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Revista Brasileira de Zootecnia

On-line version ISSN 1806-9290

R. Bras. Zootec. vol.35 no.6 Viçosa Nov./Dec. 2006

http://dx.doi.org/10.1590/S1516-35982006000800023 

MONOGÁSTRICOS

 

Efeitos de antimicrobianos, prebióticos, probióticos e extratos vegetais sobre a microbiota intestinal, a freqüência de diarréia e o desempenho de leitões recém-desmamados

 

Effects of antimicrobials, prebiotics, probiotics and herbal extracts on intestinal microbiology, diarrhea incidence and performance of weanling pigs

 

 

Carlos Eduardo UtiyamaI; Liliana Lotufo OettingI; Pedro Agostinho GianiII; Urbano dos Santos RuizII; Valdomiro Shigueru MiyadaIII

IPrograma de Pós-graduação em Ciência Animal e Pastagens - Depto de Zootecnia, ESALQ/USP, CEP: 13418-900, Piracicaba/SP
IIIniciação Cientifica, Dep. de Zootecnia da ESALQ/USP, Piracicaba/SP
IIIDepto de Zootecnia, ESALQ/USP, CEP 13418-900, Piracicaba/SP

 

 


RESUMO

Objetivou-se estudar os efeitos de probióticos, prebióticos e extratos vegetais como alternativas aos agentes antimicrobianos (promotores do crescimento), sobre a microbiota intestinal, a ocorrência de diarréia e o desempenho de leitões desmamados. Foram realizados dois experimentos em blocos casualizados, nos quais foram testados, durante 35 dias, cinco tratamentos: controle - ração basal; antimicrobiano - ração basal com 50 ppm de bacitracina de zinco + 50 ppm de olaquindox; probiótico - ração basal com 1.300 ppm de probiótico à base de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis; prebiótico - ração basal com 3.000 ppm de mananoligossacarídeo; extrato vegetal - basal com 500 ppm de extrato vegetal (alho, cravo, canela, pimenta, tomilho, cinamaldeído e eugenol). No Experimento 1, foram utilizados 40 leitões (idade inicial de 21 dias), alocados em 20 baias suspensas, cada uma com dois leitões (um macho castrado e uma fêmea – unidade) e quatro repetições por tratamento. No 35º dia do período experimental, um animal de cada unidade experimental foi abatido para coleta de amostras de conteúdo do jejuno/íleo para análise microbiológica. No Experimento 2, foram utilizados 120 leitões, compondo 12 repetições por tratamento e dois animais (um macho castrado e uma fêmea) por unidade experimental. A freqüência de diarréia foi avaliada diariamente. Nenhum dos tratamentos foi eficaz em alterar a microbiota intestinal e a ocorrência de diarréia. Os agentes antimicrobianos melhoraram o ganho diário nos períodos de 15 a 35 (+22%) e de 1 a 35 (+21,4%) dias de experimentação. O probiótico e os extratos vegetais não promoveram benefício ao desempenho dos animais. O prebiótico, por sua vez, proporcionou desempenho equivalente ao tratamento antimicrobiano nos primeiros 14 dias experimentais, mas não melhorou a conversão alimentar.

Palavras-chave: desempenho, leitões recém-desmamados, microbiota intestinal, promotores de crescimento


ABSTRACT

The purpose of this work was to evaluate the effects of probiotics, prebiotics and herbal extracts as alternatives to antimicrobial agents (as growth promoters) on intestinal microbiology , diarrhea incidence, and on performance of weanling pigs. Two randomized complete block design experiments were carried out during 35 days to compare five treatments: control - basal diet; antimicrobial - basal diet plus Zn bacitracin and olaquindox (50 ppm of each); probiotic - basal diet plus 1,300 ppm of probiotic (Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis); prebiotic - basal diet plus 3,000 ppm of mannanoligosaccharide; herbal extract - basal diet plus 500 ppm of herbal extract (garlic, clove, cinnamon, pepper, thyme, cinnamaldehyde, and eugenol). In the Experiment 1, forty 21-d-weaned pigs were alloted to 20 suspended pens, each one with two pigs (one barrow and one gilt) per pen (experimental unit) and four replications per treatment. On 35th day of experimental period, one animal of each experimental unit was slaughtered to collect the content of the jejunum/ileum for microbiological analysis. In the Experiment 2, one hundred and twenty 21-d-weaned pigs composed 12 replications per treatment and two animals (one barrow and one gilt) per experimental unit. Fecal score was daily evaluated to calculate diarrhea incidence. Treatment effect was observed neither on intestinal microbiology nor on diarrhea incidence. The antimicrobial agents improved average daily gain of weanling pigs, during 1-35 (+21.4%) and 15-35 (+22%) days of experimental periods, compared to pigs fed control diet. The probiotic and herbal extract did not improve piglet growth performance. The performance of piglets fed prebiotic was similar to those fed antimicrobials, during 1-14 days of experimental period. However, feed conversion was not improved.

