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Revista Brasileira de Psiquiatria

Print version ISSN 1516-4446

Rev. Bras. Psiquiatr. vol.34  supl.2 São Paulo Oct. 2012

http://dx.doi.org/10.1016/j.rbp.2012.08.004 

ARTIGO

 

Abordagens diferentes, um único objetivo: compreender os mecanismos celulares das doenças de Parkinson e de Alzheimer

 

 

Andréa S. TorrãoI; Cecilia C. Café-MendesI; Caroline C. RealI; Marina S. HernandesI; Ana F. B. FerreiraI; Taisa O. SantosI; Gabriela P. Chaves-KirstenI; Caio H. Y. MazucantiII; Emer S. FerroIII; Cristoforo ScavoneII; Luiz R. G. BrittoI

IDepartamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo (USP), Brasil
IIDepartamento de Farmacologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo (USP), Brasil
IIIDepartamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo (USP), Brasil

Correspondência para

 

 


RESUMO

Os transtornos neurodegenerativos são, sem dúvida, um problema crescente nas ciências da saúde, dado o aumento da expectativa de vida e de estilos de vida pouco saudáveis. Embora os mecanismos de tais doenças ainda estejam longe de ser esclarecidos, vários estudos que derivam tanto da ciência básica quanto de abordagens clínicas contribuíram nessa direção. Na presente revisão, são discutidas linhas de frente da pesquisa básica sobre as doenças de Parkinson e Alzheimer, em que grupos de pesquisas de três departamentos do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo estão envolvidos em um esforço multidisciplinar. O foco principal desta revisão envolve os modelos animais desenvolvidos para se estudar os aspectos celulares e moleculares daquelas doenças neurodegenerativas, incluindo o estresse oxidativo, a sinalização da insulina e as análises proteômicas, dentre outros. Antecipamos que esta revisão irá auxiliar o grupo a determinar as futuras direções da pesquisa conjunta nessa área e, o mais importante, estabelecer o nível de cooperação que planejamos desenvolver juntamente com colegas do Núcleo de Apoio à Pesquisa em Neurociência Aplicada que estão envolvidos com pesquisa clínica na mesma área.

Descritores: Neurodegeneração; Neuroproteção; Estresse oxidativo; Estreptozotocina; NADPHoxidase.


 

 

Introdução

Esta revisão aborda as duas doenças neurodegenerativas mais comuns, as doenças de Parkinson e Alzheimer, com destaque para alguns aspectos relacionados às hipóteses etiológicas e terapêuticas sob uma perspectiva da pesquisa básica. Sob esse aspecto, discutimos principalmente um modelo animal bem estabelecido da doença de Parkinson. Também mencionamos um modelo animal recém-proposto para a doença de Alzheimer, que também tem sido objeto de pesquisas em nossos laboratórios.

 

A doença de Parkinson

A doença de Parkinson (DP), descrita pela primeira vez em 1817 por James Parkinson em "An assay on the shaking palsy",1 é a segunda doença degenerativa mais comum e afeta cerca de 1-2% da população acima de 60 anos e até seis milhões de pessoas no mundo todo.2 A doença é clinicamente caracterizada por disfunções motoras, tais como tremor em repouso, bradicinesia, rigidez e instabilidade postural, devido ao decréscimo de estímulos dopaminérgicos no estriado, como resultado da degeneração neuronal da substância nigra pars compacta (SNc), em uma taxa de cerca de 5% ao ano. Além disso, há distúrbios cognitivos e vegetativos.3 A redução de dopamina nos núcleos da base induz uma redução da ativação talâmica, o que resulta em uma inibição excessiva das respostas motoras.4 O déficit motor se manifesta após 40-60% da perda neuronal dopaminérgica e dos níveis de dopamina no estriado.5

Além da degeneração neuronal da SNc, há também uma perda neuronal progressiva em algumas outras regiões do cérebro, tais como o tronco encefálico, o lócus cerúleo, o núcleo reticular do tronco encefálico e o núcleo motor dorsal do vago, bem como no núcleo basal de Meynert, na amídala e na região CA2 do hipocampo. Outra característica da doença é a presença de inclusões conhecidas como corpos de Lewy ou neuritos de Lewy, dependendo de sua localização (citoplasma vs. processos neuronais), que são basicamente compostos de α-sinucleína. Essas inclusões proteicas são causadas por uma falha no sistema de degradação da célula e são compostas por agregados normais de proteína, proteínas truncadas e por proteínas com alterações conformacionais, além da ubiquitina.2,6 A alfa-sinucleína pertence à família de proteínas compostas por α, ß e γ-sinucleínas - amplamente expressas no cérebro -, com funções fisiológicas incertas, mas aparentemente tendo uma função na neurotransmissão, tal como a regulação do tamanho das vesículas sinápticas e dos processos de reciclagem e plasticidade.7

Os déficits cognitivos foram deixados de lado durante alguns anos; no entanto, afetam quase 60% dos pacientes com DP8 e isso pode se devido aos corpos de Lewy.9 Além disso, aproximadamente 40% dos pacientes com DP exibem sintomas de ansiedade e depressão10, bem como déficit de memória decorrente das alterações no circuito fronto-estriado-talâmico após a diminuição de dopamina11 e a morte de neurônios noradrenérgicos no lócus cerúleo. 12,13

A 6-hidroxidopamina como modelo animal da doença de Parkinson

Como a neurodegeneração nigroestriatal foi reconhecida como uma característica patológica típica da DP, pesquisas sobre a patogênese da doença têm se apoiado no desenvolvimento de modelos animais que reproduzam a perda de neurônios dopaminérgicos na SNc. O primeiro modelo animal da DP foi gerado em 1968, quando Ungerstedt demonstrou que, com a injeção da 6-hidroxidopamina (6-OHDA) no estriado ou na SNc, era possível depletar o conteúdo da dopamina nos terminais nervosos e nos corpos celulares, respectivamente.14 Desde então, para se estudar a DP, foram desenvolvidos vários outros modelos animais que empregam compostos diferentes capazes de gerar lesões dopaminérgicas seletivas acompanhadas de sintomas parkinsonianos, tais como o contaminante da heroína 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), pesticidas (rotenona, paraquat e maneb), lipopolissacarídeo e manganês.15 No entanto, o modelo da 6-OHDA é ainda o mais usado para gerar lesões nigroestriatais.16

