Atividade biológica de Davilla kunthii A. St. –Hil. (Dilleniaceae)

Biological Activity of Davilla kunthii A. St. –Hil. (Dilleniaceae).

RESUMO

Davilla kunthii A. St. –Hil. (Dilleniaceae) tem ampla distribuição vegetal. Sua família agrega uma quantidade significativa de novas substâncias, bem como importantes atividades biológicas. O uso mais comum é na medicina alternativa para combater algumas doenças, mas estudos comprovam diferentes atividades biológicas de interesse farmacológico. A literatura sobre a bioatividade de D. kunthii é incipiente. Por esta razão, os objetivos deste trabalho se concentraram em verificar os efeitos biológicos do extrato das folhas de D. kunthii, através de bioensaios frente a microrganismos patógenos Escherichia coli, Salmonella tiphymurium (bactérias gram-negativa), Staphylococcus aureus e Streptococcus sanguinis (bactérias gram-positiva), ao fungo tipo levedura Candida albicans e aos fungos filamentosos Aspergillus flavus e Fusarium proliferatum. A pesquisa verificou ainda a atividade redutora da enzima de acetilcolinesterase, e, também, foi observada a atividade antioxidante via DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) e de toxicidade frente ao microcrustáceo A. salina. Os resultados apontaram significativas atividades antioxidante, antimicrobiano, atingindo até 90% de inibição sobre a levedura C. albicans em todas as concentrações.

Palavras-chave
bioatividade; antimicrobiano; antioxidante; toxicidade; antiacetilcolinesterase

ABSTRACT

Davilla kunthii A. St. -Hil. (Dilleniaceae) has wide plant distribution. His family adds a significant amount of new substances as well as important biological activities. The most common use is in alternative medicine to fight some diseases, but studies show different biological activities of pharmacological interest. The literature on the bioactivity of D. kunthii is incipient. For this reason, the objectives of this work are to verify the biological effects of extract from the leaves of D. kunthii through bioassays against pathogenic microorganisms Escherichia coli, Salmonella tiphymurium (gram-negative bacteria), Staphylococcus aureus and Streptococcus sanguinis (bacteria Gram-positive), the fungus-type yeast Candida albicans and filamentous fungi Aspergillus flavus and Fusarium proliferatum. And check the reducing activity of acetylcholinesterase enzyme, and also observed the antioxidant activity via DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hidrazila) and toxicity against microcrustacean A. saline. The results showed significant antioxidant activity, antimicrobial, reaching 90% inhibition of the yeast C. albicans at all concentrations.

Keywords
bioactivity; antimicrobial; antioxidante; toxicity; antiacetylcholinesterase

INTRODUÇÃO

A família Dilleniaceae compreende cerca de 11 gêneros e 310 espécies distribuídas nos trópicos e subtrópicos. Somente no Brasil há 5 gêneros nos cerrados e em todo o Nordeste, e o gênero Davilla é um deles. Este gênero possui cerca 20 espécies, usadas na medicina alternativa como anti-inflamatória, antiúlcera gástrica, adstringente, tônico, laxativo, sedativo, diurético, entre outros (Melo & Barbosa, 2007; Kerrigan, Craven & Dunlop, 2011; Ribeiro et al., 1999; Schultz, 1984).

A família Dilleniaceae pode apresentar agliconas flavônicas, geralmente na forma de glicosídeos, como também sulfatos (Gurni & Kubitzki, 1981), flavonoides (Pavanasasivam & Sultanbawa, 1975), triterpenoides (Nick et al., 1995), ácido betulínico (Kumar et al., 2010), entre outras substâncias.

Além das substâncias químicas presentes na família, a espécie em estudo apresenta ainda atividade antileucemia (Kumar et al., 2010), antidiabética (Kumar, Kumar & Prakash, 2011), antioxidante (Abdille et al., 2005), antimicrobiana e tóxica contra Artemia salina (Apu et al., 2010). Algumas espécies do gênero Davilla possuem ação gastroprotetora e antiulcerogênica, assim como também antinociceptiva (Kushima et al., 2009; Azevedo et al., 2007; Guaraldo, Sertieb & Bacchia, 2001).

