Avanços recentes em nutrição de larvas de peixes

Recent advances in nutrition of fish larval

AQÜICULTURA

Avanços recentes em nutrição de larvas de peixes

Recent advances in nutrition of fish larval

Luís Eugénio Castanheira da Conceição; Cláudia Aragão; Nadège Richard; Sofia Engrola; Paulo Gavaia; Sara Mira; Jorge Dias

Centro de Ciências do Mar - CCMAR, Universidade do Algarve, Campus de Gambelas, 8005-139, Faro, Portugal

RESUMO

Os requisitos nutricionais de larvas de peixes são ainda mal compreendidos, o que leva a altas mortalidades e problemas de qualidade no seu cultivo. Este trabalho pretende fazer uma revisão de novas metodologias de investigação, tais como estudos com marcadores, genómica populacional, programação nutricional, génomica e proteómica funcionais, e fornecer ainda alguns exemplos das utilizações presentes e perspectivas futuras em estudos de nutrição de larvas de peixes.

Palavras-chave: estudos com marcadores, genómica, nutrição de larvas de peixes, programação nutricional, proteómica

ABSTRACT

Major gaps in knowledge on fish larval nutritional requirements still remain, what leads to high mortalities and quality problems in marine larviculture. This paper reviews a range of new tools, such as tracer studies, population genomics, nutritional programming, functional genomics and proteomics, as well as some examples of their present use, and potential future applications in the study of fish larvae nutrition.

Key words: fish larvae nutrition, genomics, nutritional programming, proteomics, tracer studies

Introdução

A produção de juvenis de peixes de alta qualidade é um dos factores chaves para o crescimento sustentável da indústria da aquacultura. Ainda que já se produzam grandes quantidades de larvas de muitas espécies de peixes, as taxas de sobrevivência são muitas vezes baixas ou variáveis, existem problemas de qualidade (e.g., deformações no esqueleto, anomalias de pigmentação) e o potencial de crescimento nem sempre é aproveitado ao máximo (e.g., Koumoundouros et al., 1997; Shields, 2001; Cahu et al., 2003). Estes problemas são causados, pelo menos em parte, por deficiências nutricionais, pois mesmo para as espécies melhor estudadas existem ainda muitas lacunas acerca dos requisitos nutricionais das larvas de peixes, em particular dos marinhos (Takeuchi, 2001; Bell et al., 2003; Cahu et al., 2003). O progresso no seu estudo é lento e difícil, devido ao pequeno tamanho das larvas e a dificuldades na aceitação de microdietas inertes.

No entanto, nos últimos anos, vários métodos novos permitiram progressos significativos e abriram boas perspectivas futuras no estudo dos requisitos nutricionais de larvas de peixes. Estes incluem estudos com marcadores, isotópicos ou outros, modelação mecanística, genómica de populações, genómica funcional, proteómica, entre outras.

Este artigo pretende fazer uma revisão destas novas metodologias de investigação e fornecer ainda alguns exemplos das suas utilizações presentes e futuras em estudos de nutrição de larvas de peixes.

Estudos com marcadores

Tube-feeding

O método tube-feeding controlado de nutrientes radiomarcados foi desenvolvido por Rust et al. (1993) e modificado por Rønnestad et al. (2001a), permitindo estimar a fracção evacuada, catabolizada e retida de cada nutriente pelas larvas de peixe. Este método tem sido aplicado para estudar a digestão, absorção e metabolismo de proteínas e lípidos em larvas de diferentes espécies de peixes. Alguns estudos analisaram a dinâmica de absorção de aminoácidos (AA) livres, péptidos e proteínas hidrolisadas ou intactas pelas larvas de peixes (Rønnestad et al., 2000; Rojas-García & Rønnestad, 2003; Tonheim et al., 2005), demonstrando que estas têm dificuldade em digerir dietas contendo proteínas complexas, como é o caso das dietas contendo farinha de peixe. Outros estudos demonstraram ainda que a absorção dos lípidos a nível intestinal diminui à medida que a sua complexidade aumenta e que a digestibilidade dos ácidos gordos é maior quanto maior for o seu grau de insaturação (Morais et al., 2005a,b; Mollan et al., 2008).

