Adição de insulina ao meio crioprotetor seminal de garanhões Mangalarga Marchador

Adding insulin to frozen seminal extender from Mangalarga Marchador stallions

MELHORAMENTO, GENÉTICA E REPRODUÇÃO

Adição de insulina ao meio crioprotetor seminal de garanhões Mangalarga Marchador¹

Adding insulin to frozen seminal extender from Mangalarga Marchador stallions

Bruno Fagundes^I; Maurício Fraga van Tilburg^I; José Frederico Straggiotti Silva^I; Aldo Shimoya^II; Marcus Antonio Pessanha Barreto^I; Vinicius Motta Ferreira^I

^IUniversidade Estadual do Norte Fluminense - Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal

^IIUniversidade Salgado de Oliveira - UNIVERSO Campos, RJ

RESUMO

Objetivou-se verificar o efeito da adição de insulina (0,1; 1 ou 10 UI/mL) ao diluente de congelamento convencional por meio de análise computadorizada das características de motilidade espermática (CASA), funcionalidade da membrana plasmática, por meio de choque hiposmótico, e integridade de membrana acrossomal, avaliada pelo teste FITC/PSA. Não houve efeito significativo da adição de 0,1 e 1 UI/mL de insulina na análise imediata após o descongelamento sobre os parâmetros de motilidade e cinemática espermática, porém o nível de 10 UI/mL de insulina promoveu redução desses parâmetros.

Palavras-chave: congelamento, equino, espermatozoide, membrana plasmática

ABSTRACT

Success rates in equine sperm cryopreservation are lower than in other domestic species. The objective of this study was to verify the effect of adding 0.1 IU/mL, 1 IU/mL and 10 IU/mL insulin to conventional frozen extender using computerized analysis of sperm motility (CASA), plasma membrane functionality by hypo-osmotic shock and acrossomal membrane integrity through the FITC/PSA assay. No difference was observed in treatment with 0.1 and 1 IU/mL after thawing in the analysis of motility and kinematic sperm parameters. However, when 10 IU/mL insulin was used there was a reduction in these parameters.

Key words: equine, freezing, plasmatic membrane, sperm

Introdução

Existe uma grande diferença na congelabilidade do sêmen entre garanhões e até mesmo entre ejaculados de um mesmo garanhão (Pickett & Amann, 1993). Essa diferença também ocorre entre raças e a grande maioria dos garanhões Mangalarga Marchador é classificada como maus congeladores quando se utiliza apenas o glicerol como crioprotetor (Gomes et al., 2002). Alvarenga et al. (1996) observaram que a congelabilidade do sêmen de garanhões Mangalarga Marchador foi pior que a do sêmen de garanhões de salto e da raça Quarto de Milha.

A insulina é um hormônio anabólico que promove a captação de glicose e aminoácidos, a síntese de proteínas e lipídeos e o aumento das funções intracelulares e da membrana plasmática (Abdelmonein et al., 1998). Esse hormônio polipeptídico é essencial para o metabolismo normal e a regulação do crescimento mediante ligação com seu respectivo receptor transmembrana ou com receptores de IGF (fator de crescimento semelhante à insulina) na superfície da célula-alvo (Dupont et al., 2001). Hicks et al. (1972) observaram que a concentração de insulina no plasma seminal humano é quase três vezes maior que no sangue, o que sugere alguma função seminal. Kremer (1965), citado por Hicks et al. (1972), observou que, quando se utilizam glicose ou piruvato como substrato, a adição de insulina aumenta significativamente a motilidade de espermatozoides humanos, o que não ocorreu quando se utilizou frutose. Aitken (1994) relatou que hormônios, citosinas e fatores de crescimento presentes no plasma seminal afetam a motilidade espermática e a fertilização. Aquila et al. (2005) mostraram que espermatozoides humanos podem expressar e secretar insulina, o que sugere uma regulação autócrina do metabolismo da glicose, a qual é provida ao espermatozoide pelo plasma seminal e pelo fluido do trato reprodutivo da fêmea (Koch, 1980, citado por Aquila et al., 2005). Macpherson et al. (2002) observaram que a motilidade espermática total e a taxa de prenhez são maiores em garanhões com altas concentrações de IGF-I no plasma seminal. Van Tilburg et al. (2008) constataram melhora na integridade de acrossoma e na motilidade após o teste de termorresistência com a adição de insulina ao diluente de congelamento seminal ovino.

Este trabalho foi conduzido com a finalidade de verificar o efeito da insulina sobre a motilidade, a cinemática, a integridade de acrossoma e a funcionalidade de membranas espermáticas adicionadas ao meio crioprotetor seminal de garanhões da raça Mangalarga Marchador.