A 6-OHDA é um análogo hidrolizado da dopamina encontrado no cérebro de pacientes portadores da DP.17 Como a neurotoxina não cruza a barreira hematoencefálica, ela é diretamente injetada no sistema nervoso central, especificamente no estriado, na SNc ou até no feixe prosencefálico medial. Como resultado de sua captação pelos transportadores noradrenérgicos e da dopamina, a 6-OHDA destroi de forma seletiva os sistemas catecolaminérgicos e promove uma perda de neurônios dopaminérgicos, parecida com a da DP, que se inicia imediatamente após a injeção, tornando-se estável após duas semanas.18,19 A injeção da 6-OHDA na porção central-lateral do estriado é o modelo animal que mais se assemelha à doença humana20,21, já que gera uma lenta evolução dos sintomas e parece ser mais apropriado para estudos que foquem estratégias terapêuticas.16

Os efeitos da 6-OHDA estão principalmente relacionados ao grande estresse oxidativo causado pela toxina que, uma vez acumulada no citosol, parece ser auto-oxidada e promove uma alta taxa de geração de radicais livres21 e a interrupção da cadeia respiratória mitocondrial (complexos I e IV).1,21 A oxidação da 6-OHDA gera diretamente o peróxido de hidrogênio e o superóxido, ambos fundamentais para a propagação da oxidação, e as paraquinonas, que parecem tornar inativas enzimas cruciais, como a catecol-O-metiltransferase e a tirosina hidroxilase.22 Além disso, a oxidação da 6-OHDA está associada à produção do radical hidroxil, um poderoso agente oxidante que pode reagir a uma taxa elevada com moléculas orgânicas e inorgânicas.23

Associados à análise molecular e neuroquímica, os testes de comportamento geralmente são empregados para avaliar a extensão do local da lesão por 6-OHDA naquele modelo animal. Um teste clássico aplicado aos ratos com lesão unilateral da via nigroestriatal é o comportamento rotacional induzido pela apomorfina agonista da dopamina, que induz rotação do lado oposto ao lesado.16

NADPH oxidase e doença de Parkinson

As NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato-oxidase) oxidases (Nox) constituem uma família de enzimas de múltiplas subunidades que transferem elétrons pelas membranas biológicas e produzem superóxido pela redução de um único elétron do oxigênio molecular. Todas as sete isoformas da Nox descritas até agora (Nox1-5 e Duoxes 1-2) contêm ao menos seis domínios transmembranas e os do mínios citosólicos FAD (flavina adenina dinucleotídeo) e de ligação NADPH. Cada membro da família Nox apresenta componentes citosólicos, mecanismos de ativação, localizações subcelulares e distribuição de tecido específicos.24 A Nox2 foi a primeira isoforma a ser descoberta e ainda representa a isoforma mais estudada de Nox, sendo essencial para a defesa natural do hospedeiro. É composta de subunidades localizadas na membrana celular (p22phox e gp91phox - formando o citocromo b558, uma flavoproteína heterodimérica) e no citoplasma (p40phox, p47phox e p67phox). A ativação da proteína G de baixo peso molecular (Rac1 ou Rac2) e a fosforilação de p47phox iniciam a migração de elementos citoplasmáticos para a membrana plasmática, onde se associam ao citocromo b558 e geram a enzima funcional. O elétron do NADPH citoplasmático se desloca primeiro para a FAD, depois para os grupos heme Nox e, finalmente, pela membrana e é transferido para o oxigênio.25 De forma similar à Nox2, a Nox1 interage com p22phox, p47phox e p67phox ou seus homólogos, NoxO1 e NoxA1, respectivamente. A ativação da Nox3 é menos definida, mas parece envolver a Rac, a p47phox e a NoxA1. A Nox4 é constitutivamente ativa e requer apenas p22phox. A Nox5 e as duoxes são reguladas pelo cálcio por meio dos domínios EF-hand no citosol.26 Dentre as isoformas da Nox descritas no tecido nervoso estão Nox1, Nox2, Nox 3 e Nox4.27,28 No entanto, a Nox2 parece exercer um papel predominante nas doenças neurodegenerativas.

Sob condições fisiológicas, as espécies reativas do oxigênio (ERO) derivadas da Nox são moléculas de sinalização que influenciam muitos processos fisiológicos. No entanto, diversos estudos que usaram modelos animais e cérebros de humanos post-mortem verificaram o aumento da ativação das proteínas Nox em uma grande variedade de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer e a DP, mas os mecanismos envolvidos ainda são pouco compreendidos. Revisamos aqui os estudos mais recentes quanto à ativação da Nox no modelo da PD induzida por 6-OHDA. A maioria dos dados foi obtida por meio de observações in vitro e indica um grande envolvimento da Nox2 na neurotoxicidade dopaminérgica. Por exemplo, foi demonstrado em culturas primárias mesencefálicas que a 6-OHDA induziu um aumento significativo da imunomarcação da gp91phox e p47phox, o que indica maior ativação da Nox2. A ativação microglial e a geração de O2 nos neurônios dopaminérgicos também foram significativamente reduzidas pela apocinina, um inibidor da Nox.29 Usando o mesmo modelo in vitro, os mesmos autores também mostraram um aumento significativo dos níveis do mRNA da gp91phox e da p47phox, 12 horas após o tratamento celular com a 6-OHDA.30 Em outro estudo, foi mostrado que a 6-OHDA também induziu um aumento da expressão da gp91phox nas células dopaminérgicas do neuroblastoma humano.31 Esses resultados estão em consonância com as nossas observações in vivo. De fato, os níveis de proteína da membrana da p67phox foram bastante elevados na SNpc de camundongos com lesão por 6-OHDA, o que sugere a ativação da Nox2. A imunomarcação da tirosina hidroxilase indicou que os animais nocautes para gp91phox-/-parecem estar protegidos da perda de células dopaminérgicas na SNc e da perda dos terminais dopaminérgicos no estriado. Além disso, camundongos do tipo selvagem tratados com apocinina e camundongos nocautes para gp91phox-/- exibiram um comportamento rotacional induzido pela apomorfina significativamente melhor após a lesão por 6-OHDA. Dessa forma, apesar das EROs derivadas da auto-oxidação e da contribuição dos mecanismos de inibição mitocondrial para a neurodegeneração dopaminérgica no modelo da DP induzida pela 6-OHDA, de modo geral os dados acima indicam que as ERO derivadas da NOx estão também bastante envolvidas no modelo da DP.