A técnica de "tube-feeding" tem também sido utilizada para o estudo do metabolismo de AA individuais. Assim, foi demonstrado que as larvas de peixe usam preferencialmente os AA dispensáveis como substrato energético, sendo os AA indispensáveis preferencialmente utilizados para crescimento (Rønnestad et al., 2001b; Conceição et al., 2002; Appelbaum & Rønnestad, 2004). Da mesma forma, verificou-se que os AA aromáticos (fenilalanina e tirosina) são preferencialmente retidos em larvas de linguado do Senegal (Solea senegalensis) durante o clímax da metamorfose (Pinto et al., 2009).

Esta técnica permite também analisar os efeitos a curto prazo dos suplementos de AA das dietas no metabolismo larvar, assim como verificar se determinados AA estão a limitar a síntese proteica (Aragão et al., 2004; Saavedra et al., 2008a,b). Embora com o recurso a técnica de "tube-feeding" seja possível ultrapassar diversos constrangimentos inerentes ao estudo da digestão e metabolismo de nutrientes em larvas de peixe, deve considerar que o stress imposto às larvas ao utilizar esta técnica pode alterar as suas taxas de digestão, absorção e utilização (Conceição et al., 2007a). No entanto, em espécies resistentes ao stress, como o linguado do Senegal, esta técnica não aparenta afectar a capacidade de ingestão ou de utilização do alimento pelas larvas (Ribeiro et al., 2008). Por outro lado, o recurso a esta técnica pode também conduzir a um valor sobrestimado da retenção de nutrientes, pois usualmente são utilizadas larvas em jejum ou que são alimentadas uma única vez, o que pode conduzir a um aumento da eficiência de absorção (Conceição et al., 2007a; Engrola et al., 2009).

Marcação de artemia

A metodologia de incorporação de marcadores isotópicos em presas vivas tem sido utilizada em vários estudos larvares de modo a quantificar a ingestão de alimento, permitindo também uma melhor compreensão do metabolismo proteico e lipídico (Govoni et al., 1982; Conceição et al., 1998; Morais et al., 2006). A metodologia base implica a incorporação de AA marcados com ¹⁴ Carbono (¹⁴C)na proteína de Artemia (Morais et al., 2004a) e se a mesma for conjugada com o método das câmaras metabólicas (Rønnestad et al., 2001a), como descrito na secção anterior, é possível determinar a ingestão de alimento e como o nutriente marcado é digerido, retido e catabolizado pela larva. A utilização desta metodologia em diferentes fases larvares de peixes permite uma melhor compreensão da capacidade digestiva da larva, assim como relacioná-la com o metabolismo de nutrientes. Sendo assim, Morais et al. (2004b) e Engrola et al. (2009) observaram que as larvas de linguado do Senegal possuem uma elevada absorção/digestibilidade da proteína de Artemia (57-83% do total de Artemia ingerida), entre os 8 e 35 DAE. Isto indica que o linguado tem uma elevada capacidade para digerir presas vivas desde o início do desenvolvimento larvar. Em larvas de arenque (Clupea harengus) com 31 DAPA, a absorção/digestibilidade da proteína de Artemia foi de 60%, da qual 39% foi catabolizada e 20% retida pelas larvas (Morais et al., 2004a).

Ingredientes protéicos, como a farinha de peixe, utilizados nas dietas para larvas de peixes poderão ser muito complexos para o sistema digestivo imaturo destas (Rønnestad & Conceição, 2005; Conceição et al., 2007a), causando assim uma reduzida digestibilidade proteica. Como a digestibilidade e a retenção proteica são processos chave para a definição de um crescimento larvar óptimo, assim como para a taxa de sobrevivência, Engrola et al. (in press) avaliaram os efeitos de dois níveis distintos de substituição de Artemia por dietas inertes em larvas de linguado do Senegal, determinando a digestibilidade e retenção da proteína de Artemia com a utilização da metodologia de incorporação de nutrientes marcados com isótopos. O regime alimentar com uma baixa substituição (20% do total de Artemia por dieta inerte) não afectou a utilização proteica larvar. Porém, as larvas submetidas ao regime com uma elevada substituição (58% do total de Artemia por dieta inerte) sofreram uma redução na absorção/digestibilidade e na eficiência de retenção da proteína de Artemia entre os 6 e 15 DAE (Engrola et al.,in press). Em relação à utilização lipídica larvar, Mai et al. (in press) observaram que as larvas de linguado do Senegal quando submetidas a um regime alimentar com substituição de Artemia por dieta inerte gerem com maior cuidado a relação crescimento e digestibilidade lipídica, porém sem por em causa a utilização metabólica dos lípidos. A retenção lipídica na fase larvar anterior à metamorfose foi maior nas larvas do regime alimentar com elevada substituição de Artemia por dieta inerte, valores de 50%, enquanto quase duplicou durante o clímax da metamorfose, atingindo valores de 80%. Os resultados sugerem que o crescimento larvar é afectado durante o clímax da metamorfose, porém as larvas conseguem compensar a redução da digestibilidade proteica aumentado a eficiência de retenção dos lípidos.

