Diminuição do teor de óxido de crômio (III) usado como marcador externo

Reduction in chromium (III) oxide level as an external marker

Diminuição do teor de óxido de crômio (III) usado como marcador externo¹

Reduction in chromium (III) oxide level as an external marker

Hermann Bremer Neto^I; Celso Augusto Fessel Graner^II; Luiz Edivaldo Pezzato^III; Carlos Roberto Padovani^IV; Osmar Angelo Cantelmo^V

^IDepto de Bioquímica e Biofísica. Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE) – Rua José Bongiovani no 700 – CEP 19 050-900 – Presidente Prudente/SP. E.mail: [e-mail]. Bolsista do CNPq

^IIDepto de Química e Bioquímica-Instituto de Biociências/UNESP, Botucatu/SP

^IIIDepto de Melhoramento e Nutrição Animal-FMVZ/UNESP, Botucatu/SP

^IVDepto de Bioestatística-Instituto de Biociências/UNESP, Botucatu/SP

^VPesquisador do Centro Nacional de Pesquisa de Peixes Tropicais-CEPTA/IBAMA, Pirassununga/SP

RESUMO

A sensibilidade do método espectrofotométrico da s-difenilcarbazida de determinação do crômio permite que esse metal possa ser determinado em teores e em massas de amostras tão pequenas que as concentrações atualmente usadas de óxido de crômio (III) como marcador externo em ensaios biológicos poderiam ser drasticamente diminuídas. Utilizando-se do piauçu (Leporinus macrocephalus) para um estudo sobre o coeficiente de digestibilidade aparente (CDA) da fração protéica, seis níveis de óxido de crômio (III) - 0,01% - 0,02% - 0,03% - 0,05% - 0,1% e 0,2% - foram incorporados em dietas isoprotéica e isoenergética, objetivando-se verificar se o cálculo do CDA seria afetado pela variação do teor do marcador. Os seis tratamentos foram dispostos em um delineamento em blocos inteiramente casualisados, sendo as fezes coletadas durante 16 dias. Verificou-se que os resultados do coeficiente de digestibilidade aparente da fração protéica não apresentaram diferenças estatísticas significativas devidas aos teores incorporados do marcador à ração e aos dias de coleta. Conseqüentemente, e em experimentos dessa natureza, nada impede que seja reduzido o teor de óxido de crômio (III) ao menos até 0,01%: além da economia relativa ao consumo do mesmo e da facilidade na manipulação de menor quantidade de amostras de fezes, o método espectrofotométrico da s-difenilcarbazida permite dosar esse nível (e até menor do que 0,01%) de modo simples e rápido, com precisão e exatidão.

Palavras-chave: digestibilidade aparente, óxido de crômio (III), peixe, s-difenilcarbazida

ABSTRACT

The objective of this study was to reduce the level of the biological marker Cr₂O₃ in animal diets, due to the sensibility of the sdiphenylcarbazide spectrophotometric method for chromium determination in feces, recently developed. Six levels of marker, chromium (III) oxide (0.01% - 0.02% - 0.03% - 0.05% - 0.1% and 0.2%), were incorporated into isoproteic and isoenergetic diets, for the apparent digestibility assay of the "piauçu" (Leporinus macrocephalus), in a design of entirely randomized groups. Feces were collected during sixteen days. The statistical analysis did not show significant differences in the apparent digestibility of the proteinic fraction due to the concentration levels of the marker incorporated into the diets and the collection days. Consequently, there is nothing to stop us from reducing Cr₂O₃ rate to at least 0.01% in these digestibility assays: spectrophotometry of sdiphenilcarbazide allows us to determine this level or even smaller levels in an accurate, simple, and quick manner.

Keywords: apparent digestibiliy, chromium (III) oxide, fish, s-diphenylcarbazide

Introdução

O coeficiente de digestibilidade aparente é um dos principais parâmetros para avaliar o valor nutritivo dos alimentos, sendo calculada através da diferença entre a quantidade do nutriente ingerido e da quantidade do nutriente remanescente nas excreções fecais. Dois métodos são usados para esse fim: um deles é direto, e requer a completa recuperação das fezes para o cálculo em questão; o outro é indireto, e dispensa a completa recuperação das fezes para esse cálculo, por fazer uso de um marcador na dieta (Choubert et al., 1979). No método indireto envolvendo o uso de indicador inerte na dieta, assume-se que a quantidade do mesmo, na dieta e nas fezes, permaneça constante ao longo do período experimental e que todo o indicador ingerido deva aparecer nas fezes (Utley et al., 1970; Cho et al., 1982; NRC, 1993).