A doença de Parkinson e os efeitos neuroprotetores do exercício

Exercício e estimulação comportamental podem acionar processos de plasticidade no sistema nervoso. Dados com animais mostraram que o exercício pode aumentar a sobrevivência neuronal e a resistência a lesões cerebrais, promover a angiogênese e a neurogênese, melhorar a aprendizagem e contribuir para a função cognitiva no processo de envelhecimento.32 Assim, muitos concordam que uma possível neuroproteção pode ser alcançada por meio de exercícios físicos.

Já foi mostrado que exercícios físicos estão inversamente relacionados a doenças neurodegenerativas, porque contribuem para o processo funcional que envolve a recuperação, manutenção e prevenção contra danos cerebrais em animais e humanos.33,34 Estudos com modelos animais da DP com o emprego de paradigmas distintos de exercício têm tentado explicar os mecanismos moleculares das mudanças induzidas por exercício na fisiopatologia da DP, uma vez que a extensão da lesão e o tipo de exercício (voluntário ou forçado) podem afetar o grau de neuroproteção e de melhoria comportamental.33,34 Esses estudos demonstraram angiogênese,35 aumento de respostas anti-inflamatórias e diminuição de agentes inflamatórios e melhoria das funções mitocondriais,38 na neurogênese no estriado39 e na SNc.40

As respostas da plasticidade melhoram os déficits neuroquímicos, especialmente os níveis da tirosina hidroxilase, e ambos os sintomas cognitivo e motor.37-39,41,42 Por exemplo, o exercício na esteira durante 30 minutos, por 14 dias consecutivos, para ratos submetidos ao modelo da 6-OHDA da DP, é capaz de melhorar a expressão da tirosina hidroxilase no estriado e na SNc e o desempenho motor no teste de rotação com apomorfina.41 Por outro lado, exercícios voluntários feitos nas rodas giratórias que se iniciaram duas e meia semanas antes da infusão intracerebral da 6-OHDA em ratos, e que continuaram até quatro semanas após a infusão da neurotoxina, melhoraram o desempenho do animal nos testes comportamentais relacionados à assimetria dos membros anteriores sem mudanças no transportador da dopamina e da tirosina hidroxilase.42

Além dos dados derivados dos modelos animais, estudos clínicos mostraram uma melhoria do controle motor e do equilíbrio dependentes de exercício, o que resulta na diminuição da frequência de quedas dos pacientes e na melhoria da qualidade de vida e do modo de andar.33,34,43

É possível que os efeitos de neuroproteção que o exercício induz no modelo da 6-OHDA em ratos, descritos acima, sejam promovidos por neurotrofinas, tais como o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e o fator neurotrófico derivado da glia (GDNF).38,39 De fato, Nguyen e col.44 mostraram que o BDNF tem efeitos de neuroproteção contra um estímulo neurotóxico in vitro que ativa as vias de apoptose. Os dados in vivo obtidos por meio do protocolo de exercícios feitos na esteira durante quatro semanas antes da injeção do lipopolissacarídeo (LPS) em ratos mostraram que o exercício preveniu por completo a perda de neurônios dopaminérgicos induzida pelo LPS, a redução dos níveis de dopamina e a disfunção motora, bem como recuperou a sinalização do BDNF reduzida pelo LPS.37 Ademais, o bloqueio do receptor do BDNF aboliu a proteção induzida pelo exercício contra a perda neuronal da dopamina induzida pelo LPS. Ainda, o BDNF é capaz de ativar indiretamente as enzimas oxidantes e, então, diminuir os danos oxidativos induzidos pela 6-OHDA.1,45

A doença de Parkinson e o sistema canabinoide

O sistema canabinoide consiste de compostos endógenos lipofílicos, tais como o N-araquidonoil etanolamina (anandamida) e o 2- araquidonoil glicerol (2-AG), suas enzimas sintéticas e de degradação e os receptores CB1 e CB2. Acredita-se que a maioria dos principais efeitos canabinoides é mediada pelos receptores CB1, que apresentam localização pré-sináptica predominante, o que sugere a sinalização retrógrada nos terminais axônicos por meio da modulação da liberação do neurotransmissor. Mais recentemente, também foi mostrado que os canabinoides podem se ligar a outros receptores, tais como o receptor de potencial transitório do tipo valinoide 1 (TRPV1)46 e o receptor ativado por proliferadores de peroxissoma (PPAR) da família dos receptores nucleares.47

O receptor CB1 é um dos receptores metabotrópicos mais abundantes no sistema nervoso central48 que são, em especial, encontrados em grandes quantidades nos núcleos da base,49 localizados nos terminais dos neurônios que empregam o GABA e dos neurônios glutamatérgicos. Altas densidades do CB1 são observadas no estriado, nos globos pálidos interno e externo e na substância nigra pars reticulata (SNpr).50 Além disso, os endocanabinoides, a anandamida e o 2-AG estão bastante concentrados no estriado.49

Na última década, se deu muita atenção ao envolvimento do sistema canabinoide em várias patologias, já que se verificou que os elementos constitutivos desse sistema são alterados em numerosas patologias, tanto no sistema nervoso central quanto na periferia.51 No sistema nervoso, o sistema canabinoide também estava envolvido nos processos de morte/sobrevivência.52 Nesse contexto, alguns grupos concentraram os esforços para compreender a relação entre a DP e o sistema canabinoide, o que levou a perspectivas para as terapias canabinoides.