MATERIAIS E METÓDOS

Material Vegetal e Obtenção do Extrato Etanólico das Folhas de D. kunthii

As folhas de D. kunthii foram coletadas no Centro de Ciências Agrárias da UFRR, campus Cauamé, Boa Vista, Roraima. A espécie foi identificada Drª. Andréia Silva Flores, pesquisadora do Museu Integrado de Roraima (MIRR), cuja exsicata (10273) se encontra depositada no Herbário do MIRR, Boa Vista, Roraima, Brasil. Há também um registro (41621-1) no Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade – SisBio do Instituto Chico Mendes, Ministério do Meio Ambiente – ICMBio/MMA (Santos & Melo Filho, 2013).

As folhas de D. kunthii (2,890 kg) após secagem à temperatura ambiente, foram trituradas em moinho de facas e extraídas exaustivamente em frasco de Mariotte com etanol. A destilação do etanol foi feita sob pressão reduzida e forneceu 550 g de extrato (Santos & Melo Filho, 2013).

Bioensaios do extrato etanólico das folhas de D. kunthii

Bioensaio de inibição do Acetilcolinesterase (AChE)

Adicionaram-se 25 μL da solução de substância teste (amostra em DMSO 10 mg.mL^-1) aos poços da placa de Elisa (substância teste e dos controles negativo e positivo). Nos cinco primeiros poços da coluna do controle positivo, adicionaram-se 25 μL da solução de eserina (10 mg.mL^-1 em tampão Tris/HCl pH 8,0). Adicionaram-se, a cada poço, 25 μL de solução de Iodeto de Acetilcolina (Acetylthiocholineiodide, ATCI), 125 μl da solução de DTNB (5’,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoate, Sigma) e 50 μL de Tris/HCl (50 mM) com albumina sérica bovina. A absorbância foi medida a 405 nm a cada 1 min por 8 vezes (8 min no total). Adicionaram-se 25 μL da solução de AChE (0,226 U.mL^-1) em Tris/HCl ao poço. Mediu-se a absorbância a 405 nm por 10 vezes (10 min no total) (Walker & Lue, 2007; Ellman, 1961).

Bioensaio de toxicidade sobre A. salina

Os cistos de A. salina foram colocados em água de mar artificial e expostos à luz de uma lâmpada de 40 W, com pH entre 8 e 9. Após 24 h, os náuplios (10 unidades), foram colocados em tubos de ensaio contendo o extrato etanólico das folhas de D. kunthii dissolvido em DMSO 5% e completado com 5 mL de água do mar artificial. As concentrações dos extratos foi de 500, 250, 125, 62,5 e 31,25 µg.mL^-1, este procedimento foi feito em 3 repetições. Como controle positivo foi utilizado DMSO, preparado de maneira semelhante às amostras. Após 24 h, o número de sobreviventes foi contado e a percentagem de morte calculado (Meyer et al., 1982).

Atividade antioxidante

Inicialmente observou-se o comportamento das amostras nas concentrações 1000 µg.mL^-1, 500 µg.mL^-1, 250 µg.mL^-1, 125 µg.mL^-1, 50 µg.mL^-1 e 10 µg.mL^-1, na mesma razão de 0,1 mL da amostra para 3,9 mL da solução de DPPH a 60 µg.ml^-1, utilizada na análise quantitativa. Após 30 minutos observou-se como positiva a alteração da coloração da solução de DPPH (60 µg.mL^-1), inicialmente púrpura para tons de púrpura mais claro até o amarelo. Foi utilizado como controle negativo a mistura de 0,1 mL^-1 de metanol a 3,9 mL da solução de DPPH (60 µg.mL^-1) e controle positivo utilizou-se a Quercetina. Este teste também foi utilizado para definir a faixa de concentração das diluições a serem utilizadas na determinação quantitativa da atividade antioxidante. Assim, efetuou-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro UV-Vis a 515 nm (Gontijo, 2014).