Segundo Titgemeyer (1997), o óxido de crômio (III) foi o marcador mais utilizado para estudos de fluxo da digesta nos trabalhos publicados entre 1986 e 1995, no Journal of Animal Science, 90 de um total de 124, e em função da sua inércia química em sistemas digestórios, essa substância vem sendo empregada há muito tempo como marcador biológico para animais, em estudos de nutrição, digestibilidade, produção e trânsito fecal, em farmacologia e outros, sendo fornecido misturado nas dietas, encapsulado com gelatina, suspenso em óleos, em comprimidos farináceos, ou introduzido diretamente no trato digestório superior por sonda apropriada, para posterior coleta das fezes e dosagem do conteúdo do metal nas mesmas (Haenlein et al., 1966; Furukawa & Tsukahara, 1966; Iturbide, 1967; Kotb & Luckey, 1972; Macoris, 1989).

Deve-se ressaltar que o crômio normalmente nos alimentos é um cátion com número de oxidação 3+ [como no óxido de crômio (III)] e essa deve ser a forma predominante do mesmo nos materiais biológicos em condições normais, nos quais ocorre em teores de mg/kg. Sua absorção só pode ocorrer se estiver na forma solúvel (cloretos, sulfatos, nitratos), nunca na forma insolúvel e estável de Cr2O3. Sendo o marcador fornecido na forma de óxido de crômio (III) e em quantidade muito superior à natural, atravessa o sistema digestório sem reagir, solubilizar-se, ou sofrer absorção, devendo ser totalmente recuperado através das fezes, inclusive sem sofrer a interferência daquele crômio natural, pelo seu teor praticamente desprezível (Bowen, 1964, 1966; Chuecas & Riley, 1966; Furukawa & Tsukahara, 1966; Mertz, 1969; Mertz & Roginsky, 1971). Se fornecido na forma comercial, pode introduzir diminuta quantidade de formas contaminantes e solúveis do metal que, sendo absorvidas pelos animais durante um experimento, poderiam comprometer a interpretação dos resultados experimentais (Whitby & Lang, 1960; Sasson, 1966).

A determinação do crômio em materiais biológicos tem sido realizada por espectrografia de emissão, polarografia, amperometria, ativação neutrônica, cromatografia de gás-líquido, absorção atômica, entre outros menos citados. Com relação aos métodos espectrofotométricos, o único que oferece sensibilidade suficiente para essa dosagem é aquele baseado na reação entre crômio (VI) e s-difenilcarbazida (Graner, 1972), recentemente ajustado por Bremer Neto (1999) especificamente para a determinação do crômio em fezes, quando utilizado como marcador biológico na forma de óxido de crômio (III).

A grande sensibilidade do método da s-difenilcarbazida, entretanto, confronta-se com os níveis elevados do marcador (0,1% até 3%) largamente usados nas dietas experimentais (Lied et al., 1982; Silva & Perera, 1984; La Noue & Choubert, 1985; Shiau & Chen, 1993; Davis & Arnold, 1994; Riche et al., 1995; Gaylord & Gatlin III, 1996; Hill et al., 1996; Gomes & Peña, 1997). Sugere-se, inclusive, que o óxido de crômio (III) nas dietas altere a utilização da glicose, e que afete a digestibilidade com o aumento do seu teor (de 0,5% para 2%) na alimentação de tilápia; um máximo de 0,5% do marcador não afetaria a digestibilidade, e 0,02% seria o nível de Cr2O3 nas dietas para a máxima utilização da glicose (Shiau & Liang, 1995; Shiau & Shy, 1998).

A sensibilidade do método espectrofotométrico da s-difenilcarbazida, permite estudar a possibilidade de diminuição do teor do marcador óxido de crômio (III) em dietas animais de ensaios biológicos, sem que essa diminuição comprometa as conclusões desses ensaios e para isto elegeu-se um estudo sobre o coeficiente de digestibilidade aparente da fração protéica com peixes da espécie piauçu (Leporinus macrocephalus), arraçoados com dietas contendo seis diferentes teores de óxido de crômio (III), variando de 0,01 a 0,2%.

Material e Métodos

O experimento foi realizado entre novembro de 1998 e maio de 1999 conjuntamente no Centro Nacional de Pesquisa de Peixes Tropicais (CEPTA), em Pirassununga/SP, e no Departamento de Química e Bioquímica do Instituto de Biociências - UNESP, Botucatu/SP.