Um estudo recente com seres humanos mostrou um decréscimo acentuado do CB1 na SN de pacientes com DP, concomitante ao ligeiro aumento nas áreas de projeção dopaminérgica.53 Estudos com modelos da 6-OHDA da DP também reforçam a ideia de variação na expressão do CB1, bem como na concentração de canabinoides endógenos nos núcleos da base. Por exemplo, os níveis da expressão do mRNA do receptor CB1 aumentaram no estriado de ratos 7-10 semanas após a injeção unilateral de 6-OHDA, embora nenhuma mudança significativa tenha sido encontrada na ligação do receptor CB1.54 Por outro lado, um estudo mais recente mostrou um decréscimo do receptor CB1 na SNpr apenas quando a 6-OHDA era injetada no estriado, e não no feixe prosencefálico medial.55 Em contraste, Casteels et al.56 não observaram quaisquer mudanças na expressão do CB1 na SN após a injeção da 6-OHDA. Os resultados heterogêneos podem depender do local da injeção da 6-OHDA ou, mais importante, dos períodos analisados após a lesão.57

Foram observados níveis mais altos de anandamina em ratos injetados com 6-OHDA, acompanhados por uma redução da enzima que metaboliza endocanabinoides (principalmente anandamida), a amida hidrolase de ácido graxo (FAAH) e o transportador da anandamida.58 Além disso, um estudo com a linhagem celular PC12 exposta à 6-OHDA e tratada com anandamida descreveu um efeito de neuroproteção independente de CB1.59 Foi sugerido, por exemplo, que a melhoria do tônus endocanabinoide produz um efeito antidiscinesia induzida por levodopa no modelo da 6-OHDA.60

Canabinoides exógenos também demonstraram um potencial efeito de neuroproteção e, mais recentemente, foi dada atenção especial às propriedades antioxidantes descritas para alguns compostos canabinodes. Por exemplo, o Δ(9)-tetrahidrocanabinol (THC), o principal constituinte psicoativo da Cannabis, promove a redução da morte de neurônios dopaminérgicos e reverte o decréscimo na transmissão dopaminérgica nos núcleos da base de ratos lesionados pela 6-OHDA.61 O mesmo estudo observou um efeito de neuroproteção do canabidiol, atribuído às propriedades antioxidantes. Outro estudo sustenta a ideia de que apenas os canabinoides com propriedades antioxidantes, tais como AM 404, diferente daqueles com afinidade aos receptores canabinoides, reduzem a toxicidade causada pela 6-OHDA.62 Não se pode excluir, no entanto, a participação dos receptores CB2 nos efeitos de proteção observados no modelo da 6-OHDA com uma indução/regulação positiva desses receptores, principalmente na micróglia reativa, o que pode contribuir para propriedades de neuroproteção do sistema canabinoide nos distúrbios dos núcleos da base.61

Sendo assim, independentemente dos resultados heterogêneos, e algumas vezes conflitantes, descritos acima, parece que o sistema canabinoide exerce uma função nos mecanismos compensatórios que neutralizam o desequilíbrio na fisiologia dos núcleos da base que ocorrem na DP.50

A doença de Parkinson, proteômica e peptidômica

Apesar dos mecanismos já identificados envolvidos na DP, tais como estresse oxidativo, disfunção mitocondrial, agregados anormais da proteína, falhas no sistema ubiquitina proteassoma, proliferação glial, respostas inflamatórias e assim por diante, o diagnóstico da doença ainda depende do aparecimento dos sintomas. Nesse contexto, os marcadores biológicos são de grande interesse para o diagnóstico precoce e a prevenção - um campo que tem sido explorado com o uso da abordagem proteômica.2,63

Em um estudo proteômico da DP no liquido cefalorraquidiano, observou-se que a Apo A-I, reguladora do metabolismo lipídico e possivelmente da agregação proteica nos corpos de Lewy, estava regulada negativamente em pacientes com PD em comparação aos grupos controle.64 Outro estudo que usa o modelo de drosófila da DP com a expressão da α-sinucleína A53T destacou a importância da α-sinucleína no transporte da membrana e na biogênese da membrana sináptica. Além disso, a Hsc3p (heat shock protein cognate 3) que regula o enovelamento e a degradação de proteínas, também aumentou, o que indica maiores concentrações de proteínas mal enoveladas e, consequentemente, leva ao estresse do retículo endoplasmático.65 Em um estudo proteômico no modelo da DP em ratos injetados com 6-OHDA, mostrou-se que mais de 70 proteínas estavam alteradas no estriado e na SN. Algumas dessas proteínas alteradas incluem a 14-3-3 beta/alfa (Ywhab; regulada positivamente) e outras reguladas negativamente, tais como a calretinina (Calb2), a NADH desidrogenase 1 alfa (NDUFA10), a isoenzima ubiquitina carbóxi-terminal hidrolase L3 (UCHL3) e a proibitina.66 A proibitina está conectada às subunidades do complexo mitocondrial I, em particular à subunidade NDUFS3 (NADHubiquinona oxidoreductase 30kDa), que está envolvida com mecanismos de senescência e atua protegendo subunidades do complexo I antes da sua formação. Ensaios de coimunoprecipitação demonstraram interação entre a proibitina e a NDFUS3 e estudos imuno-histoquímicos demonstraram que elas estão elevadas em neurônios dopaminérgicos em fase de morte celular. Além disso, a ausência da proibitina nas células SH-SY5Y induziu morte celular pela 6-OHDA. Todos esses dados sugerem seu potencial papel na regulação da função mitocondrial em células dopaminérgicas.66

Outra abordagem que usa o modelo da 6-OHDA revelou cinco proteínas alteradas: Aβ-cristalina, gama-enolase, guanidoacetato metiltransferase, vinculina e subunidade α-2 do proteassoma. Essas proteínas estão relacionadas ao aumento das discinesias induzidas por L-DOPA, um efeito colateral provocado pelo uso crônico de L-DOPA no tratamento da DP.67