Bioensaio de inibição de bactérias e fungo

Avaliou-se as atividades antibacteriana e antifúngica pelo método de microdiluição, utilizando bactérias gram-negativa e gram-positiva, nessa ordem: E. coli (ATCC 25922), S. tiphymurium (ATCC 14028), S. aureus (ATCC 25923) e S. sanguinis (ATCC 49456), e o fungo C. albicans (ATCC 18804), e as concentrações das amostras em 500 µg, 250 µg, 125 µg, 62,5 µg, 31,25 µg, 15,625 µg, 9,375 µg e 3,90625 µg (Zacchino & Gupta, 2007).

Bioensaio de inibição de fungos filamentosos

Os fungos filamentosos utilizados neste bioensaio foramA. flavus(CCT 4952) eF. proliferatum(CML 3287). Solvente utilizado para o preparo das amostras: Dimetilsulfóxido. Concentração das amostras no teste: 250 μg.mL^-1. Meio utilizado para o crescimento dos micro-organismos: Caldo Sabouraud. Concentração da suspensão de esporos: 5 x 10^-5 esporos.mL^-1. Tempo de incubação das amostras: 48 h.

Dados da leitura: Realizada em leitor de placas de microtitulação. Comprimento de onda utilizado na leitura: 490 nm.

Tratamento dos dados: Teste de outlier: Teste de Grubbs, com nível de significância de 95%. Cálculo da porcentagem de inibição: Realizado através da fórmula

Sendo EC a absorbância do teste, CC a absorbância do controle da amostra, CH a absorbância do controle do fungo e CM a absorbância do controle do meio de cultura.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Bioensaio de inibição do AChE

Este bioensaio resultou numa baixa atividade Antiacetilcolinesterase, onde observa-se apenas 3,07% de inibição. Assim, os extratos vegetais são classificados em baixa inibição de AChE (menor que 30%), inibição moderada (de 30 a 50%) e alta inibição de AChE (maior que 50%) (Vinutha et al., 2007), quando comparada a outro gênero e família, no caso Combretum laurifolium o qual apresentou atividade moderada a alta (Montero et al., 2014).

Toxicidade de D. kunthii

Através da Figura 1 é possível verificar a toxicidade do extrato etanólico das folhas de D. kunthii frente a A. salina.

FIGURA 1
Curva de toxicidade do extrato etanólico das folhas de D. kunthii frente a A. salina

Utilizando a fórmula da regressão linear Y = A + BX, calcula-se a DL₅₀ (Y = 50), onde -3,3985 e 0,0324 são os valores de A e B, respectivamente, encontrando X igual à 1.648,10 μg.mL^-1. Pela análise dos dados, pode-se verificar que o extrato etanólico de D. kunthii, não apresentou letalidade frente a A. salina, sendo considerado de baixa toxicidade (DL 50% superior a 500 μg.mL^-1) tendo sido encontrado o valor de DL₅₀ de 1.648,10 μg.mL^-1.

Atividade antioxidante de D. kunthii

Para a avaliação da atividade antioxidante pela redução do DPPH, ao fixar um H (hidrogênio), abstraído do antioxidante em estudo, observa-se uma diminuição na absorbância, o que permite calcular, após estabelecimento do equilíbrio da reação, a quantidade de antioxidante gasta para reduzir 50% do DPPH (CE₅₀) (Alpiovezza et al., 2013).

As leituras em espectrofotômetro das soluções iniciais de DPPH e de Quercetina forneceram os seguintes gráficos (Figuras 2 e 3):

FIGURA 2
Espectrofotometria da curva de DPPH

FIGURA 3
Espectrofotometria da curva de Quercetina.

A partir da solução inicial do extrato etanólico de D. kunthii, construiu-se uma curva de absorbância versus a concentração (mg.L^-1), Figura 4, e calculou-se o CE₅₀.