Material e Métodos

Foram utilizados cinco garanhões da raça Mangalarga Marchador provenientes do haras Lugavi em Campos dos Goytacazes - RJ. Inicialmente foram realizadas cinco coletas de sêmen de cada garanhão com intervalo de 2 dias, a fim de eliminar células espermáticas armazenadas por longo período. Em seguida, foram coletados três ejaculados de cada animal para realização deste trabalho.

O sêmen foi obtido utilizando-se uma vagina artificial modelo Hannover com a temperatura de 42 °C e uma égua em cio natural como manequim. A porção gelatinosa proveniente das vesículas seminais foi removida ao ficar retida no filtro de coleta.

A concentração espermática foi determinada com auxílio de uma câmara de Newbauer utilizando-se uma amostra do sêmen diluída na proporção de 1:200 de solução formol citrato preparada com 2,94 g de citrato de sódio em 100 mL de água destilada, removendo-se 4 mL desta solução e adicionando 4 mL de formaldeído (Merck^®).

O sêmen foi diluído em meio de resfriamento contendo 10 g de leite desnatado Molico^® (Nestle^®) e 0,4 g de AGROVET^® (Novartis^®) diluídos em 100 mL de água destilada q.s.p. na proporção de uma parte de sêmen para duas de diluente e em seguida foi centrifugado a 600 g, durante 10 minutos, à temperatura ambiente. Cerca de 10 a 20% do diluente de resfriamento com o plasma seminal foi preservado para ressuspensão com o diluente de congelamento proposto por Vidament et al. (2002) com modificações, contendo 50 mL de lactose 11%; 25 mL de glicose-EDTA (12 g de glicose; 0,240 g de carbonato de sódio; 0,740 g de EDTA; 0,750 g de Citrato de sódio dihidratado; 0,8 g de AGROVET^® (Novartis^®); 200 mL de água destilada q.s.p); 20 mL de gema de ovo; 3 mL de glicerol; 2 mL de dimetilformamida; 0,5 mL de Equex^® - Farmacia, Orvus et paste. Todos os demais reagentes descritos acima foram obtidos pela empresa VETEC.

Avaliou-se a adição de insulina ao diluente de congelamento (Iolin^® mista bovina e suína altamente purificada com concentração de 100 UI/mL) da seguinte maneira: controle, 0,1 UI/mL, 1 UI/mL e 10 UI/mL. Os parâmetros de motilidade e cinemática espermática foram avaliados utilizando-se o programa Ceros, versão 10.8, da Hamilton Thorn Research (HTM-CEROS), de funcionalidade de membrana plasmática pelo teste hiposmótico (Dell'aqua Jr. et al., 2001) e de integridade de membrana acrossomal pelo teste FITC-PSA.

A ressuspensão do sedimento de espermatozoides foi feita acrescentando-se o diluente de congelamento de acordo com os tratamentos, de forma a se obter uma concentração de 100 x 10⁶ células/mL. O envase do sêmen foi feito em palhetas de 0,5 mL, que foram mantidas em repouso por 20 minutos a 4 °C e em seguida, colocadas a 4 cm acima do nível do nitrogênio líquido durante 10 minutos e imersas neste criogênio para armazenamento.

A integridade funcional da membrana espermática foi avaliada por choque hiposmótico utilizando-se a técnica desenvolvida por Dell'Aqua Jr. et al. (2001) modificada. Em um tubo foram adicionados 190 mL de água bidestilada a 38 °C e 10 μL do sêmen descongelado. A amostra foi incubada por 5 minutos em banho-maria a 38 °C e em seguida foi colocada uma gota sobre a lâmina recobrindo-a com uma lamínula para análise em microscópio de contraste de fase com aumento de 400X. Foram contadas 200 células espermáticas, considerando funcionais aquelas com cauda enrolada e não-funcionais aquelas que permaneceram com a cauda esticada.

A integridade do acrossoma foi avaliada utilizando-se a fluoresceína isotiocianato conjugada com a Lectina Pisum sativum aglutinina (FITC-PSA), a qual se liga à glicoconjugados da membrana acrossomal externa ou à matriz acrossomal (Bedford et al., 2000) em associação ao iodeto de propídeo.

Após a análise da funcionalidade da membrana, motilidade e cinemática espermática, o sêmen descongelado foi centrifugado a 200 g por 2 minutos para remoção do diluente de congelamento e adição de PBS. Em seguida, foram preparados esfregaços das amostras, que foram secos à temperatura ambiente e mergulhados em metanol resfriado a -10 ºC no congelador por 30 segundos e novamente secos a temperatura ambiente. Foram colocados sobre cada lâmina 60 μL de FITC-PSA sob proteção de luminosidade. Em seguida, as lâminas foram cobertas com um pedaço de transparência para retroprojeção e incubadas por 20 minutos. Cada lâmina foi adicionada de iodeto de propídio (60 μL) e novamente coberta com um pedaço de transparência para retroprojeção e incubada por 10 minutos. As lâminas foram lavadas com PBS e cobertas com lamínula para observação em microscópio com ultra-violeta (UV) com aumento de 100X. Foram contadas 200 células por lâmina, classificadas como acrossoma íntegro (verde uniforme), parcialmente reagido (balloon ou danificado) e reagido (vermelho). O comprimento de onda utilizado na observação foi de 540 nm e todos os reagentes utilizados foram obtidos pela Sigma-Aldrich.

