Seleção de isolados de Lactobacillus acidophilus usados como probiótico em bezerros

Selection of isolates of Lactobacillus acidophilus used as probiotic for calves

Seleção de isolados de Lactobacillus acidophilus usados como probiótico em bezerros¹

Selection of isolates of Lactobacillus acidophilus used as probiotic for calves

Antônio Hamilton Chaves^I; José Fernando Coelho da Silva^II; Adão José Rezende Pinheiro^III; Sebastião de Campos Valadares Filho^II; Oriel Fajardo de Campos^IV

^I Professor da Escola Agrotécnica Federal de Uberaba, Uberaba-MG

^II Professor do DZO, UFV, Viçosa, MG, Bolsistas do CNPq

^III Professor do DTA, UFV, Viçosa, MG, Bolsista do CNPq

^IV Pesquisador da EMBRAPA/CNPGL, Coronel Pacheco, MG

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi selecionar estirpes Lactobacillus acidophilus para serem usadas como probiótico em bezerros. Estirpes de Lactobacillusacidophilus (12) foram isoladas de amostras de fezes de bezerros e selecionadas quanto às suas capacidades acidificantes, à resistência a vários antibióticos usados na criação de bezerros, ácido clorídrico, lisozima, fenol e sais biliares, à capacidade de crescimento em líquido ruminal e à capacidade antagônica in vitro a uma estirpe enteropatogênica de Escherichia coli.Os isolados foram classificados como lentos na produção de ácido lático. Nos testes de resistência ao ácido clorídrico (pH 2,0 e 3,0), à lisozima, ao fenol, aos sais biliares, aos antibióticos testados e ao líquido ruminal, os isolados LT 158A e LT 516 comportaram de acordo com a média dos outros isolados. No teste de antagonismo à estirpe de Escherichia coli, os isolados LT 158A e LT 516 foram muito eficientes, produzindo um halo de 18-mm de diametro. Os isolados LT 158A and LT 516 mostraram o melhor desempenho para serem usados como probiótico em bezerros.

Palavras-chave: bezerro, Lactobacillus acidophilus, probiótico

ABSTRACT

The objective of this work was to select strains of Lactobacillus acidophilus to be used as a probiotic in calves.Strainsof Lactobacillus acidophilus (12) were isolated from calves feces and selected according to their acidifying capacities, resistance to hydrochloridric acid, lysozyme, phenol, biliary salt, antibiotics used in the calves productions, capacities of growing in ruminal liquid, and their capacities to inhibit a strain of enteropathogenic Escherichia coli in vitro. The isolates were classed as slower in lactic acid production. In test of resistance to hydrochloridria acid (pH 2.0 and 3.0), lysozyme, phenol and biliary salt, tested antibiotics and ruminal liquid, the isolates LT 158A and LT 516 behaved in accordance with the means of the other isolates. In the inhibition test with Escherichia coli, the isolates LT 158A and LT 516 were very efficient, producing an 18-mm halo of diameter. The isolates LT 158A and LT 516 showed the best performance to be used as probiotics for calves.

Key Words: calf, Lactobacillus acidophilus, probiotic

Introdução

Bactérias usadas como probiótico, para atuarem no intestino delgado, devem apresentar certas qualidades básicas: 1) ser habitante normal do intestino do hospedeiro ou ter a capacidade de se adaptar ao ambiente intestinal; 2) sobreviver à passagem pelo trato gastrintestinal e ser capaz de se implantar, particularmente, no intestino delgado; 3) realizar funções que sejam vantajosas para o hospedeiro; e 4) não deve prejudicar a qualidade do alimento usado como carreador, do mesmo modo que o alimento ou o seu processamento não devem prejudicar a cultura (SHAHANI e CHANDAN, 1979).

Sendo a passagem do microrganismo pelo trato gastrintestinal e sua capacidade de sobrevivência e multiplicação no intestino delgado um fator de grande relevância, é de suma importância que sejam testados antes de usá-los como probióticos, principalmente em relação à lisozima, ao ácido clorídrico, ao fenol, aos sais biliares e até ao líquido ruminal. O Lactobacillusacidophilus, além de produzir substâncias antimicrobianas conhecidas como bacteriocinas, produz ácido lático, que exerce atividade antimicrobiana sobre os microrganismos causadores de toxi-infecções, como Staphylococcus aureus, Salmonella sp e Escherichia coli enteropatogênica.