A modelação mecanística tem sido usada para integrar os conhecimentos existentes e melhor compreender os resultados obtidos em estudos com marcadores (Conceição et al., 2007b). Enquanto os estudos com marcadores isotópicos fazem medições pontuais em certo(s) ponto(s) do desenvolvimento, a modelação mecanística permite integrar a análise cinética da distribuição do marcador isotópico entre os diferentes compartimentos (pools). Simulações com um modelo baseado nos resultados de Morais et al. (2004b), em que larvas de linguado foram alimentadas com uma refeição de artémia marcada com¹⁴C-AA, sugerem que a digestão e processamento metabólico da proteína contida na artémia se efectua essencialmente nas primeiras três horas após a alimentação (Conceição & Rønnestad, 2004) e que, de forma a optimizar o potencial de crescimento de larvas de linguado, estas devem ser alimentadas com uma elevada frequência.

Em conclusão, a combinação de marcadores isotópicos com diferentes ingredientes e tipos de alimentos poderá ser utilizada para uma melhor compreensão da plasticidade metabólica larvar e ser relacionada com a performance de crescimento. A obtenção de um conhecimento profundo de como as larvas digerem os diferentes nutrientes (proteína e lípidos) e seguidamente como os vários AA e ácidos gordos são transformados em proteínas ou catabolizados para energia, poderá ser crucial para o desenvolvimento de dietas inertes adequadas para larvas de peixe.

Biodisponibilidade

Nos últimos anos têm sido desenvolvidos métodos de forma a determinar os requisitos qualitativos de AA nas larvas de peixes, tendo em conta as diferenças na biodisponibilidade de cada AA (e.g., Conceição et al., 2003a; Saavedra et al., 2007). As biodisponibilidades dos diversos AA podem ser diferentes entre elas, devido a uma absorção e/ou um catabolismo selectivo. Estes métodos recentemente desenvolvidos permitem determinar a biodisponibilidade relativa individual de vários AA nas larvas de peixe, ou seja, quantificam a eficiência de absorção e a taxa de catabolismo de cada AA quando comparado com outro AA (Conceição et al., 2003b). O princípio básico destes métodos consiste em alimentar as larvas com uma dieta marcada com isótopos estáveis ou radioactivos e posteriormente analisar o enriquecimento isotópico relativo de cada AA individualmente, quer na dieta quer na larva. Após se ter estimado as biodisponibilidades relativas individuais de cada AA, estes resultados podem ser aplicados ao perfil de AA indispensáveis das larvas e assim obtém-se uma estimativa do perfil de AA ideal da dieta. Esta metodologia fornece-nos uma estimativa mais precisa dos requisitos qualitativos de AA das larvas de peixes, do que aquela que é obtida utilizando apenas os perfis de AA indispensáveis das larvas como indicador.

Exemplos da aplicação deste método podem já ser encontrados na literatura. Por exemplo, Conceição et al. (2003a) utilizaram este método para determinar a biodisponibilidade relativa de cada AA nas larvas de dourada (Sparus aurata). Aplicando as estimativas assim obtidas ao perfil de AA indispensáveis de larvas de dourada, Aragão Teixeira (2004) demonstrou que a treonina era um AA limitante na dieta, enquanto a lisina não o era, contrariamente ao sugerido quando não se aplicam os resultados da biodisponibilidade. Da mesma forma, Saavedra et al. (2007) estimaram a biodisponibilidade relativa dos AA nas larvas de sargo-bicudo (Diplodus puntazzo ) e demonstraram que, quando se tem em consideração estes dados, em certas fases de desenvolvimento das larvas o conteúdo de lisina, metionina e treonina na dieta é deficitário, enquanto o de leucina se encontra em excesso, contrariamente ao que era aparente não utilizando os dados de biodisponibilidade. Embora este técnica forneça uma indicação mais precisa sobre os requisitos qualitativos de AA das larvas de peixes, convém sempre ter em consideração que a biodisponibilidade relativa de cada AA é específica para cada espécie e que provavelmente apresenta diferenças ao longo da ontogénese dos peixes (Conceição et al., 2007a).