Os parâmetros de motilidade e cinemática espermática foram determinados por avaliação computadorizada utilizando-se o programa Ceros, versão 10.8, da Hamilton Thorne Research (HTM-CEROS, 1999). Uma câmara de contagem de 20 μL (Hamilton Thorne Research) pré-aquecida pela placa de platina aquecedora (± 37 ºC) foi utilizada para observação da amostra seminal por microscópio ótico com aumento de 100 vezes acoplado ao computador. A intensidade da fonte de luz foi ajustada para que as imagens dos espermatozoides fossem capturadas e digitalizadas para análise pelo programa.

Foram escolhidos quatro campos que apresentavam melhor motilidade aparente na amostra para análise e a média desses valores foi anotada e salva pelo programa para análise estatística.

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e os tratamentos comparados pelo teste F. As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade e as análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa computacional Genes (Cruz, 2006) para determinação do efeito dos níveis de insulina dos garanhões e das coletas de sêmen.

Resultados e Discussão

A adição de insulina (0,1 e 1 UI/mL) ao diluente de congelamento não promoveu diferença significativa nas análises de motilidade espermática, mas a adição de 10 UI/mL diminuiu a motilidade total e motilidade progressiva (Tabela 1).

A principal fonte de energia para o espermatozoide realizar diferentes funções relacionadas à motilidade, capacitação, penetração da zona pelúcida e fusão de membranas entre espermatozoide e ovócito é pela glicose (Travis et al., 2001). Entretanto, esse açúcar não penetra imediatamente nas membranas celulares, com exceção de poucos tecidos, como cérebro, fígado, leucócitos e hemácias, e a presença de insulina é essencial para movimentação da glicose pela membrana plasmática, induzindo o aumento do número de proteínas transportadoras específicas (Cunningham, 1997).

A adição da insulina ao meio de congelamento não melhorou a motilidade espermática na análise imediatamente após o descongelamento. Provavelmente isso ocorreu pelo curto tempo para penetração da glicose nas membranas espermáticas. Van Tilburg et al. (2008) verificaram que a adição de insulina melhorou os parâmetros de linearidade e retidão na análise após três horas do descongelamento, porém o efeito na análise imediata após o descongelamento também não melhorou os valores de motilidade. Uma provável razão para o efeito negativo da adição de 10 UI/mL de insulina sobre a motilidade total e progressiva é que o volume utilizado corresponde a pouco menos que 10% do volume do diluente utilizado, desse modo, pode não ter ocorrido interação adequada entre os crioprotetores desse meio com as células espermáticas.

A adição de 0,1; 1 e 10 UI/mL de insulina ao diluente de congelamento não teve efeito sobre a velocidade da cinemática espermática, mas a adição de 10 UI/mL de insulina diminuiu a amplitude lateral de cabeça em relação aos grupos controle e 0,1 UI/mL de insulina e aumentou a frequência de batimento flagelar em comparação à ausência de insulina (Tabela 2).

Correlações positivas altamente significativas entre motilidade progressiva e os parâmetros de velocidade indicam que o espermatozoide com trajeto linear progressivo e reto percorre uma distância maior em menor espaço de tempo. A velocidade média do percurso (VAP) e a velocidade linear (VSL) também têm forte correlação positiva com a fertilidade e podem ser utilizadas para estimar a fertilidade de amostras seminais (Kathiravan et al., 2008).

Com o aumento da concentração de insulina, houve queda na amplitude lateral da cabeça do espermatozoide, aumentando a frequência de batimento flagelar. Desse modo, os espermatozoides tiveram melhor aproveitamento energético durante seu trajeto. Mortimer (1997) reportou que o aumento na viscosidade do diluente diminui a amplitude da onda flagelar. Geralmente, amplitude lateral de cabeça elevada não é desejável porque afeta a progressão celular, desse modo, valores mais elevados de ALH denotam menor qualidade da amostra seminal (Arruda et al., 2003).

Rathi et al. (2001) postularam que a amplitude lateral da cabeça e a velocidade curvilínea aumentam em espermatozoides equinos hiperativados em meio contendo agentes capacitantes, como bicarbonato e Ca²⁺ ionóforo. Esses autores concluíram que espermatozoides equinos hiperativados apresentam VCL > 180μm/s e ALH > 12μm, o que não ocorreu neste experimento.