É também necessário testá-los frente aos antibióticos mais usados para bezerros, objetivando-se, caso seja preciso, o fornecimento de Lactobacillus acidophilus e antibióticos ao mesmo tempo.

Outro fator importante na seleção é testar estes isolados frente a microrganismos causadores de diarréias.

Pela importância da seleção in vitro dos isolados, os objetivos do presente trabalho foram determinar a produção de ácido lático e a concentração hidrogeniônica; avaliar as resistências de 12 isolados de Lactobacillus acidophilus ao ácido clorídrico, à lisozima, ao fenol, a sais biliares e ao líquido ruminal; testar as resistências destes isolados frente a diversos antibióticos; e avaliar suas capacidades antagônicas frente a uma estirpe de Escherichia coli enteropatogênica.

Material e Métodos

O presente trabalho foi realizado nos laboratórios do Departamento de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Avaliou-se a capacidade acidificante dos 12 isolados (LT 154A; LT 156B; LT 158A; LT 350; LT 360; LT 361; LT 482; LT 484; LT 510; LT 516; LT 518; e LT 520), inoculando-se estas culturas a 1% em leite desnatado reconstituído (LDR) a 10% de extrato seco desengordurado (ESD), previamente esterilizado a 121ºC por 15 minutos. Posteriormente, determinaram-se a acidez (ºDornic) e o pH nos tempos 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 36 e 48 horas de incubação a 37ºC.

No teste de resistência ao ácido clorídrico, o pH do LDR (10% ESD) foi reduzido a 2,0 e 3,0 com solução diluída de ácido clorídrico estéril. Os isolados previamente ativados em LDR (10% ESD) foram inoculados (1%) e incubados a 37ºC. As amostras foram coletadas com 0, 1, 2 e 3 horas de exposição ao LDR acidificado. Após neutralização com solução (0,1N) de hidróxido de sódio esterilizada, foram contadas as unidades formadoras de colônias (UFC) em agar DE MAN, ROGOSA e SHARPE (MRS), desenvolvido por DE MAN et al. (1960).

No estudo deresistência à lisozima, a lisozima da clara de ovo (mucopeptídeo N-acetilmuramoil hidrolase, Sigma grade, 42000 Unit./mg) foi diluída em tampão fosfato (pH 6,2) na concentração de 80 mg/100 mL (AGOSTINHO, 1988). As culturas de Lactobacillus acidophilus foram crescidas em caldo MRS a 37ºC. Após atingirem a fase estacionária (aproximadamente 18 horas de incubação), foram centrifugadas, lavadas e ressuspensas em tampão fosfato 0,067M (pH 6,2). As suspensões de células foram adicionadas ao preparado enzimático na proporção de 1:1, seguido de incubação a 37ºC. As taxas de clareamento das suspensões foram determinadas por meio da transmitância a 540hm, medidas em Spectrofotômetro Spectronic 20 no momento da mistura (tempo zero) e após 1 e 2 horas de exposição à lisozima. A diferença entre os valores da transmitância final e inicial, dividida pelo tempo de contato, em minutos, foi considerada como medida da suscetibilidade das células (VAKIL et al., 1969).

Caldo MRS adicionado de fenol nas concentrações de 0; 0,2; 0,3; 0,4; e 0,5% e esterilizado a 121ºC por 15 minutos foi inoculado (1%) com os isolados teste e incubados a 37ºC; as sobrevivências ou crescimentos destes isolados foram observados ou monitorados por meio da absorbância a 620 hm, medidas em Spectrofotômetro Spectronic 20, no momento da incubação e após 24 e 48 horas de exposição ao fenol (DAVIS, 1955).

Para o teste de resistência a sais biliares, os isolados de Lactobacillus acidophilus, previamente ativados em MRS, foram inoculados (1%) no caldo MRS, contendo diferentes concentrações de sais biliares (Oxgall-Merck): 0; 0,3; e 0,5%. Após incubação a 37ºC, a sobrevivência ou crescimento das culturas de isolados frente aos sais biliares foi monitorada pela absorbância (620 hm) em espectrofotômetro Spectronic 20, no momento da inoculação e a cada hora, pelo período de 8,0 horas de incubação (FLOCH et al., 1970; GILLILAND et al., 1985; e NOH e GILLILAND,1993).