Key Words: growth promoters, intestinal microbiota, performance, weanling pigs


 

 

Introdução

Os antimicrobianos, quando utilizados como promotores do crescimento, possuem comprovada capacidade de aumentar o desempenho de suínos. Entretanto, seu uso tem sido restringido em diversos países, em virtude da possibilidade de desenvolvimento de resistência bacteriana cruzada (resulta em menor eficiência dos antimicrobianos na terapia animal e humana) e da emergente exigência dos importadores de produtos livres de resíduos de antibióticos (Silva, 2000).

Os probióticos, prebióticos e os extratos vegetais têm sido testados em dietas para suínos recém-desmamados como potenciais alternativas aos antibióticos e quimioterápicos como promotores do crescimento. Os probióticos podem atuar por diferentes mecanismos: exclusão competitiva e antagonismo direto (Menten, 2001), estímulo ao sistema imune (Leedle, 2000), efeito nutricional (Leedle, 2000) e supressão da produção de amônia e neutralização de enterotoxinas (Jin et al., 1997). Os prebióticos, por sua vez, podem aderir a certos patógenos evitando sua adesão e colonização no epitélio intestinal (Macari & Maiorka, 2000). Além disso, podem contribuir para a proliferação de microrganismos benéficos e estimular a resposta imunológica humoral (Ferket, 2002).

Por outro lado, os extratos vegetais ainda são pouco estudados. Entre os possíveis mecanismos de ação dos extratos vegetais no organismo animal, destacam-se o estímulo da digestão, as alterações na microbiota intestinal (efeito antimicrobiano) e a imunomodulação (Mellor, 2000).

Embora alguns efeitos tenham sido demonstrados, há ainda grande desconhecimento dos mecanismos envolvidos nos processos. Assim, este trabalho foi realizado com o objetivo de contribuir na elucidação dos efeitos da utilização de agentes antimicrobianos (bacitracina de zinco e olaquindox), probióticos (Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis), prebióticos (mananoligossacarídeos) e extratos vegetais (alho, cravo, canela, pimenta, tomilho e os princípios ativos eugenol e cinamaldeído) sobre a microbiota intestinal, a freqüência de diarréia e o desempenho de suínos recém-desmamados.

 

Material e Métodos

Foram conduzidos dois experimentos (35 dias cada um) em blocos casualizados na creche experimental do Setor de Suinocultura do Departamento de Zootecnia da Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", da Universidade de São Paulo. A creche experimental possuía baias metálicas suspensas, cada uma com área de 1,80 m2, providas de comedouros automáticos, bebedouro tipo chupeta e aquecimento complementar.

Foram avaliados cinco tratamentos: controle - ração basal; antimicrobiano - ração basal com 50 ppm de bacitracina de zinco e 50 ppm de olaquindox; probiótico - ração basal com 1.300 ppm de probiótico à base de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis (4,16 x 109 de esporos viáveis por kg de ração); prebiótico - ração basal com 3.000 ppm de mananoligossacarídeo; extrato vegetal - ração basal com 500 ppm de extrato vegetal (alho, cravo, canela, pimenta, tomilho, cinamaldeído e eugenol).

Em ambos os experimentos, foram utilizadas duas dietas basais: pré-inicial (1º ao 14º dia de experimento) e inicial (15º ao 35º dia). Foram utilizados os valores preconizados pela Ajinomoto Biolatina Ind. e Com. Ltda. para determinação da composição dos alimentos e das exigências nutricionais. As composições percentuais das dietas basais, assim como os valores calculados de alguns nutrientes, são descritos na Tabela 1.