FIGURA 4
Curva do extrato etanólico de D. kunthii

Assim, verifica-se quanto de extrato etanólico de D. kunthii, é necessário para oxidar 0,01166 g de DPPH, 0,2552 g de extrato. A atividade antioxidante desta espécie também foi vista por Souza et al. (2008) e Silva et al. (2007).

A atividade antioxidante expressa em CE₅₀ (concentração efetiva, que elimina 50% dos radicais livres) indicando significativa atividade antioxidante da amostra, ou seja, quanto menor o valor da CE₅₀ mais ativa é a amostra (Alpiovezza et al., 2013; Locatelli et al., 2009). Observando-se, no resultado estimado da CE₅₀ igual a 0,2552 g, que este extrato apresenta uma boa atividade antioxidante comparada com a Quercetina 0,2559 g, destaca-se que o extrato etanólico das folhas de D. kunthii contém diferentes ativos de grande importância farmacológica.

Bioensaio do extrato etanólico das folhas de D. kunthii

Através do ensaio da atividade antimicrobiana, foi possível verificar atividade do extrato etanólico bruto das folhas de D. kunthii frente às bactérias e fungos, a inibição variou de 6,2% à 53,7% para as bactérias gram-positivas (S. aureus e S. sanguinis), e inibição variando de 9,23% a 38,2% para as bactérias gram-negativas (E. coli e S. tiphymurium) e de 92,5% à 95,3% para C. albicans (Tabela 1).

TABELA 1
Bioensaio do extrato etanólico das folhas de D. kunthii.

C. albicans		% de Inibição		Miconazol	Nistatina
01 (500 µg.mL-1)		92,519		92,325	93,300
02 (250 µg.mL-1)		92,861		91,048	90,768
03 (125 µg.mL-1)		92,644		90,706	90,141
04 (62,5 µg.mL-1)		93,192		90,546	90,181
05 (31,25 µg.mL-1)		93,431		91,150	90,917
06 (15,625 µg.mL-1)		95,085		91,607	91,493
07 (9,375 µg.mL-1)		95,381		91,515	91,259
08 (3,90625 µg.mL-1)		94,800		91,282	91,424
S. aureus		% de Inibição		Ampicillina
01 (500 µg.mL-1)		11,713		104,626
02 (250 µg.mL-1)		6,201		106,004
03 (125 µg.mL-1)		13,287		105,512
04 (62,5 µg.mL-1)		8,858		104,134
05 (31,25 µg.mL-1)		11,220		101,969
06 (15,625 µg.mL-1)		10,433		86,713
07 (9,375 µg.mL-1)		11,516		34,744
08 (3,90625 µg.mL-1)		0,000		14,862
S. sanguinis		% de Inibição		Ampicillina
01 (500 µg.mL-1)		53,700		102,905
02 (250 µg.mL-1)		32,547		3,223
03 (125 µg.mL-1)		28,915		2,678
04 (62,5 µg.mL-1)		24,557		0,000
05 (31,25 µg.mL-1)		21,652		0,000
06 (15,625 µg.mL-1)		21,289		0,000
07 (9,375 µg.mL-1)		21,198		0,000
08 (3,90625 µg.mL-1)		0,000		0,000
E. coli		% de Inibição		Ampicillina
01 (500 µg.mL-1)		36,090		186,938
02 (250 µg.mL-1)		14,902		140,933
03 (125 µg.mL-1)		10,227		118,601
04 (62,5 µg.mL-1)		9,232		104,874
05 (31,25 µg.mL-1)		11,719		96,270
06 (15,625 µg.mL-1)		9,730		95,375
07 (9,375 µg.mL-1)		15,598		94,529
08 (3,90625 µg.mL-1)		11,371		79,559
S. tiphymurium		% de Inibição		Ampicillina
01 (500 µg.mL-1)		0		228,381
02 (250 µg.mL-1)		0		180,031
03 (125 µg.mL-1)		3,714		142,138
04 (62,5 µg.mL-1)		21,729		123,295
05 (31,25 µg.mL-1)		28,562		102,174
06 (15,625 µg.mL-1)		34,878		101,242
07 (9,375 µg.mL-1)		38,294		108,593
08 (3,90625 µg.mL-1)		34,981		100,932
A. flavus		11,92
F. proliferatum		10,04

Observa-se que a atividade fungicida foi eficaz em todas as concentrações pelo bioensaio, o que pode ser visto até mesmo em comparação com os padrões utilizados para combater este microrganismo, tão eficaz quanto o Miconazol e a Nistatina.