Turnover de proteínas

A utilização de AA da dieta, após a sua absorção a nível intestinal, depende da quantidade que é usada para a produção de energia, mas também da intensidade do turnover de proteínas. As proteínas dos tecidos estão em permanente renovação, através dos processos de síntese e degradação (ou turnover) de proteínas. O crescimento, ou a deposição de proteínas, depende do resultado liquido destes dois processos de sinal contrário ou seja, de um aumento da síntese proteica e/ou de uma diminuição do turnover de proteínas (Wiesner & Zak, 1991).

Foi já demonstrado que as larvas de peixe por crescerem rapidamente tendem a ser mais eficientes na deposição de proteínas comparadas com larvas de crescimento mais lento (Conceição et al., 2008). Isto explica-se pelo facto de larvas com maior taxa de crescimento terem necessariamente uma taxa de síntese proteica maior, porém a taxa de turnover de proteínas não acompanha a tendência, ao contrário do que acontece em peixes juvenis e adultos (Houlihan et al., 1994). Esta peculiaridade das larvas de peixes resulta provavelmente da vantagem selectiva de um maior tamanho, que por sua vez se traduz numa forte vantagem competitiva de larvas de crescimento rápido (logo mais eficientes na utilização da proteína) durante a selecção natural (Kiørboe, 1989; Conceição et al., 1997).

Está também demonstrado que um turnover de proteínas elevado pode ter vantagens importantes em termos de uma adaptação mais rápida a alterações ambientais e a outras condições de stress (Kiørboe et al., 1987; Hawkins 1991). Os mexilhões (Mytilus edulis) ao apresentarem taxas de turnover de proteínas mais elevadas têm uma adaptação mais rápida a um choque de temperatura (Hawkins et al., 1987). As larvas de pregado (Scophthalmus maximus) ao serem alimentadas com rotíferos enriquecidos com um imunoestimulante apresentaram uma taxa de turnover de proteína três vezes superior ao de um grupo controlo (Conceição et al., 2002), o que pode significar uma maior resistência a eventuais patógenos. No entanto, e uma vez que o turnover de proteínas tem um elevado custo energético (Houlihan, 1991), qualquer aumento no turnover tende a provocar uma diminuição no crescimento. Assim, as larvas de peixes nos seus diferentes estádios de desenvolvimento poderão também ter de fazer uma escolha, ou encontrar um compromisso, entre um crescimento rápido e/ou uma maior capacidade de resposta a condições de stress e de doença (Conceição et al., 2002).

Seleção de dieta

Atualmente, a maioria dos regimes alimentares para larvas de peixes marinhos é estruturada de modo a incorporar presas vivas e dietas inertes, pois as últimas são mais fáceis de utilizar e apresentam uma composição estável durante todo o período de cultivo, enquanto as presas vivas variam a sua composição conforme as condições de cultivo ou enriquecimento utilizado. Conjuntamente, a incorporação de marcadores isotópicos nas pequenas partículas das dietas para larvas, de modo a ser possível determinar a escolha de dietas (ingestão de alimento) e consequente utilização metabólica, é extremamente difícil, além de que devido às reduzidas dimensões das partículas a lixiviação de nutrientes é muito elevada (López-Alvarado et al., 1994; Yúfera et al., 2002; Kvåle et al., 2006; Nordgreen et al., 2007). Por conseguinte, para que seja possível determinar que dieta (presa viva ou dieta inerte) uma larva prefere e como os seus nutrientes são utilizados é necessário desenvolver novas metodologias que sejam adaptadas a fases larvares de peixes.