 

 

No Experimento 1, para as análises microbiológicas, foram utilizados 40 leitões híbridos desmamados aos 21 dias de idade (peso inicial de 5,87±0,46 kg e peso final de 17,94±2,42 kg), distribuídos em 20 baias (dois animais por baia), de acordo com o peso, totalizando quatro blocos (repetições) por tratamento. Os animais foram alimentados à vontade durante todo o período experimental (35 dias).

As análises microbiológicas foram realizadas em função do perfil de contaminação das instalações experimentais. Foram identificados Streptococcus spp., Staphylococcus spp., E.coli, Campylobacter coli e Clostridium perfringens em animais sadios e com diarréia, instalados na creche experimental antes do início dos experimentos.

No 35º dia do experimento, um animal de cada unidade experimental foi abatido para coleta de amostras do conteúdo do jejuno/íleo (segmento de 10 cm retirado a 1 m da junção íleo-cecal) pelo método de raspagem. Após a coleta, as amostras foram submetidas às análises microbiológicas para identificação dos microrganismos totais, gram-positivos totais, gram-negativos totais, Bacillus spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Salmonella spp. e E. coli pelo método de plaqueamento preconizado por Lennette et al. (1985). A identificação e quantificação dos gêneros Campylobacter coli e Clostridium perfringens foram feitas de acordo com as técnicas descritas por Scarcelli et al. (1998) e Bressani (2001), respectivamente.

No Experimento 2, para determinação da freqüência de diarréia e análise do desempenho, foram utilizados 120 leitões híbridos, com 21 dias de idade e 6,04±0,46 kg de peso inicial, distribuídos em 60 baias (dois animais por baia) de acordo com o sexo e o peso, totalizando 12 blocos (repetições) por tratamento, sendo quatro blocos em cada um dos três períodos.

Os animais receberam água e ração à vontade. As variáveis de desempenho (consumo diário de ração, ganho diário de peso e conversão alimentar) foram calculadas por meio da pesagem e quantificação semanal das sobras de ração. A avaliação visual das fezes foi feita diariamente, atribuindo-se escores de 0 a 3 para cada animal: 0 = fezes sólidas, 1 = fezes pastosas, 2 = fezes líquidas/pastosas e 3 = fezes líquidas. Apenas os escores 2 e 3 indicavam a ocorrência de diarréia. Assim, pôde-se calcular a porcentagem de dias com ocorrência de diarréia nos períodos de 1 a 14, 15 a 35 e 1 a 35 dias de experimento.

Os dados referentes à microbiologia intestinal, originalmente em ufc/g (unidades formadoras de colônias/g de amostra), foram transformados pela função y = log x, em que x é o número de unidades formadoras de colônias/g (ufc/g). Os dados de freqüência de diarréia, em %, foram transformados pela função , de acordo com o recomendado por Barbin (2003), e posteriormente submetidos aos testes de adequação ao modelo linear, à análise de variâncias (PROC GLM do SAS 2001) e à comparação de médias pelo teste Tukey.

 

Resultados e Discussão

Os resultados obtidos nas análises microbiológicas (Experimento 1) são apresentados na Tabela 2. As variáveis Staphylococcus spp., Campylobacter coli, Clostridium perfringens e Salmonella spp. não foram analisadas. A presença de Staphylococcus (animal do tratamento extrato vegetal) e Campylobacter coli (animal do tratamento prebiótico) foi observada em apenas uma amostra, enquanto a de Clostridium perfringens foi identificada em quatro amostras (um animal de cada tratamento, exceto o tratamento probiótico). Os microrganismos Salmonela spp. não foram identificados em nenhuma das amostras. Nenhum dos tratamentos foi eficaz em definir um perfil específico da microbiota para as variáveis estudadas (microrganismos totais, gram-positivos totais, gram-negativos totais, Bacillus spp., Escherichia coli, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Campylobacter coli, Clostridium perfringens).

Como poucos animais apresentaram contaminação por esses microrganismos, não foi possível identificar o perfil de ação dos promotores de crescimento sobre parte da microbiota, possivelmente em decorrência de fatores como procedência e estado sanitário e nutricional dos animais experimentais, melhor qualidade das dietas experimentais e problemas na coleta e no transporte das amostras.