A eletroforese bidimensional, em combinação com o estudo MALDI-TOF MS com o uso do método em ratos hemiparkinsonianos induzido por 6-OHDA, revelou proteínas reguladas positivamente: APLP2 (amyloid precursor-like protein 2), cininogênio, glucocinase (GK), TMBR (tropomyosin alpha chain, type brain-1) e cadeia leve da calpactina I. A APLP2 apresentou um aumento de 5,35 vezes duas semanas pós-lesão. Essa proteína desapareceu da SNc após a lesão induzida pela 6-OHDA e aumentou nos neurônios estriados positivos para APLP2, o que pode indicar sua presença nos neurônios pré e pós-sinápticos do sistema nigroestriatal.68 Essa descoberta sugere o papel dessa proteína na sinaptogênese e/ou reorganização das sinapses no estriado. Os autores também discutem que o aumento da APLP2 pode ser o resultado de um número maior de células que expressam a proteína (neurogênese) ou de uma diferenciação desses neurônios na resposta ao dano.68

Os peptídeos exercem um papel importante nos transtornos neurológicos e são considerados bons biomarcadores. No modelo 6-OHDA da DP com ratos, a discinesia induzida pela L-DOPA foi relacionada aos níveis de Dyn B (dinorfina B) e aNeo (alfa-neoendorfina) na SN. A análise por MALDI-imaging revelou que o metabólito da dinorfina Tyr-Gly-Gly-Phen-Leu-Arg estava alto e as intensidades dos picos de Dyn B estavam baixas na SN, onde há alta especificidade de ligação para os receptores delta opioides.69

O PACAP (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide) age como um neurotransmissor e um neuromodelador e está presente na amígdala, no tálamo e na medula espinhal. O PACAP revelou ter efeitos de neuroproteção no modelo de ratos induzidos pela 6-OHDA e diminuiu a perda neuronal dopaminérgica em 50%, bem como preveniu a hipocinesia por causa da neurotoxicidade da 6-OHDA.70 Outro peptídeo importante é o VIP (vasoactive intestinal peptide), que apresenta potentes efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e antiapoptóticos. Efeitos benéficos também já foram demonstrados na função motora, provavelmente por causa de níveis maiores de GABA no tálamo. O VIP reduz a peroxidação lipídica, a fragmentação do DNA e a produção de NO.71

Dessa forma, o papel dos peptídeos nos transtornos neurológicos como a doença de Parkinson se tornou um campo de pesquisa proeminente que poderia ser cuidadosamente investigado na procura de marcadores biológicos.

 

Doença de Alzheimer

A doença de Alzheimer (DA) é a causa principal da demência em idosos e está associada ao dano progressivo nas funções cerebrais, que incluem a memória, a linguagem, a orientação espacial, o comportamento e a personalidade. Estima-se que haja atualmente 36 milhões de portadores de DA no mundo todo e prevê-se que esse número aumente drasticamente nas próximas décadas.72 A DA é uma patologia multifatorial e cerca de 99% dos casos apresentam uma ocorrência esporádica (DAE), em oposição à forma menos comum da doença hereditária,73 com a idade avançada sendo o principal fator de risco. Outros fatores de risco importantes são os parâmetros vasculares e metabólicos que compreendem a chamada "síndrome metabólica", tais como a dislipidemia e a hipertensão, bem como a hiperglicemia. Além disso, o o diabetes melittus tipo II está associado a maior risco de DA e de demência vascular.74

Clinicamente, a DA se caracteriza pela perda progressiva de memória e pelo declínio da função cognitiva e culmina na morte prematura do indivíduo, em média 10 anos após o diagnóstico.72 Ademais, a DA vem acompanhada de sintomas neuropsiquiátricos não cognitivos, que incluem ansiedade, agressão, delírio, excitação ou apatia, desinibição ou depressão.75 Indícios neuropatológicos característicos da DA incluem perda neuronal, acúmulos de emaranhados neurofibrilares (NFT) correspondentes aos depósitos intracelulares da proteína Tau hiperfosforilada e das fibras distróficas e a expressão aumentada e o processamento anormal da proteína precursora de beta-amiloide (APP), o que leva ao depósito do peptídeo beta-amiloide (Aβ) e, portanto, à formação das placas senis.73 Outro indício de DA é a angiopatia amiloide cerebral. De fato, a disfunção cerebrovascular pode preceder o declínio cognitivo e o início da DA. A hipoperfusão cerebral e a eliminação alterada do Aβ através da barreira hematoencefálica podem contribuir para o início e a progressão da demência característica da DA. Há também evidências da importância do papel da micróglia nesses processos patológicos.76

Embora a DA seja multifatorial, sua etiologia ainda é desconhecida. Apesar de muitos estudos sugerirem que o peptídeo Aβ ("hipótese da cascata amiloide") pode iniciar a patogênese da DA ou contribuir para ela, os mecanismos pelos quais ele provoca perda neuronal e as anormalidades da Tau ainda são pouco esclarecidos. Dessa forma, nos últimos anos, várias outras novas hipóteses surgiram a fim de contribuir para o conhecimento de processos neurodegenerativos da DA. Abaixo, descrevemos brevemente dados recentes relativos à DA, com o foco nos papéis da sinalização da insulina e dos transtornos do metabolismo da glicose como possíveis fatores na etiologia da DA.

Deficiência mitocondrial, sinalização de Ca2+ e a doença de Alzheimer

Apesar de mais de 20 anos terem sido dedicados à "hipótese da cascata amiloide", muitas outras hipóteses permanecem como possíveis causas do início e da progressão da DA, como o estresse oxidativo, a proteína Tau, o príon e as causas ambientais.77 Alguns autores acreditam que a DA se inicia por uma deficiência de enzimas do ciclo ácido tricarboxílico, atividade reduzida da citocromo oxidase e dano do DNA mitocondrial. A produção das espécies reativas de oxigênio, por exemplo, parece estar envolvida no surgimento e na manutenção do ciclo de degeneração da DA, o que agrava o dano do DNA mitocondrial e altera outros complexos da cadeia de transporte do elétron, que leva à maior produção das espécies reativas.78

Os déficits de aprendizagem e memória no início da DA também podem ser o resultado de alterações da sinalização de Ca2+. Os oligômeros do peptídeo Aβ aumentam a entrada de Ca2+ e mais Ca2+ é lançado no retículo endoplasmático. O aumento de Ca2+ no retículo, sensibiliza os receptores de rianodina (RyR), que, por sua vez, lançam mais Ca2+ dos estoques internos. Há evidências de que as mutações que ocorrem na DA podem induzir as mudanças da sinalização de Ca2+. Outra observação é que as espinhas e os dendritos dos neurônios piramidais neocorticais que estão próximos aos depósitos de Aβ apresentaram níveis mais altos de Ca2+ em repouso. No entanto, ainda permanece a dúvida sobre o que ocorre primeiro: a ativação da via amiloidogênica ou as mudanças na sinalização do Ca2+.79