Geralmente, a determinação de ingestão de alimento em larvas é realizada através da contagem directa das presas (Haylor, 1993; MacKenzie et al., 1999) ou partículas de dietas inertes (Fernández-Díaz et al., 1994; Yúfera et al., 1995). Esta metodologia é extremamente morosa e por vezes incorrecta. Portanto, foi proposto que a metodologia de marcadores isotópicos poderia ser utilizada para a determinação do efeito dos regimes alimentares em larvas de peixe (revisto por Conceição et al., 2007a). A utilização de isótopos estáveis (e.g.,¹³C ou ¹⁵N) ou de radioisótopos (e.g., ³H, ¹⁴C ou ³⁵S) para a determinação da ingestão de alimento e metabolismo de nutrientes em larvas foi um avanço na melhoria das técnicas, pois estas são mais simples de utilizar e possuem níveis elevados de detecção (Boehlert & Yoklavich, 1984; Rust, 1995; Kolkovski et al., 1997; Conceição et al., 2001; Kvåle et al., 2006; Gamboa-Delgado et al., 2008; Jomori et al., 2008; Engrola et al., 2009). Sendo assim, foi observado em pós-larvas de linguado do Senegal de 16-17 DAE alimentadas com substituição de Artemiapor dieta inerte, que estas ingerem 11% de alimento em relação ao peso corporal, com uma digestibilidade de 57% (Engrola et al., 2009) e que deste alimento, 62% é utilizado para crescimento (Gamboa-Delgado et al., 2008). Em larvas de dourada, utilizando uma metodologia de marcação isotópica dupla (dieta inerte marcada com ¹⁴C e Artemia marcada com ³H), foi possível observar que existe um aumento de ingestão da dieta inerte por parte da larva quando esta se encontra na presença de Artemia (Kolkovski et al., 1997). Contudo, a metodologia de incorporação de radiomarcadores possui algumas limitações. A determinação da ingestão de alimento é realizada em volumes pequenos o que é bastante diferente da situação normal de cultivo larvar e produz lixo radioactivo. Por outro lado, os métodos para determinação do consumo de alimento através de marcadores estáveis podem ser utilizados nas situações normais de cultivo, porém tornam-se mais dispendiosos a nível económico.

Os marcadores inertes (e.g., óxido de ítrio, colestano e óxido de crómio) são muito usados em estudos de utilização de nutrientes em juvenis e peixes adultos (Austreng et al., 2000; Carter et al., 2003), porém devido às limitações tecnológicas na fabricação de dietas inertes para larvas, normalmente tal metodologia não é aplicada em fases larvares. No último ano, com a melhoria de tecnologia de fabrico e determinação analítica, os marcadores inertes começaram a ser utilizados em estudos de metabolismo com larvas (Cook et al., 2008). Consequentemente, Johnson et al. (2009) após conseguirem incorporar na dieta inerte óxido de ítrio, determinaram que larvas de bacalhau do Atlântico (Gadus morhua) com 58 DAE têm um consumo de alimento de dieta inerte e Artemia de 0.57-0.79% e 0.67-0.84%, respectivamente. O método ainda possui algumas limitações, nomeadamente é muito dependente da espécie pois é necessário recolher as fezes das larvas.

Em conclusão, vários métodos podem ser utilizados para a determinação do alimento que as larvas preferem ingerir, porém nenhum dos aqui apresentados consegue ser ao mesmo tempo simples e fácil de aplicar por rotina.

Genómica populacional

Quando se pretende avaliar a performance de um indivíduo torna-se importante conhecer a sua ascendência, sendo particularmente relevante em condições de aquacultura identificar as famílias e os cruzamentos que produziram descendência com a presença de um determinado fenotípo.

