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Brazilian Journal of Poultry Science

versão impressa ISSN 1516-635Xversão On-line ISSN 1806-9061

Rev. Bras. Cienc. Avic. v.2 n.1 Campinas jan./abr. 2000

https://doi.org/10.1590/S1516-635X2000000100012 

Comparação de Meios de Enriquecimento e de Plaqueamento Utilizados na Pesquisa de Salmonella em Carcaças de Frango e Fezes de Aves

Comparison of Different Enrichment Broth and Plating Media Used to Isolating Salmonella from Chicken Carcasses and Poultry Faeces Samples

 

 


Autor(es) / Author(s)

Nascimento MS1
Berchieri Jr A
Barbosa MD1 
Zancan FT3
Almeida WAF4

1 - Discente do curso de Medicina Veterinária / FCAV - UNESP

2 - Profº da FCAV - UNESP

3 - Médico Veterinário autônomo

4 - Discente do Programa de Pós-Graduação em Med. Vet. / FCAV - UNESP

 

Correspondência / Mail Address

Angelo Berchieri Junior

Via de Acesso Paulo Donato Castellane, s/n
14870.000 - Jaboticabal - SP - Brasil

E-mail: berchier@fcav.unesp.br

 

Unitermos / Keywords

Salmonella, enriquecimento, plaqueamento, isolamento, carcaça de aves, fezes

Salmonella, enrichment broth, plating media, isolating, broiler carcasses, chicken feces

RESUMO

Este trabalho foi desenvolvido para avaliar, comparativamente, os caldos de enriquecimento Rapapport-novobiocina (RVN), selenito-cistinanovobiocina (SCN) e tetrationato-novobiocina (TN) e os meios para plaqueamento ágar Hektoen (HE), ágar MacConkey (MC), ágar Salmonella-Shigella (SS), ágar verde brilhante (VB) e ágar xilose lisina desoxicolato (XLD), utilizados no isolamento de Salmonella em carcaças de frango e fezes de aves. O procedimento bacteriológico consistiu das etapas de pré-enriquecimento, enriquecimento em caldos seletivos, plaqueamento, testes bioquímicos presuntivos e confirmação sorológica com soros polivalentes anti antígenos somáticos e flagelares de Salmonella.. As fezes foram experimentalmente contaminadas com 8 sorotipos de Salmonella (Agona, Anatum, Enteritidis, Havana, Infantis, Owakam, Schwazengrund e Typhimurium) e a concentração final foi aproximadamente de 1,2 x 102 ufc/g. As fezes foram inoculadas nos caldos enriquecedores e a partir daí, seguiu-se o mesmo procedimento utilizado para as carcaças. Os resultados referentes às carcaças de frango não foram estatisticamente diferentes (p>0,01) para os caldos e as placas. Todavia, verificou-se superioridade numérica em relação aos caldos SCN e TN sobre o caldo RVN, e em relação ao ágar XLD sobre os demais. Verificou-se também que com o emprego de dois caldos de enriquecimento e de dois meios para plaqueamento pode-se obter maior positividade. Quanto ao exame das fezes, o caldo TN mostrou-se superior aos demais (p>0,01), não havendo diferença (p>0,01) de resultados para os meios de plaqueamento. Os resultados sugerem que a utilização de mais de um meio de enriquecimento e de plaqueamento poderia aumentar as chances de isolamento de Salmonella.

 

ABSTRACT

This study was undertaken to compare selenite-cystine-novobiocin (SCN) broth, tetrationate-novobiocin (TN) broth and Rappaport-Vassiliadisnovobiocin (RVN) broth as enrichment and MacConkey (MC) agar, brilliant green (BG) agar, Hektoen (HE) agar, Salmonella-Shigella (SS) agar and xylose Iysine desoxycholate (XLD) agar as plating media for isolating Salmonella from broiler carcasses and chicken feces. The carcasses were washed with 300mL of Buffer Peptone Water 0.1% (BPW). The BPW solation was incubated 6h at ambient temperature and up to 24 h/43ºC. From this, 2 mL were inoculate in 20 mL of enrichment broth, incubated at 43ºC/24h. The enrichment broth was plated on the five tested selective agars, also incubated at 43ºC/24h. Up to five colonies from each plate were inoculated in TSI agar and LIA agar, incubated at 37ºC/24h. The genus of Salmonella was confirmed by slide agglutination test using poly serum anti-somatic Salmonella antigens (O) and poly serum anti-fiagellar (H) Salmonella antigens. The feces were experimentally contaminated with eight Salmonella serotypos (Agona, Anatum, Enteritidis, Havana, Intantis, Owakam, Schwazengrundand Typhimurium). Each serotype was tested five times. Salmonella serotypes were added in the sample of feces individually so that the final concentration of the bacterium was 1,2 x iO3 ufclg. Two grams of each sample were inoculated in 20 mL of the enrichment broth. The proceduring from this point wes the same adopted to carcasses examination. To broiler carcasses there was no statistic difference (p>0, 001) among the enrichment broth and among plating media. However the use of two enrichment broth (SCN and TN) and two agars between XLD agar, SS agar and HE agar gave the bost results. The assay done with feces showed that the TN broth was much better than the others and, in this case it can be plated either HE agar, or VB agar or SS agar The results from the broiler carcasses examination and the feces examination showed that it is not easy to determine the better bacteriologic routine to search for Salmonella and suggest that the association of two eorichments broth and two plating media may improve the test.