Foram utilizados seis aquários de fibra de vidro, circulares, com 300 L de capacidade, abastecidos por um sistema de circulação aberto, equipado com filtro de areia, e ajustado para um volume de circulação de 5 L/aquário/min. Parâmetros de qualidade da água (pH, amônia, nitrito e oxigênio dissolvido) foram monitorados três vezes por semana. Foi mantido um fotoperíodo com 12 horas de escuro e 12 horas de iluminação.

Quinhentos e dez juvenis de piauçu (Leporinus macrocephalus), com massa média inicial de 70,0 g ± 2,7 g, de um total de 810 indivíduos, foram distribuídos aleatoriamente nos aquários (85 animais/aquário); a distribuição dos tratamentos (níveis do marcador nas rações) também foi aleatória. Antes do experimento, os peixes foram submetidos a períodos de adaptação: um de dez dias, referente ao ambiente, manejo e dieta, e outro de cinco dias, referente às dietas com níveis crescentes do marcador nas respectivas unidades experimentais.

Os tratamentos experimentais constituíram-se de seis dietas isoprotéicas (29% de proteína bruta) e isoenergéticas (2.760 kcal de energia digestível/kg, de energia disponível), segundo as normas do National Research Council, USA (NRC, 1993). As dietas foram preparadas com farinha de peixe (20%), soja texturizada (20%), farelo de trigo (35%), milho (23%), suplemento vitamínico e mineral (2%) e com óxido de crômio (III) apresentando grau de pureza de 99,58%, que após a homogeneização final, foram obtidas as dietas contendo 0,01; 0,02; 0,03; 0,05; 0,1; e 0,2% do elemento crômio, que foram então peletizadas e secas em estufa de circulação forçada de ar (entre 50 e 60^oC) até massa constante.

No período experimental de dezesseis dias, os peixes foram alimentados ad libitum à vontade, quatro vezes ao dia, às 8h30, 11h30, 14h30 e 17h30. Após 15 minutos da primeira e da última alimentação, os resíduos do manejo diário do sistema experimental eram removidos. Limpos os aquários, após a última alimentação diária, as fezes produzidas decantavam em copo coletor ("sistema Guelph") (Cho et al., 1985), e no outro dia, às 7h30, eram recolhidas, secas até massa constante em estufa de circulação forçada de ar, moídas para passar por peneira de 841 mm de abertura de malha, e armazenadas para posterior determinação dos teores de proteína bruta e de crômio.

A determinação do teor de óxido de crômio (III) nas dietas e nas fezes foi feita pelo método espectrofotométrico da s-difenilcarbazida (Bremer Neto, 1999).

A determinação do conteúdo de proteína bruta das dietas e das fezes foi feita pelo clássico método de Kjeldahl: digestão sulfúrica das amostras, com a temperatura mais elevada e catalisada por mistura de óxido de mercúrio (II) e sulfato de sódio, destilação por arraste de vapor da amônia do digerido (fortemente alcalinizado), sua retenção em solução de ácido bórico em excesso, e titulação do ânion borato formado com solução aferida de ácido forte, em presença de mistura indicadora de verde de bromocresol e vermelho de metilo (AOAC, 1995).

O coeficiente de digestibilidade aparente (CDA) da fração protéica das dietas foi estimado de acordo com Cho et al. (1985), na qual os subscritos f e d designam fezes e dieta, respectivamente:

O delineamento experimental foi em blocos inteiramente casualisados. A análise estatística dos resultados obtidos de óxido de crômio (III) nas fezes foi feita por técnica que compara regressões lineares simples, através dos coeficientes angular e linear das mesmas (Ostle & Mensing, 1975); os resultados de proteína bruta nas dietas e em fezes, assim como os de coeficiente de digestibilidade aparente, foram submetidos à análise da variância (Vieira, 1998).

Resultados e Discussão

Os valores médios dos parâmetros ambientais do sistema experimental, tais como oxigênio dissolvido (4,55 mg.L^-1 ± 0,07 mg.L^-1), temperatura (manteve-se constante durante o experimento, 27,8^oC ± 0,2^oC), pH (6,57 ± 0,11), amônia (0,13 mg.L-1 ± 0,01 mg.L^-1) e nitrito (0,05 ± 0,00), mantiveram-se dentro dos intervalos considerados adequados para a preservação da vida e desenvolvimento natural de peixes (Castagnolli & Cyrino, 1986; Castagnolli & Pinto, 1990).