Os animais do Experimento 1 receberam na granja de origem, a partir do 7º dia de vida, uma alimentação complexa, livre de promotores de crescimento, e apresentavam excelentes condições sanitárias e corporais. Esses animais eram mais pesados e sadios que aqueles utilizados nas análises prévias de contaminação microbiológica. Esta diferença na saúde e no estado geral dos leitões pode talvez ser uma das causas da ausência de efeitos sobre a microbiota.

Os animais submetidos às análises prévias de microrganismos receberam uma dieta menos complexa, composta por milho, farelo de soja, pré-misturas mineral e vitamínica e óxido de zinco (preventivo de diarréias). Às dietas experimentais foram adicionados plasma sanguíneo spray dried, lactose, soro de leite em pó e aminoácidos sintéticos. Não foi adicionado nenhum promotor de crescimento nas dietas do tratamento controle. No entanto, as dietas continham 4 e 2% de plasma sangüíneo spray dried nas fases pré-inicial e inicial, respectivamente. Este ingrediente possui imunoglobulinas que auxiliam no equilíbrio da microbiota do leitão recém-desmamado, resultando em melhoras no desempenho e no estado de saúde (Kats et al., 1994; Gatnau et al., 1995; Caim & Zimmerman, 1997). Assim, o plasma spray dried, aliado à qualidade de ingredientes lácteos, pode ter sido importante no controle da microbiota patogênica.

Além da procedência dos animais e da qualidade das dietas, deve-se considerar que problemas podem ter ocorrido durante a coleta e o transporte das amostras, como, por exemplo, a baixa sobrevivência das bactérias do momento da coleta à semeadura nos meios de cultivos. Segundo Apajalahti & Bedford (1999), a coleta e o transporte das amostras são os pontos mais críticos na análise microbiológica em meios de cultura, pois uma exposição ao ar, mesmo que em períodos mínimos até o momento da semeadura, pode levar à alteração drástica no perfil e na quantidade de microrganismos. Por isso, as técnicas de cultivo em meios de cultura são limitadas e podem produzir dados muito pouco precisos ou equivocados (Apajalahti & Bedford, 1999; Simpson et al., 1999). Segundo Apajalahti & Bedford (1999), as técnicas moleculares de identificação e quantificação microbiana que estão sendo desenvolvidas são mais adequadas.

Outro argumento que pode acusar problemas nas análises microbiológicas está relacionado à ausência de efeito dos antimicrobianos sobre o perfil dos microrganismos analisados. Quando há desafio, ocorre melhora no desempenho dos animais alimentados com promotores de crescimento antimicrobianos. Este efeito está relacionado à ação dos antimicrobianos sobre a microbiota intestinal, pois, como demonstrado por Menten (1995), animais "germ-free" não são beneficiados.

Portanto, os possíveis problemas no processo de coleta, transporte e análise das amostras podem ter influenciado as análises microbiológicas, que, por sua vez, demonstraram não haver efeito dos promotores do crescimento sobre a microbiota.

A freqüência de diarréia não foi alterada (P>0,10) em nenhum dos períodos analisados. Portanto, nenhum dos tratamentos foi efetivo no controle de diarréias (Tabela 3).

Diversos fatores podem ter sido preponderantes na causa de diarréias pós-desmame, principalmente no período de 1 a 14 dias de experimentação. Segundo Kelly & King (2001), o estresse da separação da porca, o transporte e o novo ambiente podem provocar alterações morfohistológicas importantes, deixando o leitão mais exposto às perturbações intestinais.

As diarréias no período pós-desmame também podem ser causadas pela colonização da superfície epitelial por patógenos, como a Escherichia coli enterotoxigênica, Salmonella typhimurium e Clostridium spp. (Stewart & Chesson, 1993). Para fixação ao epitélio e colonização, as bactérias patógenas devem penetrar no muco glicoprotéico que reveste a superfície epitelial, por penetração quimiostática ou movimento ao longo de lacunas no muco (Vassalo et al., 1997). Além disso, resíduos alimentares não digeridos e não absorvidos servem como substratos para fermentação pela microbiota intestinal, elevando a produção de ácido lático e ácidos graxos voláteis. Estes substratos, juntamente com os resíduos alimentares ainda restantes e íons (sódio, potássio e cloreto), aumentam a osmolaridade do conteúdo intestinal. Assim, o processo de reabsorção de água é dificultado e ocorre um afluxo de água para a luz intestinal, desencadeando a diarréia (Etheridge et al., 1984; Nabuurs et al., 1993).