 

 

INTRODUÇÃO

As salmonelas são microrganismos capazes de provocar enfermidades em seres humanos e animais. Trata-se de um gênero bacteriano dos mais estudados microbiologicamente. As etapas necessárias para o isolamento e identificação de Salmonella seguem uma seqüência que se inicia com o pré-enriquecimento, seguido por enriquecimento seletivo, plaqueamento, análise bioquimica e tipificação sorológica. O pré-enriquecimento geralmente é empregado na análise de material desidratado ou quando torna-se necessário para viabilizar o inicio da pesquisa da bactéria. As demais etapas da seqüência bacteriológica são elementares.

No final da década de 80, a ocorrência de surtos de salmoneloses em seres humanos em diversos paises (Rodrigue et al., 1990) acirrou ainda mais os estudos a respeito das salmoneloses (Barrow, 1993). A situação do Brasil pode ser observada nos relatos de Taunay et al. (1996) e Tavechio et al. (1996). Em função da participação das aves na contaminação dos seres humanos, o Programa Nacional de Sanidade Avícola, criado pelo Ministério da Agricultura (PNSA-Portaria nº193), adotou normas que considerou importantes para tentar prevenir ou controlar a presença de Salmonella em aves e produtos alimentícios de origem aviária (PNSA-Portaria nº 8). Essas normas contém recomendações sobre a rotina bacteriológica para a pesquisa de Salmonella. Dentre as etapas da seqüencia de isolamento, o enriquecimento e o plaqueamento constituem-se nas fases com elevado número de sugestões de meios de cultivo (Flowers et al.,1992; Wray & Davies,1994). O isolamento da Salmonella é concorrido com outras enterobactérias, que também crescem nos meios de cultivo utilizados. Embora esses meios possam favorecer a multiplicação de Salmonella, eles não conseguem inibir totalmente a multiplicação desses microrganismos competidores. Assim sendo, vários são os ensaios investigando quais os meios de cultivo para enriquecimento e plaqueamento mais apropriados para o isolamento de salmonelas (Flowers et al., 1992; Wray & Davies, 1994). Os meios de enriquecimento mais comuns são os caldos selenito, tetrationato e de Rappaport e seus derivados, acrescidos ou não de novobiocina. Segundo Pessoa & Peixoto (1971), a adição de novobiocina ao caldo selenito favorece o isolamento de Salmonella em detrimento da multiplicação de Proteus sp. Alguns pesquisadores sugerem o caldo selenito, considerando-o melhor que o caldo tetrationato (Cox et al., 1972; Berchieri Jr. et al,. 1983; Armfelt & Korkeaia, 1991), ou melhor que o caldo de Rappaport (Sen, 1964; Ward,1995). Resultados favoráveis ao caldo tetrationato estão contidos nos relatos de Zajc-Satler & Banic (1965), Van Schothorst & Van Leusden (1975), Infante et al. (1992) e Cherrington et al. (1993) e favoráveis ao caldo Rappaport, estão nos relatos de Rappaport et al. (1956), Vassiliadis (1983), Pietzsch (1984), Rengel & Mendonza (1984), Beckers et al. (1986), Bager & Petersen (1991). Segundo Taylor & Silliker (1962), a superioridade de um caldo sobre outro é variável. Segundo alguns autores, melhor que os resultados apresentados por um caldo sobre outro, seria a utilização combinada de mais que um deles (Hajna & Damon, 1956; Smyser & Snoeyenbos, 1969; Radan et al., 1970; Edwards & Ewing, 1972).