Para a avaliação do crescimento em líquido ruminal, os isolados foram inoculados (1%) em líquido ruminal natural (sem esterilização) e esterilizados a 121ºC por 15 minutos. Após incubação a 37ºC, avaliaram-se as capacidades de crescimento por meio da contagem de unidades formadoras de colônias (UFC), em meio seletivo agar Rogosa SL, desenvolvido por Rogosa (KANDLER e WEISS, 1986), nos tempos 0, 3, 6, 12 e 24 horas de incubação.

Utilizou-se o método da difusão em placas com discos impregnados com antibióticos (antibiograma), para o teste de sensibilidade dos isolados a diferentes antibióticos, cujas concentrações e limites de diâmetro dos halos de inibição encontram-se na Tabela 1 (WISTREICH e LECHTMAN, 1976; NCCLS,1983). A incubação foi realizada a 37ºC por 48 horas.

Os isolados foram testados quanto a suas capacidades antagônicas a uma estirpe de Escherichia coli enteropatogênica isolada de fezes de bezerro com diarréia, do laboratório de Medicina Preventiva da Clínica Veterinária da Universidade Federal de Viçosa (UFV). Os testes foram realizados nos mesmos moldes dos testes de resistência a antibióticos (antibiograma), visto que desta vez a Escherichia coli foi semeada na superfície do agar MRS e os discos (8 mm de diâmetro) foram impregnados com o caldo MRS contendo os isolados de Lactobacillus acidophilus. As placas foram incubadas a 37ºC por 48 horas e a determinação da inibição realizada de acordo com SANTOS (1984), que considerou como inibição muito forte as zonas de 20 a 25 mm de diâmetro; inibição forte, de 15 a 19 mm, moderada, de 11 a 14 mm; fraca, de 9 a 10 mm; e nenhuma inibição, menor que 9 mm.

Resultados e Discussão

O percentual de ácido lático produzido pelos diferentes isolados variou de 1,41 a 1,71% com 48 horas de incubação (Tabela 2), uma vez que com 21 horas esta variação foi de 0,73 a 0,83%.

A atividade antimicrobiana do Lactobacillus acidophilus em diferentes bactérias é atribuída, em grande parte, à produção de ácido lático (HAMDAN e MIKOLAJCIK, 1974; STAMER, 1979). Em trabalho semelhante, SANTOS (1984), trabalhando com três estirpes de Lactobacillus acidophilus isoladas de fezes de bezerros, encontrou com 21 horas de incubação variação no percentual de ácido lático produzido de 0,53 a 0,68%. PAULO (1991), trabalhando com sete estirpes de Lactobacillus acidophilus isoladas de material fecal de suínos, encontrou com 24 horas de incubação variação no percentual de ácido lático de 0,37 a 0,80%.

SPECK (1962) relatou que estirpes produzindo de 0,8 a 1,0% de ácido lático, com 24 horas de incubação são consideradas lentas. Esse autor, em 1978, relatou ser estas estirpes as mais indicadas para serem utilizadas como probiótico.

O pH variou de 3,72 a 3,54 e 5,26 a 4,77, respectivamente, em 48 e 21 horas de incubação (Tabela 3). PAULO (1991), trabalhando com sete estirpes de Lactobacillus acidophilus isoladas de material fecal de suínos, encontrou com 48 horas de incubação variação no pH de 5,36 a 3,99.

A média de sobrevivência (Tabelas 4 e 5) após uma hora de exposição a pH 2,0 foi de apenas 0,53%, enquanto em pH 3,0 obtiveram-se 55,61; 26,14; e 11,70% com 1, 2 e 3 horas de exposição ao ácido clorídrico, respectivamente. Com 11,70% de sobrevivência, o número de unidades formadoras de colônias (UFC) foi de 6,67 x 10⁷ por mL. Segundo GILLILAND et al. (1978), 10⁶ UFC por mL de Lactobacillus acidophilus são suficientes para que ocorra o mecanismo competitivo com os patógenos, assegurando sua implantação em nível de trato gastrintestinal.