Sinalização da insulina, deficiência do metabolismo da glicose e doença de Alzheimer

Estudos funcionais mostraram distúrbios tanto na mobilização da glicose quanto no metabolismo energético, seja precedendo ou acompanhando os estágios iniciais dos danos cognitivos na DAE.80-81

Evidências moleculares levantaram hipóteses de que o tráfego da proteína precursora do amiloide (APP) está sob controle da sinalização da insulina e do receptor da insulina tirosina quinase82,83 e que a insulina regula a fosforilação da proteína Tau via a atividade de glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3).84,85 Além disso, a insulina afeta as funções cerebrais, tais como a cognição e a memória, conforme mostrado em estudos in vivo.85 Consequentemente, o dano do metabolismo da glicose e da sinalização da insulina tem sido considerado como uma possível etiologia da DAE.86 A insulina afeta várias funções cerebrais, que incluem a cognição, a memória e a plasticidade sináptica por meio das vias de sinalização do receptor de insulina (RI). A insulina se liga à subunidade extracelular de seu receptor, o que resulta na autofosforilação e na ativação da subunidade-β intracelular. O receptor ativado da insulina fosforila alguns substratos intracelulares, que incluem o substrato do receptor da insulina. A forforilação de substratos intracelulares, então, leva ao recrutamento e à ativação de múltiplas proteínas e à iniciação de algumas cascatas de sinalização; dentre as mais abundantes estão a fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K) e as vias de sinalização da proteína quinase ativada pelo mitógeno (MAPK).86-88 A ativação da via de PI3K, por sua vez, medeia a ativação da Akt quinase de serina-teorina (também conhecida como proteína quinase-B, PKB) e promove a sobrevivência neuronal ao inativar diretamente a maquinaria pró-apoptótica.89 Ademais, a PI3K/Akt ativada fosforila e, portanto, inibe ambas as formas citosólicas de glicogênio sintase quinase 3 (GSK3),90 que é conhecida por regular a formação do peptídeo Aβ. Dessa forma, a insulina regula a secreção de APP solúvel por meio da via dependente de PI3K.91

Alguns estudos confirmaram que o metabolismo cerebral diminui antes da deterioração das funções cognitivas, o que sugere que a falha de energia seja uma das indicações reversíveis mais precoces da DAE.92 Foram encontradas na DAE93,94 anormalidades predominantes no metabolismo da glicose no cérebro e seu controle pelo sistema de transdução do sinal da insulina nos neurônios, o que leva à hipótese de que a DAE é a diabetes mellitus do tipo II no cérebro.92 Propôs-se que a falta de combinação entre a ação da insulina e a função do receptor da insulina, que inclui vias de sinalização a jusante, estaria envolvida na disfunção do sistema cerebral da insulina na DAE.95

Injeção intraventricular cerebral da estreptozotocina como um modelo para Doença de Alzheimer esporádica

Considerando a presença da insulina e de seus receptores no cérebro, foi desenvolvido um modelo experimental com ratos com o uso da estreptozotocina (STZ) para induzir a disfunção do sistema de insulina no cérebro.93 A STZ (glicosamina derivada da nitrosourea) é uma droga seletivamente tóxica para células de secreção/produção de insulina e é usada para induzir tanto a diabetes mellitus (DM) dependente da insulina quanto a não dependente, após a administração intravenosa ou intraperitoneal em ratos.96 Pequenas doses da injeção intracerebroventricular da estreptozocina (icvSTZ) não alteram, no entanto, os níveis de glicose no plasma e não induzem DM, mas alteram o metabolismo da glicose no cérebro.97 Considerando a importância dos papéis da insulina e dos receptores da insulina no cérebro, e o fato de que a deficiência de insulina e a resistência estão relacionadas tanto à DAE quanto à DM, muitos autores consideram icvSTZ como um modelo para a DAE.74,94,97,98

Na periferia, a toxicidade da STZ se inicia quando essa droga é absorvida pelas células B pancreáticas via o transportador de glicose GLUT2 e induz a morte da célula pela alquilação do DNA e a ativação da poli-ADP ribosilação.99 Como a STZ é doadora de óxido nítrico (NO), a participação de NO no efeito citotóxico da STZ também foi observada, bem como a geração de espécies reativas de oxigênio, que também contribuem para a fragmentação do DNA e evocam outras mudanças deletérias. A ação da STZ na mitocôndria resulta na formação de ânions superóxido, na inibição do ciclo do ácido tricarboxílico e no decréscimo substancial do consumo de oxigênio pela mitocôndria, limitando fortemente a produção de ATP mitocondrial.96 O mecanismo de ação da STZ no sistema nervoso, no entanto, ainda não está totalmente elucidado.

Os achados moleculares e comportamentais que se seguem a alteração do metabolismo da glicose e da sinalização da insulina parecem mimetizar a DAE, pelo menos em alguns aspectos. Aqui apresentamos um breve resumo dos resultados obtidos até agora por autores que estudam ratos injetados com icvSTZ. Os resultados indicam alterações semelhantes às observadas em pacientes portadores de DA. Em geral, a administração icv da STZ é associada a mudanças comportamentais, moleculares e morfológicas em animais.

Conforme mencionado anteriormente, as principais indicações da DA são a formação de placas senis por causa do acúmulo de Aβ e a formação de NFT por causa da hiperfosforilação de Tau.73 Em muitas regiões do cérebro de ratos injetados com STZ, há um aumento da fosforilação de Tau,83,87,88,100 dos emaranhados neurofibrilares80 e da expressão do peptídeo Aβ,80,86,100 embora esses estudos não relatem a formação de placas senis.