Os resultados das determinações dos teores de óxido de crômio (III) determinado nas dietas, referindo-se a médias de três repetições e expressas na forma de intervalos de confiança (g = 0,95), não se constataram diferenças estatísticas significativas entre os teores do marcador incluído e determinado em cada nível de inclusão (Tabela 1).

A recuperação determinada, aparentemente superior de Cr₂O₃ pode ser atribuída à necessária secagem (e conseqüente concentração do marcador) das dietas para moagem e homogeneização, já que às vezes uma quantidade tão pequena quanto 100 mg de amostra pôde ser tomada para o processo analítico.

Os resultados da determinação do óxido de crômio (III) nas dietas, como nas fezes, foram obtidos através do uso da expressão abaixo, cuja origem deve-se ao ajuste da curva de referência (Tabela 2), envolvendo os pares de dados concentração, Cmarcador (mg/mL), em equivalente de óxido de crômio (III) na solução colorida final, como variável independente, e absorbância, A, como variável dependente. Dos 18 pares de dados envolvidos na regressão linear inerente (coeficiente de correlação linear = 0,9999), obtém-se:

Os resultados das determinações do marcador nas fezes (Tabela 3) foram comparados como regressões, ora envolvendo os dias de coleta das fezes, ora envolvendo os teores de óxido de crômio (III) incluídos nas dietas, não se encontrando diferenças estatísticas significativas em ambos os casos.

Fatores como horário e tipo de alimentação, forma de dosificação, densidade do óxido de crômio (III), número de doses, método e hora de coleta da amostra de fezes, período de adaptação, período de coleta e erros nas determinações químicas são citadas como responsáveis pela variabilidade do teor de óxido de crômio (III), determinado até agora pelos métodos espectrofotométrico do sistema cromato/dicromato, ou espectroscópico de chama de absorção (Hardison & Reid, 1953; Hardison et al., 1956; Pigden & Brisson, 1956, 1957; Brisson, 1956, 1960; Moore, 1957; Putman, 1962). Segundo Corbett et al. (1960), sempre e quando o marcador estiver bem homogeneizado na dieta, os teores determinados nas fezes não apresentarão esta variabilidade, o que foi verificado neste trabalho.

No uso do método indireto envolvendo o uso de indicador inerte na dieta, assume-se que a quantidade do mesmo, no alimento e nas fezes, permaneça constante ao longo do período experimental e que todo o indicador ingerido deva aparecer nas fezes (Utley et al., 1970; Cho et al., 1982), estando de acordo com os resultados deste trabalho, assim, teoricamente uma amostra é suficiente para efetuar as estimações necessárias (Moore, 1957; Iturbide, 1967).

Com relação à proteína bruta das dietas isoprotéicas e isoenergéticas marcadas (Tabela 4), os teores de óxido de crômio (III) incorporados não produziram diferenças estatísticas significativas nos seus teores. Além disso, sua média global (29,00% ± 0,02%), também não diferiu da concentração teórica de proteína bruta na dieta (29%) (g = 0,95).

Com a fórmula preconizada por Cho et al. (1985), calculou-se o coeficiente de digestibilidade aparente (em função da proteína bruta) da dieta fornecida aos peixes, cujos resultados encontram-se na Tabela 5.

Submetidos à análise estatística, não se registraram diferenças significativas entre tais resultados, caracterizando que a diminuição do teor do marcador pelo menos até 0,01% na dieta não influenciou a determinação da digestibilidade aparente (através da fração protéica) em peixes da espécie piauçu (Leporinus macrocephalus), estando de acordo com Shiau & Shy (1998).

Conclusões

Os teores de 0,2 a 0,01% de óxido de crômio (III) incorporados às dietas, como marcador externo, não interferiram nos valores do coeficiente de digestibilidade aparente da fração protéica para o piauçu (Leporinus macrocephalus).

Literatura Citada

Recebido em: 21/03/01

Aceito em: 16/12/02

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1

Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor, pós-graduando do Curso de Pós Graduação em Zootecnia, Área de Concentração de Nutrição e Produção Animal – FMVZ/UNESP, Botucatu/SP.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Ago 2003
• Data do Fascículo
  Abr 2003

Histórico

• Aceito
  16 Dez 2002
• Recebido
  21 Mar 2001