Todos os isolados apresentaram taxas de lises (Tabela 6) bem inferiores à do Micrococcus lysodeikticus (microrganismo usado como controle de lise), que foi de 0,63% de transmitância/minuto para a lisozima do ovo e 1,82% para a lisozima do leite bovino. VAKIL et al. (1969), trabalhando com diversos microrganismos em testes de resistência à lisozima do leite bovino, constataram que o Lactobacillus casei é um dos menos sensíveis a esta lisozima. Os resultados da Tabela 6 são compatíveis com os encontrados por AGOSTINHO (1988). Já CHASSY e GIUFFRIDA (1980) reportaram que os lactobacilos são mais resistentes à lisozima que os estreptococos; esta menor sensibilidade se deve à maior espessura e densidade da parede celular dos lactobacilos. Segundo VAKIL et al. (1969), a lisozima promove lise de certas bactérias, por hidrolisar a ß-ligação entre o ácido murâmico e a glicosamina dos glicopolissacarídeos das paredes celulares destas bactérias.

A concentração da lisozima no leite bovino pode variar de 0 a 260 µg, com média de 13 µg/100 mL (VAKIL et al., 1969). Por ser esta concentração muito abaixo da utilizada no teste com lisozima da clara do ovo, supõe-se que os isolados de Lactobacillus acidophilus não sofrerão danos significativos, quando o leite bovino for usado como veículo para sua administração.

Os isolados cresceram bem no meio com até 0,3% de fenol e, mesmo com 0,4 e 0,5%, alguns isolados ainda apresentaram algum crescimento (Tabela 7). Estes resultados são semelhantes aos encontrados por PAULO (1991), que trabalhou com Lactobacillus acidophilus isolados de fezes de suínos. Segundo DAVIS (1955), todas as estirpes de Lactobacillus acidophilus crescem na presença de 0,3% de fenol.

Os isolados apresentaram diferentes resistências a sais biliares (Tabela 8) - os que não alcançaram com 8 horas de incubação, 0,3 de absorbância com 0,3% de sais biliares (oxgall-Merck), ficaram muito próximos disto. Segundo GILLILAND et al. (1985), isolados que atingem 0,3 de absorbância com 8 horas de incubação são considerados tolerantes a sais biliares.

Os resultados das Tabelas 9 e 10 indicam que o "líquido ruminal" não é bom meio, pelo menos "in vitro", para o crescimento de Lactobacillusacidophilus, porém não causa efeitos deletérios graves sobre este microrganismo. A taxa de crescimento no líquido ruminal natural, após 12 horas de incubação, foi 17,77% e no líquido ruminal esterilizado, 83,33%. Após 24 horas de incubação, a taxa de sobrevivência para o líquido ruminal natural e estéril foi 56,21 e 56,79%, respectivamente.

Os isolados apresentaram diferença de sensibilidade frente aos diversos antibióticos (Tabela 11), portanto, análises destes resultados deverão ser feitas quando houver uso conjunto de alguns isolados e antibióticos; contudo, os antibióticos sulfazotrim, gentamicina, kanamicina, amicacina e cefoxitina podem ser usados associados a qualquer dos isolados de Lactobacillus acidophilus testados.

Os resultados (Tabela 12) indicam que quatro isolados apresentaram antagonismo considerado forte frente à estirpe de Escherichia coli enteropatogênica. Um isolado (H₂B₂₀) de Lactobacillus acidophilus foi testado por SANTOS (1984), sendo considerado causador de inibição moderada (13 mm) com 40 horas de incubação frente à Escherichia coli K 12.

Conclusões

Os isolados LT 158A e LT 516 apresentaram melhores desempenhos para serem usados como probiótico. No teste de antagonismo à estirpe de Escherichia coli, os isolados LT 158A e LT 516 foram muito eficientes, apresentando 18 mm no diametro do halo. Qualquer um dos dois isolados, ou ambos simultaneamente, podem ser usados como probiótico em bezerros.

Recebido em: 04/12/97

Aceito em: 08/02/99

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¹

Parte do trabalho de Tese de Doutorado do primeiro autor, apresentada ao Departamento de Zootecnia da UFV, Viçosa, MG. Parcialmente financiado pela FAPEMIG e EMBRAPA/CNPGL.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Out 2012
• Data do Fascículo
  1999

Histórico

• Recebido
  04 Dez 1997
• Aceito
  08 Fev 1999