Os marcadores moleculares permitem inferir paternidades e traçar as origens dos indivíduos. Os microssatélites têm sido os marcadores de selecção para este tipo de estudos devido aos elevados níveis de variabilidade que apresentam (Liu & Cordes, 2004). Cerca de 4 a 10 loci microssatélites podem ser suficientes para identificar com 95% de confiança o par de progenitores de mais de 90% dos indivíduos de uma amostra (Bekkevold et al., 2002; Brown et al., 2005; Blonk et al., 2009). Contudo, o número de loci a usar depende do tamanho da população reprodutora. É no entanto de salientar o facto de os microssatélites apresentarem por vezes elevadas frequências de erros de genotipagem, tais como alelos nulos e drop out (Castro et al., 2004, 2006), e que estes erros podem enviesar os resultados. Um programa de selecção de reprodutores pode ser estabelecido com base na escolha de um carácter específico, retendo apenas os indivíduos que apresentem o fenotípo seleccionado para constituir o grupo de reprodutores. No entanto, é aconselhável monitorizar a diversidade genética e os níveis de consanguinidade dos reprodutores seleccionados para evitar cruzamentos entre indivíduos aparentados, de forma a prevenir a erosão genética do stock e as consequências negativas de cruzamentos consanguíneos (Gallardo et al., 2004; Porta et al., 2006). Por isso, os marcadores moleculares podem ser utilizados num programa de rotina para monitorizar a diversidade genética, tal como foi implementado na dourada (Blanco et al., 2007), truta marisca (Salmo trutta; Was & Wenne 2002; Gross et al., 2007), salmão do Atlântico (Salmo salar; Norris et al., 2000), bacalhau do Atlântico (Pampoulie et al., 2006) e falso alabote japonês (Paralichthys olivaceus; Liu et al., 2005).

Normalmente, os programas de selecção de reprodutores escolhem caracteres que podem ser facilmente identificados individualmente (peso, tamanho, crescimento, etc.), melhorando os programas usando selecção massiva. Porém, os caracteres que são mais difíceis de identificar ou que se manifestem tardiamente, tais como a eficiência alimentar ou o índice de condição, podem ser considerados bons candidatos para efectuar uma selecção assistida por marcadores (MAS; Chistiakov et al., 2006). Como pré-requisito para implementar uma MAS deve existir uma associação entre o marcador genético e os genes que afectam o fenotípo (carácter) de interesse. Localizar essas associações corresponde à pesquisa de QTLs (Quantitative Trait Loci - Liu & Cordes, 2004). Vários QTLs já foram identificados em peixes, alguns relacionados com o peso (O'Malley et al., 2003; Reid et al., 2005) ou comprimento (Borrell et al., 2004). Tao & Boulding (2003) estudaram dez genes relacionados com o complexo da hormona de crescimento para encontrar relações com caracteres de crescimento no salvelino ártico (Salvelinus alpinus) e um SNP revelou associação com o crescimento.

Os marcadores moleculares são ferramentas de grande utilidade para serem implementadas em programas de reprodução, de forma a identificar e traçar a origem e ancestralidade de larvas de peixe. No entanto, encontrar caracteres de interesse, nomeadamente os relacionados com crescimento e nutrição de peixes, em larvas em particular, que permitam a construção de mapas de QTLs é uma área recente com muito ainda para explorar. A combinação de conhecimento da genómica e os recursos da genética populacional permitirá detectar variabilidade associada a caracteres de interesse, sendo possível num futuro próximo a implementação de MAS em muitas espécies em aquacultura. A aplicação destas metodologias em estádios iniciais de desenvolvimento, tais como larvas, poderá acelerar o processo de programas de selecção e aumentar o seu sucesso trazendo novos conhecimentos para a optimização da nutrição e crescimento em aquacultura.