A adição de 0,1; 1 e 10 UI/mL de insulina ao diluente de congelamento também não teve efeito sobre as análises de funcionalidade de membrana plasmática e integridade de membrana acrossomal (Tabela 3).

O processo de resfriamento altera a fluidez da bicamada fosfolipídica, fazendo com que os fosfolipídeos semelhantes agrupem-se e excluam proteínas da membrana, diminuindo sua mobilidade e, assim, a funcionalidade da membrana (Jasko, 1994). A adição de insulina não melhorou essa perda na funcionalidade de membrana nem a integridade acrossomal, provavelmente em decorrência de sua ação no metabolismo espermático, mas não evidenciado efeito crioprotetor desse hormônio.

A capacitação é caracterizada por um padrão de movimento pela maioria dos espermatozoides no ato da fertilização e esses espermatozoides hiperativos tendem a movimentar-se vigorosamente em círculos (Ho & Suarez, 2001). Aquila et al. (2005) sugeriram um possível envolvimento da insulina na indução da capacitação de espermatozoides humanos. Entretanto, neste experimento os valores de velocidade curvilínea foram inferiores a 180 μm/s e a amplitude lateral de cabeça foi menor que 12,0 μm para todas as concentrações de insulina utilizadas, valores compatíveis com espermatozoides não-capacitados (Rathi et al., 2001). Além disso, a integridade acrossomal também não foi afetada pela adição de insulina (Tabela 3).

A concentração de glicose no meio é o principal fator de liberação de insulina. A glicose aumenta a quantidade de ATP pela cadeia respiratória nas células β das ilhotas pancreáticas e os níveis de ATP controlam o fechamento dos canais de K⁺ e a despolarização da membrana plasmática. A despolarização faz com que os canais de Ca²⁺ se abram e esse íon flua para dentro da célula provocando a liberação de insulina já sintetizada (Jeffrey & Alan, 2000). Esse mecanismo é semelhante nos eventos que antecedem a fertilização, que envolvem a capacitação e a reação acrossômica, apesar de cerca de 90% da produção de ATP no espermatozoide maduro ser obtida por glicólise (Mukay & Okuno, 2004). O Ca²⁺ extracelular é requerido tanto na capacitação espermática quanto na indução da reação acrossômica (Kaul et al., 1997) e o início da reação acrossômica depende de um aumento intracelular massivo dos níveis de Ca²⁺ na célula espermática (Bailey & Bayard, 1994).

Colenbrander et al. (2000) mostraram que a glicose no diluente favorece a reação acrossômica em espermatozoides de cão e de hamster. Aquila et al. (2005) demonstraram que a estimulação da secreção de insulina pela célula espermática é dose-dependente de glicose, assim como as células β do pâncreas. É possível que, na ausência de insulina no plasma seminal ou no diluente, o espermatozoide seja estimulado a liberar sua reserva de insulina para manter seu metabolismo. Esse processo acarreta a entrada de Ca²⁺ e ativa os mecanismos da reação acrossomal. Com a adição de insulina nos meios crioprotetores, os espermatozoides não necessitariam liberar suas reservas de insulina para captar a glicose do meio e não acarretariam a entrada de Ca²⁺ nos mesmos nem a ativação dos mecanismos da reação acrossomal.

A capacitação tem sido correlacionada a alterações no metabolismo celular, na concentração intracelular de íons, na fluidez da membrana plasmática, no pH intracelular e na concentração intracelular de AMPc (Visconti et al., 1998). Entretanto, ainda não se sabe ao certo os mecanismos de ação da insulina no espermatozoide.

Mesmo não atuando diretamente na crioproteção, o fato de não ter influenciado na capacitação, a redução na amplitude lateral de cabeça e o aumento da frequência de batimento flagelar sugerem que a adição de insulina pode ser utilizada para atuação no metabolismo espermático e na manutenção da qualidade da amostra seminal de garanhões da raça Mangalarga Marchador. Entretanto, existe a necessidade de maiores estudos para determinar em qual mecanismo metabólico a insulina atua no espermatozoide e qual sua correlação com a fertilidade.

Conclusões

A adição de 0,1 UI/mL e 1 UI/mL de insulina ao meio de congelamento de sêmen equino não teve efeito citotóxico às células espermáticas após o descongelamento.

Recebido em 16/7/2008 e aprovado em 4/3/2009.

Correspondências devem ser enviadas para: [e-mail]

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1

Projeto financiado pela Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), Campos dos Goytacazes, RJ.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Mar 2010
• Data do Fascículo
  Fev 2010

Histórico

• Aceito
  04 Mar 2009
• Recebido
  16 Jul 2008