elétrons, interrupção da força próton motriz, alteração do transporte ativo e redução do pool de ATP intracelular (^{Burt, 2004}; ^{Nazzaro et al., 2013}).

O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito bactericida in vitro de dezesseis óleos essenciais sobre Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC), bem como relacionar a composição química desses óleos com esta atividade.

MATERIAL E MÉTODOS

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados indicaram que os dezesseis óleos essenciais selecionados apresentaram diferentes magnitudes de atividade biocida sobre ETEC (Tabela 2). O óleo essencial com maior atividade biocida sobre ETEC foi o de C. cassia, com CMB de 0,12%, seguido pelo óleo essencial de T. vulgaris com CMB de 0,25%.

Com uma atividade bactericida moderada, os óleos essenciais de S. aromaticum e O. vulgare comerciais apresentaram CMB de 0,50% e os de O. vulgare e C. citratus extraídos na UFLA, apresentaram CMB de 1,0%. Dentre os dezesseis óleos estudados, dez apresentaram CMB igual ou superior a 2% (v/v) sobre ETEC, sendo eles M. piperita, C. aurantifolia, C. nobilis, F. vulgare, I. verum, M. fragans, O. basilicum (comercial e UFLA), P. nigrum e R. officinalis (Tabela 2).

A atividade antimicrobiana exercida pelos óleos essenciais tem sido descrita para uma ampla variedade de microrganismos, tanto Gram-positivos quanto Gram-negativos, os quais respondem de forma distinta e dependente da composição química dos óleos (^{Boulanouar et al., 2013}; ^{Burt, 2004}; ^{Solórzano-Santos & Miranda-Novales, 2011}). Deste modo, as diferenças observadas na atividade bactericida desses óleos sobre ETEC podem estar relacionadas as expressivas variações na composição química dos óleos (Tabela 3). As diferenças químicas foram observadas, principalmente, na classe dos monoterpenos hidrocarbonetos, cujos teores variaram de 1,3% a 95,52%; na classe dos monoterpenos oxigenados, desde não detectados até 84,07% e na classe de compostos fenólicos, desde não detectados até 94,75%. Com isso, não foi possível relacionar a suscetibilidade de ETEC frente aos dezesseis óleos com base na classe química constitucional do óleo, já que houve óleos ricos em compostos fenólicos, como I. verum (93,64%) e O. basilicum comercial (86,74%), que apresentaram CMB maior que 2% e o óleo de C. cassia, rico no aldeído fenólico E-cinamaldeído, que apresentou CMB de 0,12%.

O óleo de C. cassia foi constituído na sua totalidade de 94,75% de compostos fenólicos característicos da classe dos fenilpropanóides. A análise por CG-EM identificou três fenilpropanóides principais, dos quais 84,52% de E-cinamaldeído, 8,79% de (E)-o-metoxicinamaldeído e 1,44% de acetato de E-cinamila.

Já o óleo de T. vulgaris, que apresentou o segundo melhor resultado contra ETEC, foi composto de 30,88% de compostos da classe dos monoterpenos hidrocarbonetos, 4,46% de monoterpenos oxigenados e 53,82% de compostos fenólicos. No entanto, dentro do porcentual dos compostos fenólicos, 50,89% correspondeu ao teor de timol, um composto fenólico de origem biossintética da rota dos terpenos. Salienta-se ainda que, a classe dos monoterpenos hidrocarbonetos no óleo de T. vulgaris, foi constituída por 24,87% de p-cimeno e 5,91% de γ-terpineno.

Destacam-se ainda a composição química do óleo essencial de O. vulgare comercial e S. aromaticum que apresentaram CMB sobre ETEC de 0,50%. No primeiro, a classe de monoterpenos hidrocarbonetos foi constituída na sua totalidade de 3,92% de p-cimeno e 3,93% de γ-terpineno; 4,32% de E-cariofileno (sesquiterpeno oxigenado); e, 76,08% de compostos fenólicos. Por sua vez, o óleo de S. aromaticum foi constituído de 6,19% de hidrocarbonetos sesquiterpênicos; 0,66% do sesquiterpeno oxigenado óxido de cariofileno; e, 92,59% de compostos fenólicos, sendo que destes, 80,67% correspondeu ao teor do fenilpropeno eugenol.