Genómica funcional

A quantidade crescente de informação que tem surgido na sequência da clonagem de genes e através dos programas de sequenciação dos genomas de algumas espécies de teleósteos produzidas em aquacultura, permitiu aos investigadores e aquacultores terem uma melhor perspectiva sobre a forma como os factores nutricionais influenciam a expressão e regulação a nível genético. A partir da obtenção da sequência completa do genoma do peixe zebra (Danio rerio) foi possível desenvolver novas ferramentas moleculares para a investigação, tais como microarrays, que tornaram possível testar os efeitos de uma determinada condição experimental sobre a expressão genética de uma espécie ou estádio de desenvolvimento e, juntamente com estratégias quantitativas como o PCR em tempo real, permitem ter uma resposta integrada sobre as alterações que ocorrem num determinado grupo de genes seleccionados. Um microarray de 16000 sequências de ADN complementar de salmão do Atlântico desenvolvido pelo consórcio GRASP (von Schalburg et al., 2005) e um novo microarray recentemente desenvolvido para a dourada que contém 20000 oligonucleótideos, (Ferraresso et al., 2008) permitirão aos aquacultores pesquisar as alterações na expressão de genes, que ocorrem durante o desenvolvimento e alimentação larvar ou em indivíduos submetidos a experiências nutricionais. A clonagem molecular e a quantificação da actividade de enzimas digestivas de peixes, como a pepsina gástrica (Darias et al., 2005), as enzimas pancreáticas tripsina (Male et al., 2004) e amilase (Douglas et al., 2000; Darias et al., 2006) ou as enzimas intestinais leucina-alanina peptidase, aminopeptidase ou fosfatase alcalina (Cahu et al., 1999; Zouiten et al., 2008), tornaram possível compreender melhor os mecanismos e alterações moleculares que ocorrem a nível digestivo durante o desenvolvimento larvar. A técnica de PCR quantitativo em tempo real é actualmente o método mais exacto de quantificação dos níveis de expressão genética (Fernandes et al., 2008), permitindo obter resultados mais fiáveis e rápidos que as técnicas convencionais e elimina o uso de sondas radioactivas normalmente utilizadas em hibridação do tipo "Northern". Esta técnica tem ainda a vantagem de reduzir a quantidade de material biológico usado para análise, o que é particularmente útil quando se trabalha com amostras larvares. Pela combinação da quantificação de expressão por PCR em tempo real com hibridação in situ para a localização e identificação dos tipos celulares responsáveis pela expressão de genes, numa determinada altura ou condição experimental, torna-se possível ter uma resposta integrada sobre as fases de desenvolvimento e a forma como uma espécie pode metabolizar os componentes de uma formulação nutricional na sua dieta. Assim sendo, quando um nutriente é testado na dieta é possível estudar a expressão e a presença das enzimas responsáveis pela sua digestão, tornando-se então possível determinar qual a dieta mais adequada para cada fase de desenvolvimento. Uma alteração a nível da expressão das enzimas digestivas foi recentemente observada em larvas de taínha-liça (Chelon labrosus) quando a sua dieta muda de carnívora para herbívora (Zouiten et al., 2008), sugerindo que a actividade das enzimas digestivas está geneticamente programada para responder às alterações ontogénicas na dieta.

Proteómica funcional

O estudo da expressão do proteoma de um organismo, o resultado final da expressão dos seus genes, permite compreender os efeitos estruturais e funcionais causados por factores ambientais, incluindo a nutrição. A electroforese bidimensional, que combina a separação das proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico bem como pelo seu peso molecular (López, 2007), seguida da identificação das proteínas por espectrometria de massa (Cañas et al., 2006) é a metodologia mais frequentemente utilizada para estudos de proteómica funcional. A proteómica pode ser vista como uma técnica complementar à genómica funcional, uma vez que permite o estudo, sem hipóteses prévias, da expressão do conjunto de proteínas presentes num tecido, incluindo eventuais modificações pós-tradução (e.g., glicosilação, fosforilação).

A utilização da proteómica na investigação com peixes é recente, ainda que já existam alguns estudos na área da nutrição. Estes trabalhos permitiram já identificar múltiplas alterações metabólicas em resposta a factores nutricionais, tais como a variação no conteúdo energético ou a inclusão de fontes de proteína vegetal nas dietas de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss; Martin et al., 2003; Vilhelmsson et al., 2004; Kolditz et al., 2008). A aplicação de técnicas de proteómica em larvas de peixes é difícil, devido ao seu reduzido tamanho e da dificuldade associada em dissecar os diferentes tecidos. Desta forma, os poucos trabalhos existentes focam essencialmente na variação do proteoma durante a ontogenia (Focant et al., 2003; Link et al., 2006; Sveinsdóttir et al., 2008).

Há no entanto já resultados preliminares sobre efeitos de nutrientes, como a vitamina K (Richard et al., 2008) e hidrolisados proteicos (Richard et al., dados não publicados), no metabolismo de larvas de peixes marinhos. Avanços tecnológicos recentes, nomeadamente a técnica de DIGE que permite uma maior sensibilidade e menor tamanho de amostra (Marouga et al., 2005; Link et al., 2006), em conjunto com novas técnicas de microdissecção, prometem para um futuro próximo avanços significativos na compreensão dos efeitos nutricionais no metabolismo de larvas de peixes.