Corroborando as indicações patológicas mencionadas antes, dados comportamentais têm sido bastante consistentes ao mostrar déficits cognitivos e aprendizagem e memória de curto e longo prazo comprometidas após a administração icv de STZ. Por exemplo, os déficits de memória foram observados no labirinto aquático de Morris apenas três horas após a injeção e persistiram por até 30 dias.100 Também se mostrou que a injeção da STZ leva a comprometimentos cognitivos nas tarefas de memória, o que inclui a esquiva passiva e o labirinto em cruz elevado,101-103 que parecem ser independentes de quantas injeções ou de quantas doses de STZ foram administradas.86 Há, no entanto, alguns estudos que demonstram que doses menores resultam em um déficit cognitivo menor.104

Embora o sistema colinérgico seja descrito como um dos primeiros a serem afetados na DA,73 uma semana após uma única injeção icv de STZ nenhuma mudança foi observada quanto ao número ou à morfologia dos neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal, dos núcleos septais mediais, da banda diagonal, do núcleo basal magnocelular ou do hipocampo.105 Além disso, a colina acetiltransferase (ChAT) não variou em algumas áreas do cérebro mesmo um mês após a injeção.100 No entanto, houve um aumento da atividade da acetilcolinesterase (AChE) 86,105 e uma redução da atividade ChAT,106,107 o que pode explicar a função sináptica e a habilidade de aprendizagem reduzidas e os déficits de memória observados nesses animais.102 Outros sistemas de neurotransmissores também parecem ser modificados no modelo icv de STZ. Por exemplo, há um down-regulation do receptor da dopamina D1 e uma up-regulation da subunidade α-1 do receptor GABA-A.108

Os marcadores para a apoptose são aumentados no modelo icv da STZ e percebe-se uma atrofia de oligodendrócitos, provavelmente devida à diminuição da densidade celular observada na região periventricular e à inflamação resultante.86 Além disso, muitos autores descreveram uma maior expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP), principalmente nas regiões peri e paraventricular, no septo, fórnix, estriado e hipocampo.100,105 Também há um alargamento do terceiro ventrículo após a injeção da STZ, condizente com a hipótese da perda neuronal.109

Considerando as proteínas relativas ao metabolismo da glicose e a via de sinalização da insulina, foi observado no modelo icv de STZ um decréscimo da expressão de substrato do receptor de insulina 1 e 2, AKT/PKB, do transportador da glicose do tipo (GLUT1), GLUT3 e GSK-3β, que também é notado em pacientes portadores de DAE.86,87 Além disso, após a administração da STZ, ocorreram anomalias graves no metabolismo da glicose/energético,110 como a redução do uso da glicose em 17 áreas do cérebro. Finalmente, as atividades das principais enzimas glicolíticas diminuíram muito após a injeção icv da STZ.111

Dessa forma, o metabolismo energético e o comprometimento da sinalização da insulina, a redução da atividade da ChAT e o aumento da atividade da AChE podem fazer parte da base biológica para a redução acentuada da capacidade de aprendizagem e memória, bem como para o aumento dos indícios da DA no modelo icv de STZ.102 São necessários, no entanto, mais estudos para se compreenderem por completo os efeitos da STZ no sistema nervoso central. Os eventos que disparam a neurodegeneração da DA ainda precisam ser elucidados por completo, de modo a gerar um modelo adequado para essa devastadora doença multifatorial.

O modelo da estreptozotocina intraventricular cerebral e as abordagens terapêuticas

O estresse oxidativo contribui de maneira importante para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, conforme demonstrado anteriormente nesta revisão (por favor, consulte a seção NADPH oxidase e a doença de Parkinson). Mecanismos semelhantes também parecem fazer parte da etologia da DA.112 Alguns desses danos oxidativos incluem a peroxidação lipídica e a degradação proteica, o que leva a alterações na atividade enzimática e causa o rompimento da membrana celular e, por fim, a morte da célula.

Um dos tratamentos em desenvolvimento para a DA é o uso da curcumina. A curcuma (Curcuma Longa L.) apresenta 3-5% de curcuminoides, incluindo 50-60% de curcumina, e também óleos e resina (cerca de 5%). A curcumina é composta de dois monômeros do ácido ferúlico e apresenta propriedades depuradoras de radicais livres.113 Em contraste com os níveis elevados de radicais livres induzidos pela injeção icv de STZ em ratos, a curcumina foi capaz de conter esse processo e também a atividade da Na+/K+-ATPase no hipocampo e no córtex cerebral. O tratamento induziu a atividade das enzimas antioxidantes, como a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa redutase (GR), e também aumentou os níveis da glutationa reduzida (GSH) e da glutationa oxidada (GSSG) em ambas as estruturas do cérebro. Além disso, o tratamento também agiu contra os níveis reduzidos de acetilcolina induzida pela injeção de STZ, o que também contribuiu para melhorar a memória e os déficits de aprendizagem.101

Outros estudos avaliaram as influências do tratamento com curcumina no metabolismo do glicogênio e da glicose, que estão notavelmente reduzidos no modelo da STZ no córtex cerebral e no hipocampo, o que inclui níveis menores dos RI. A injeção intraperitoneal da curcumina em ratos melhorou o desempenho da tarefa de esquiva passiva e o teste do labirinto aquático de Morris e aumentou os níveis da IGF-1 nessas estruturas cerebrais. A IGF-1 tem sido relacionada à fosforilação da tau e o seu dano leva à hiperfosforilação da tau e, consequentemente, à disfunção mitocondrial e à morte celular.114 Corroborando esses dados, o tratamento oral com curcumina recuperou os níveis de RI em ambas as estruturas, bem como o desempenho da memória comportamental e nos testes de aprendizagem.115 Outros estudos com as células SHSY5Y demonstraram o papel da curcumina na ativação da via de sinalização da Wnt/β-catenina por meio da inibição de GSK-3β, que é responsável pela fosforilação da β-catenina e também exerce a função de substrato da β-catenina.