Os resultados do presente estudo corroboram com os resultados de ^{Holley & Patel (2005)}, que observaram que os óleos essenciais e seus constituintes fenólicos, como cinamaldeído, timol, carvacrol e eugenol foram eficazes contra muitos agentes patogênicos de origem alimentar, incluindo a E. coli O157:H7. Na literatura foram encontrados dois manuscritos que avaliaram a atividade antimicrobiana sobre ETEC. O primeiro foi publicado por ^{Peñalver et al. (2005)} que observaram maior capacidade inibitória do crescimento sobre bactérias da família Enterobacteriaceae em óleos ricos em compostos fenólicos, como carvacrol e timol. Nesse trabalho, os óleos essenciais de Origanum vulgare e diferentes espécies do gênero Thymus (T. mastichina e T. zygis) apresentaram concentração mínima inibitória de 4% (v/v). O segundo, foi realizado por ^{Duarte et al. (2007)} que avaliaram 29 óleos essenciais contra diferentes sorotipos de E. coli. Para os óleos de M. piperita, O. basiculum, O. vulgare e Thymus vulgaris, Duarte e colaboradores observaram concentração mínima inibitória acima de 1000 µg/mL, não apresentando os dados de composição química, já que não foram os óleos mais eficazes.

Conforme ^{Gutierrez et al. (2008)}, a ação antimicrobiana apresentada pelos óleos essenciais não depende unicamente da composição química, mas também das propriedades lipofílicas, da solubilidade em água, da potência dos grupos funcionais e da mistura de compostos com diferentes propriedades bioquímicas. No que se refere a potência do grupo funcional, o cinamaldeído é um aldeído aromático, já bem conhecido como agente antimicrobiano natural de patógenos contaminantes de alimentos. Seu mecanismo de ação tem sido associado à formação de base de Schiff com proteínas de membrana pela reação com seu grupo carbonílico livre, o que provoca danos na membrana celular (González-Aguilar et al., 2011, ^{Wei et al., 2011}).

Há evidências também que alguns constituintes presentes em pequenas quantidades nos óleos essenciais, como γ-terpineno e p-cimeno, interferem na atividade antimicrobiana dos óleos facilitando a permeabilidade do carvacrol e timol na célula bacteriana (^{Silva et al., 2010}; ^{Romero et al., 2009}), o que nesse caso poderia explicar a atividade bactericida dos óleos de T. vulgaris e O. vulgare comercial sobre ETEC. Já o modo de ação de compostos fenólicos em bactérias patogênicas ainda não está bem estabelecido. Acredita-se que fenóis hidrofóbicos, como timol e carvacrol também possam agir por alterações na permeabilidade da membrana celular. No entanto, investigações mais aprofundadas são necessárias para esclarecer os mecanismos de ação desses compostos (^{González-Aguilar et al., 2011}).

As atividades antimicrobianas dos óleos de C. cassia e T. vulgaris, avaliadas por diferentes metodologias, já são bem relatadas na literatura para uma série de microorganismos patogênicos (^{Ooi et al., 2006}; ^{Oussalah et al., 2007}; ^{Abdollahzadeh et. al., 2014}; ^{Dussault et al., 2014}; ^{Pekmezovic et al., 2015}). Assim, como estudos com outras cepas patogênicas de E. coli, como o estudo de ^{Oliveira et al. (2012)}, que observaram atividade inibitória de E. coli enteropatogênica (EPEC) ao avaliarem os óleos essenciais de Melaleuca alternifolia (melaleuca), Cymbopogon flexuosus (capim-limão da Índia Oriental) e Cinnamomum cassia (canela cássia) pelo mesmo método utilizado neste trabalho. A CBM determinada para estes óleos foram de 0,06% para óleo de C. cassia e 0,25% para os óleos de M. alternifolia e C. flexuosus. ^{Santos et al. (2012)} pesquisando a ação antibacteriana do óleo essencial de folhas de Piper malacophyllum (pariparoba) sobre E. coli ATCC 25922 pelo método de microdiluição em caldo, encontraram uma CMB de 3700 µg/mL.

Embora a atividade antibacteriana dos óleos essenciais utilizados neste trabalho seja bem conhecida, estes ainda não haviam sido avaliados contra a cepa ETEC. Os resultados mostraram diferentes níveis de sensibilidade desta cepa de Escherichia coli frente aos dezesseis óleos essenciais. Estudos futuros podem ser realizados objetivando investigar os mecanismos de ação envolvidos na atividade anti-ETEC, visto que diferentes classes de compostos químicos estavam envolvidas na eficácia da atividade biocida desta bactéria e diversos são os fatores que podem interferir no crescimento e desenvolvimento bacteriano.

CONCLUSÃO

Escherichia coli enterotoxigênica apresenta diferentes níveis de sensibilidade frente à faixa de concentração de 0,03% a 2,00% dos dezesseis óleos essenciais estudados. A atividade anti-ETEC é dependente da composição química do óleo essencial. Os óleos de C. cassia e T. vulgaris, ricos em E-cinamaldeído e timol, respectivamente, foram os mais eficazes na inibição do crescimento in vitro de ETEC, o que indica potencialidades na conservação microbiológica de alimentos.