Portanto, outros fatores que fogem ao espectro de ação dos promotores do crescimento utilizados podem ter sido determinantes na ocorrência de diarréias.

As médias das variáveis de desempenho obtidas nos períodos de 1 a 14, 15 a 35 e 1 a 35 dias de experimentação são apresentadas nas Tabelas 4, 5 e 6, respectivamente.

 

 

Aos 14 dias de experimentação, o peso vivo (PV 14) e o ganho diário de peso dos animais do tratamento prebiótico foi superior (P<0,05) ao dos animais do tratamento extrato vegetal. Foi observado também maior (P<0,10) consumo diário de ração para os tratamentos antimicrobiano e prebiótico em relação ao tratamento extrato vegetal. Os tratamentos controle e probiótico, no entanto, não diferiram estatisticamente (P<0,10) de nenhum dos outros tratamentos e apresentaram valores intermediários de consumo. A conversão alimentar não foi afetada (P>0,10) pelos tratamentos.

No período de 15 a 35 dias de experimentação, o consumo diário de ração foi superior no tratamento antimicrobiano (P<0,05) em relação aos tratamentos probiótico e extrato vegetal. Os tratamentos prebiótico e controle não diferiram (P>0,05) de nenhum outro tratamento. O peso vivo aos 35 dias de experimentação e o ganho diário de peso do tratamento antimicrobiano foram superiores (P<0,05) aos obtidos nos tratamentos controle, probiótico e extrato vegetal, que não diferiram (P>0,05). O tratamento prebiótico não diferiu (P>0,05) de nenhum outro e apresentou valor intermediário ao dos tratamentos controle e com antimicrobianos. A conversão alimentar não foi afetada (P>0,05) pelos tratamentos.

No período de 1 a 35 dias de experimentação, o consumo diário de ração dos animais do tratamento antimicrobiano foi superior (P<0,05) ao obtido nos tratamentos extrato vegetal e probiótico. O consumo diário de ração no tratamento prebiótico não diferiu (P>0,05) dos obtidos nos tratamentos controle e antimicrobiano. Novamente, a conversão alimentar não foi afetada (P>0,05) pelos tratamentos.

O consumo diário de ração dos leitões do tratamento antimicrobiano foi superior ao dos animais do tratamento controle, proporcionando resultado superior no ganho diário de peso, principalmente no período de 1 a 35 dias de experimentação, quando a melhora foi de 21,4% em comparação ao tratamento controle. O aumento no ganho diário de peso foi superior à média encontrada na literatura, de 11%, calculada por Menten (1995) a partir de uma compilação de dados de experimentos realizados no Brasil. Esse resultado indica uma situação de elevado desafio aos leitões durante o período experimental, pois, quanto maior o desafio, maior o efeito dos antimicrobianos (Menten, 2001). Embora as análises microbiológicas não tenham identificado nenhuma alteração no perfil da microbiota de animais do tratamento antimicrobiano, é possível que tenha havido desafio microbiológico e que os antimicrobianos tenham agido sobre a microbiota, melhorando o desempenho dos leitões.

Ao contrário do tratamento antimicrobiano, o consumo diário de ração pelos animais do tratamento extrato vegetal, em todos os períodos, foi relativamente baixo, sendo numericamente inferior, inclusive, ao tratamento controle. Os extratos vegetais adicionados às dietas possuíam diversos fatores pungentes que podem ter causado esse efeito, pois, de acordo com a pesquisadora responsável pelo encapsulamento, o material encapsulante libera o conteúdo ao entrar em contato com a saliva, o que, possivelmente, foi uma das causas do baixo ganho de peso em todos os períodos.