Ademais, a curcumina induz a expressão da β-catenina e da ciclina D1. Todas essas sinalizações cruzadas da via interferem na quantidade da PS1 (presenilina 1) livre e, consequentemente, na atividade da γ-secretase que envolve a clivagem de APP.116 Outro extrato de planta, a Centella asiatica (Umbelliferae), também apresentou efeitos similares à curcumina.117

As vias de sinalização da Wnt e da MAP quinase também estão envolvidas em outras abordagens que usam protocolos de exercício, que são benéficos para a doença de Parkinson, conforme demonstrado anteriormente nesta revisão (por favor, consulte a seção A doença de Parkinson e os efeitos neuroprotetores do exercício). Foram empregados estudos semelhantes no modelo da STZ na DAE. A corrida na esteira (durante cinco semanas) conteve de forma significativa o declínio cognitivo observado na tarefa do labirinto aquático. Provavelmente, esse efeito é devido a alterações nas vias de sinalização semelhantes à insulina e também nas vias da MAP quinases e Wnt.118 As MAP quinases exercem um papel importante na sinalização neurotrófica e na plasticidade sináptica119 e Wnt também está envolvida na plasticidade, memória, neurogênese e LTP.120

Um estudo recente usou um flavonoide denominado rutina, que mostrou efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes, como a supressão da ativação micróglial.121 O mesmo estudo demonstrou a atenuação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), que indica o dano lipídico e também outros efeitos benéficos que envolvem as enzimas GPx, GR e catalase induzidas pelo estresse oxidativo. Os efeitos anti-inflamatórios foram demonstrados pela diminuição da translocação nuclear da produção de NF-κB, de IL-8 e dos neurônios imunorreativos GFAP e COX-2.121 No mesmo campo de pesquisa, as estatinas são usadas para avaliar os efeitos de intervenções anti-inflamatórias e antioxidativas na DA. Foi usado um modelo conjugado celecoxib/STZ para testar a pitavastatina (3-hidróxi-3-metil glutaril coenzima A [HMG-CoA]), o inibidor da redutase e o donepezil (um inibidor da colinesterase) e esses tratamentos apresentaram resultados bem-sucedidos na neuroproteção.122

A doença de Alzheimer, proteômica e peptidômica

Os peptídeos também se mostraram importantes na doença de Alzheimer. Recentemente, a somatostatina foi associada ao início da doença, uma vez que a formação das placas de β-amiloide danifica a transmissão do neuropeptídeo. As placas de β-amiloide são alvos-chave para a enzima degradante da insulina (EDI), são reguladas pela presença da somatostatina e funcionam como um substrato e um modulador alostérico para a enzima.123 Outro peptídeo é a substância P (SP), que apresenta um efeito na via proteolítica da proteína precursora do amiloide (APP) por causa do aumento da atividade de α-secretase e da menor disponibilidade de APP para β-secretases.124

Além disso, as peptidases também são importantes para a geração do β-amiloide. Evidências crescentes demonstram a importância da neprilisina na liberação do β-amiloide por causa da diminuição do nível dessa enzima com o avanço da idade.125 Ademais, há níveis elevados de peptidases, tais como a endopeptidase EP 24.15126 e a prolil oligopeptidase (POP), no hipocampo de ratos tratados com Aβ.127 Também se mostrou que os níveis da EP 24.15 são maiores no tecido cerebral na DA em comparação aos controles e provavelmente agem também na liberação desse peptídeo.128

Há um campo de pesquisa a ser explorado - denominado peptidômica - que envolve a identificação das alterações intracelulares de peptídeos, que não usa enzimas digestivas e analisa a forma nativa dos peptídeos e suas modificações pós-translacionais.129,130 Algumas delas são fragmentos de hemoglobina (seis da cadeia-α e três da cadeia β)131 chamados de hemorfinas (LVV hemorfina-7, VV hemorfina-7, LVV hemorfina-6 e VV hemorfina-6). Elas estão significativamente elevadas no lobo temporal na doença de Alzheimer, mas não nos lobos frontal, occipital ou hipocampo.132 Essas hemorfinas apresentam ações em receptores opioides.133,134

Há também outros fragmentos da hemoglobina com funções intracelulares. São chamados de hemopressinas (cadeia α1 da hemoglobina) (PVNFKFLSH; HP) e apresentam um efeito hipotensivo.126 Outros estudos demonstraram propriedades antinoceptivas sobre a dor inflamatória135 e suas atividades sobre os receptores canabinoides CB1 como um antagonista seletivo.136 A hemopressina parece fazer parte da agora denominada via secretória não clássica de peptídeos caracterizada pela síntese "sob demanda" e pela ausência de armazenamento vesicular.137 Esses dados revelam novos aspectos do sistema endocanabinoide, que apresenta papéis importantes nos transtornos neurodegenerativos, tais como a doença de Alzheimer.138

Uma possível origem para esses peptídeos intracelulares parece ser o proteassoma. Estudos recentes conduzidos pelo nosso grupo com o uso da espectrometria de massa demonstraram que a inibição por epoximicina nas células HEK293T alterou significativamente a composição peptídica intracelular.139 Resultados preliminares também demonstraram mudanças no perfil de peptídeos intracelulares, bem como na expressão do mRNA de algumas peptidases, tais como a EP24.15 e a aminopeptidase B (dados não publicados).

De modo geral, os dados indicam que esses peptídeos podem funcionar em alguns mecanismos celulares, o que inclui a modulação das interações proteína-proteína.140,141 A geração e a degradação naturais desses peptídeos intracelulares podem ser importantes para os mecanismos envolvendo transtornos neurológicos.

 

Conclusão

Os dados apresentados acima ilustram alguns dos recentes resultados de várias abordagens básicas voltadas para o entendimento dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos nas doenças de Parkinson e Alzheimer. Os modelos animais discutidos aqui são bastante úteis para esse propósito, além de outros modelos disponíveis, que incluem os ratos transgênicos. Algumas das abordagens discutidas aqui revelaram a relevância do estresse oxidativo, dos endocanabinoides, exercícios físicos/fatores neurotróficos e peptídeos como fontes de possíveis estratégias de neuroproteção, que ainda serão testadas em humanos. Espera-se que o ambiente multidisciplinar proporcionado pelo Núcleo de Apoio à Pesquisa em Neurociência Aplicada estimule a expansão dessas ideias nos próximos anos.

 

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Correspondência para:
Luiz R. G. Britto
Departamento de Fisiologia e Biofísica. Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo
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