Já as bactérias gram-positivas demonstram-se mais sensíveis aos extratos analisados do que as gram-negativas em comparação com o antibiótico Ampicilina. E o bioensaio para fungos (A. flavus e F. proliferatum), apresentou baixa atividade.

De acordo com a literatura a espécie D. elliptica apresentou atividade antimicrobiana contra Bacillussubtilis, B. cereus, Shigella spp e C. albicans, e que apenas o extrato metanólico das folhas apresentou atividade contra Enterococcus faecalis e Salmonella spp (Soares et al., 2005). De acordo com Lopes et al. (2007), observou-se atividade antimicrobiana in vitro do extrato clorofórmico das folhas de D. elliptica, sugerindo efeito terapêutico potencial no controle microbiológico da tuberculose.

Como a amostra foi coletada em época seca, é possível que a época do ano e a localidade influenciaram na atividade antimicrobiana de D. kunthii. Porém, há a necessidade de novos estudos a partir de um número maior de coletas, pois não foram encontrados dados na literatura sobre a atividade antimicrobiana do extrato etanólico bruto das folhas de D. kunthi, o que torna esta informação inédita para a espécie.

Os fungos e bactérias são microrganismos que geram diversas patogenias (Santos & Melo Filho, 2013). Assim, usar indiscriminadamente medicamentos antibióticos pode o uso indiscriminado de antibióticos favorece a resistência microbiana, fazendo com que se busque medicamentos que mesmo sendo potentes não conseguem deter determinada infecção (Antunes et al., 2006; Moellering Jr, 2000). Assim, desenvolver novas substâncias com efeitos, principalmente, bactericida e fungicida é uma busca constante a pesquisa farmacológica (Soares et al., 2009). Mas para que isso ocorra é necessário que se realizem bioensaios com extratos vegetais para que se busque o princípio ativo de novos fármacos, com a ação inibitória desejada (Ostrosky et al., 2008). Essa ação pode ser realizada através da MIC, um procedimento relevante e muito objetivo, evitando, portanto, gastos e tempos de experimentos desnecessários (Pinto, Kaneko & Ohara, 2003).

CONCLUSÃO

Não foi possível verificar ação inibitória da enzima acetilcolinesterase por parte do extrato de D. kunthii (inibição 3,07%). O teste de toxicidade sobre A. salina foi significativo, pois o DL₅₀ foi superior a 500 μg.mL^-1. Já a atividade antioxidante, indicou forte capacidade de capturar radicais livres. Quanto ao bioensaio sobre as bactérias, os efeitos variaram de 6,2 a 53,7% para S. aureus e S. sanguinis. Já para E. coli o teste variou de 9,23 a 38,2% e S. tiphymurium. No entanto, o bioensaio sobre C. albicans foi de 92,5 a 95,3%, mostrando eficácia farmacológica nesta atividade por parte de D. kunthii. Houve baixa inibição do extrato etanólico de D kunthii sobre os fungos filamentosos A. flavus, 11,92%, e F. proliferatum, 10,04%.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos ao CNPq, CAPES, REUNI pelo auxílio financeiro e Profa. e Pesquisadora Jacqueline Aparecida Takahashi do Laboratório de Biotecnologia e Bioensaios da Universidade Federal de Minas Gerais UFMG.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jan-Mar 2016

Histórico

• Recebido
  20 Mar 2015
• Aceito
  23 Set 2015