Os extratos vegetais podem estimular a secreção de enzimas (amilase, sacarase e lipase), saliva, suco gástrico, suco pancreático e sais biliares (Sambaiah & Srinivasan, 1991; Platel & Srinivasan, 1996; Wang & Bourne, 1998), mas esse tipo de efeito não refletiu na conversão alimentar dos leitões submetidos ao tratamento extrato vegetal, pois não houve diferença significativa em relação ao tratamento controle. No entanto, a diferença de 6,9% na conversão alimentar dos animais do tratamento extrato vegetal em relação ao tratamento controle no período de 15 a 35 dias de experimentação indica que esse efeito poderia ter sido identificado caso o número de repetições fosse mais elevado.

Situação semelhante ocorreu com o consumo diário de ração pelos leitões do tratamento probiótico, proporcionando ganho diário de peso inferior em todos os períodos. O resultado de desempenho do tratamento probiótico difere de algumas referências encontradas na literatura científica. Segundo Bellaver (2000), os resultados das pesquisas com probióticos serem muito variáveis, todavia, Stewart & Chesson (1993) reuniram trabalhos na literatura utilizando diversos tipos de probióticos e concluíram que, em média, ocorre um aumento de 4,8% no ganho diário de peso de leitões na fase inicial. Como o desempenho dos animais não foi melhorado, o probiótico utilizado pode não ter sido adequado à situação de desafio microbiano do experimento. Em alguns experimentos, o uso de probióticos à base de Bacillus toyoi (Vassalo et al., 1997) e Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis (Kreuzer, 1994; Budiño, 2004) melhorou o ganho diário de peso de leitões recém-desmamados, porém, não havia desafio microbiológico nas instalações, pois não houve diferença entre os tratamentos controle e antimicrobiano. Esses resultados sugerem que o efeito do probiótico esteja relacionado ao grau de desafio das instalações utilizadas.

O resultado de ganho de peso do tratamento prebiótico, principalmente nos primeiros 14 dias de experimentação, foi ocasionado pelo maior consumo diário de ração, visto que a conversão alimentar não foi afetada pelo tratamento. Spring (2000) relatou alguns trabalhos científicos nos quais o uso de mananoligossacarídeo nas dietas de leitões recém-desmamados melhorou (P<0,05) o ganho diário de peso e o consumo diário de ração, mas não alterou a conversão alimentar. Este desempenho dos animais pode estar relacionado à ação do mananoligossacarídeo sobre a resposta imune. O mananoligossacarídeo tem demonstrado ser um agente promotor da imunidade humoral contra microrganismos patógenos específicos, evitando a colonização, permitindo sua apresentação às células do sistema imune (Ferket, 2003) e aumentando a presença de IgG no sangue e de IgA na bile e na mucosa intestinal (Savage et al., 1996). Com a ativação da resposta humoral, há economia de energia, pois a resposta inflamatória ativa despende de esforço energético maior.

 

Conclusões

O uso de antimicrobianos, de probióticos, de prebióticos e de extratos vegetais não alterou a microbiota intestinal e a frequência de diarréia em leitões recém-desmamados.

Os agentes antimicrobianos promoveram melhora no desempenho dos animais; o prebiótico proporcionou desempenho equivalente ao obtido com os antimicrobianos nos primeiros 14 dias de experimentação. O probiótico e os extratos vegetais, no entanto, não propiciaram nenhuma melhora nas características estudadas.

 

Agradecimento

À FAPESP, pelo financiamento do projeto de pesquisa.

À MCassab Com. e Ind. Ltda. e APC Inc. (plasma sangüíneo AP920 e lactose), à Ajinomoto Biolatina Ind. e Com. Ltda. (aminoácidos), à Sloten do Brasil Ind. e Com. Ltda. (soro de leite K-10 e K-21), à Alltech do Brasil Agroindustrial Ltda. (mananoligossacarídeo), à Givaudan do Brasil Ltda. (óleos essenciais e princípios ativos utilizados nos extratos vegetais), e à CHR Hansen Ind. e Com. Ltda. (probiótico Bio Plus 2B), pela doação de ingredientes para a realização dos experimentos.

À Professora Maria Inês Ré, responsável pelo Laboratório de Tecnologia de Partículas do IPT/USP, pela colaboração ao projeto no microencapsulamento dos óleos essenciais.

 

Literatura Citada

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Recebido: 30/08/04
Aprovado: 12/06/06

Pesquisa financiada pela FAPESP.

 

 

Correspondências devem ser enviadas para: ceutiyama@yahoo.com

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