Programação nutricional

Estudos científicos recentes com animais terrestres e humanos reforçam a ideia que eventos pré-natais e neonatais (tais como a nutrição e a vacinação materna ou factores ambientais), se exercidos em estádios específicos do desenvolvimento, podem afectar de forma significativa o potencial de crescimento e a resistência a doenças dos indivíduos adultos (Lucas, 1998; Waterland & Garza, 1999; Metcalfe & Monaghan, 2001).

O conhecimento sobre o potencial da programação nutricional em peixes é escasso. No salmão do Atlântico, Macqueen et al. (2008) observaram que variações na temperatura da água durante a embriogénese condicionam o fenótipo miogénico (número de fibras musculares e diâmetro) em indivíduos adultos. Um estudo recente de Guerden et al. (2007) demonstrou que um estímulo hiper-glucídico exercido na primeira alimentação das larvas de truta arco-íris permitiu um aumento da actividade de algumas enzimas associadas à digestão dos glúcidos em peixes juvenis, sugerindo uma alteração fisiológica persistente. Do mesmo modo, observou-se que larvas de robalo-legítimo (Dicentrarchus labrax), quando alimentadas com dietas deficientes em HUFA, demonstraram um aumento da expressão da Ä6-desaturase no estádio juvenil (Vagner et al., 2007). O carácter definitivo e os mecanismos que controlam tais alterações são actualmente desconhecidos.

Após a desova e até ao início da alimentação exógena, o saco vitelino é a única fonte de nutrientes disponíveis para o desenvolvimento embrionário dos peixes. Esta situação deve-se ao fato de as membranas estruturais dos ovos e embriões de peixes apresentarem uma elevada impermeabilidade. A informação disponível sobre a composição bioquímica das reservas do saco vitelino e sobre os padrões de depleção dos diversos substratos nutricionais durante o desenvolvimento embrionário é abundante (Kamler, 2008). No entanto, caso o início da alimentação exógena não se processe da forma mais adequada, as larvas de peixes marinhos podem estar sujeitas à privação de alguns nutrientes essenciais. Uma eventual deficiência nutricional é particularmente importante nestas fases precoces do desenvolvimento, que se caracterizam por elevadas taxas de crescimento e de síntese protéica. Pode-se especular se esta ocorrência afecta de forma permanente o potencial de crescimento e a modulação de vias metabólicas nos peixes.

A validação do conceito da programação nutricional em peixes pode permitir avanços importantes na área da nutrição de larvas de peixes. Ao beneficiar das novas abordagens da nutrigenómica, a investigação futura deve contribuir para melhor compreensão e identificação dos estímulos nutricionais que permitam programar os processos biológicos e metabólicos que ocorrem durante as fases precoces do desenvolvimento dos peixes (e.g., retenção proteica, miogénese de fibras musculares, metabolismo ósseo). As aplicações práticas podem ser vastas. Por exemplo, a identificação de um estímulo nutricional que melhore a utilização metabólica de glúcidos por parte dos peixes, pode abrir novas perspectivas na utilização de ingredientes de origem vegetal nos alimentos para a aquacultura. Em termos gerais, a programação nutricional ao nível dos reprodutores e/ou larvas, conjuntamente com práticas adequadas de alimentação e de cultivo podem ser ferramentas importantes na optimização de uma produção em larga escala de juvenis de elevada qualidade.

Conclusões

O conhecimento das bases biológicas e nutricionais para o desenvolvimento de melhores dietas e regimes alimentares para larvas de peixes melhorou muito nos últimos anos, através do uso de técnicas utilizando marcadores isotópicos e de genómica funcional. No entanto, a compreensão da fisiologia da nutrição, bem como dos requisitos nutricionais, das larvas de peixes é ainda muito limitada. Espera-se que num futuro próximo as metodologias aqui discutidas tenham um papel fulcral para a construção de uma base sólida de conhecimentos que permita optimizar as dietas e regimes alimentares para larvas de peixes de diferentes espécies.

Literatura Citada

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Abreviaturas: AA - aminoácido(s); ADN - ácido desoxirribonucleico; DAPA - dias após primeira alimentação; DAE - dias após a eclosão; DIGE - difference gel electrophoresis; HUFA - ácidos gordos altamente insaturados; MAS - selecção assistida por marcadores; PCR - reacção de polimerização em cadeia; QTL(s) - quantitative trait loci; SNP - single nucleotide polymorphism.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Out 2009
• Data do Fascículo
  Jul 2009