Os meios de cultivo para plaqueamento são muitos e os mais comuns são ágar verde brilhante (VB), ágar de MacConkey (MC), ágar Salmonella-Shigella (SS), ágar de Hektoen (HE) e ágar xilose lactose desoxicolato (XLD). O ágar MC é considerado como o meio que oferece com menores chances de isolar Salmonella (Flowors et al., 1992). Contudo, Chau & Leung (1978), citado por Moats (1981), verificaram que o ágar MC foi o único que manteve o crescimento de 764 cepas de Salmonella, em estudo comparativo com outros meios para plaqueamento. Segundo Cox et al. (1972) e Berchieri Jr. et al (1983), o seu rendimento é similar ao observado para o ágar VB. O ágar SS é recomendado por Montford & Thatcher (1961) e por Mccain & Powell (1990). Os demais meios de cultivo para plaqueamento são citados também, sendo que em estudos comparativos, freqüentemente o ágar XLD surge como o mais indicado, embora não seja possível estabelecer qual seria o meio de plaqlueamento ideal (Mccarthy, 1966; King & Metzger, 1968; Isenberg et al., 1969; Taylor & Schelhart, 1967, 1969, 1971; Pollock & Dablgren, 1974; Bourhy et al, 1990; Mrden et al., 1990; Hoszowsky, 1991; Sherrod et al., 1995; Yuno et al., 1995; Petersen, 1997).

Tendo-se em vista que o PNSA indica a metodologia de isolamento de Salmonella, seguindo as recomendações internacionais, sugerindo vários meios de cultivo, o presente trabalho analisou comparativamente três meios de enriquecimento (caldos selenitocistina novobiocina, tetrationato-novobiocina e Rappaport-Vassiliadis-novobiocina) e cinco de plaqueamento (VB, MC, SS, XLD e HE) utilizados para o isolamento de Salmonella de carcaças de frango, prontas para consumo e para o isolamento de oito sorotipos de Salmonella, adicionados artificialmente a amostras de fezes de galinhas.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Carcaças de Frango

Foram analisadas 50 carcaças de frango, de diversas marcas, adquiridas no comércio varejista de Jaboticabal, SP. As carcaças foram colocadas em sacos de polietileno e submetidas ao processo de enxaguadura com 300mL de solução de áqua peptonada tamponada a 0,1% (APT). O lavado foi transferido para recipientes de vidro que permaneciam 6 horas em temperatura ambiente e mais 18 horas a 43ºC. Em seguida, 2mL de cada amostra foram transferidos para 3 tubos contendo 20mL dos caldos de enriquecimento Rappaport-Vassiliadis-novobiocina (RVN), selenito-cistina-novobiocina (SCN) e tetrationato-novobiocina (TN), que foram incubedos a 43ºC por 24 horas. Os caldos de enriquecimento foram semeados em placas contendo os meios em ágar Hektoen (HE), MacConkey (MC), Salmonella-Shigella (SS), verde brilhante (VB) e xilose lisina desoxicolato (XLD), que foram incubadas a 43ºC por 24 horas. De cada placa, 3 a 5 colônias sugestivas de pertencerem ao gênero Salmonella foram inoculadas em tubos contendo ágar tríplice açúcar ferro (TSI) e ágar lisina ferro (LIA), que foram incubados a 37ºC por 24 horas. Confirmando-se a suspeita do gênero, as colônias foram submetidas ao teste de aglutinação em lâmina, com soro polivalente anti-antígenos somáticos (O) e soro polivalente anti-antígenos fiagelares (H) de Salmonella.

Os resultados foram analisados estatisticamente pelo teste não paramétrico qui-quadradoX2 (Thrusfield,1995).

Fezes de Aves

Foram analisadas amostras de fezes de aves poedoiras comerciais contaminadas experimentalmente com 8 sorotipos de Salmonella (Agona, Anatum, Enteritidis, Havana, Infantis, Owakam, Schwazengrund e Typhimurium). Para cada sorotipo, realizaram-se 5 repetições, que foram efetuadas em duas etapas. As cepas foram inoculadas em caldo nutriente e incubadas a 37ºC por 24 horas em agitação. Posteriormente, a cultura foi diluida decimalmente em caldo nutriente; 2mL dessa cultura diluida (10-6) foram misturados em 20g de fezes, tendo a mistura final aproximadamente 1,2 x 102 unidade formadora de colônia (ufc)/g de fezes. Logo após, 2g de cada amostra foram transferidos para 3 frascos de Erlenmeyer, contendo 20mL dos caldos de enriquecimento RVN, SCN, TN, que foram incubados a 43ºC por 24 horas. Os caldos foram semeados em placas contendo ágar Hektoen (HE), MacConkey (MC), Salmonella-Shigella (SS), verde brilhante (VB) e xilose lisina desoxicolato (XLD), e estas foram incubadas a 43ºC por 24 horas. Das placas, 3 a 5 colônias sugestivas de pertencerem ao gênero Salmonella foram inoculadas em tubos contendo ágar tríplice açúcar ferro (TSI) e ágar lisina ferro (LIA), que foram incubados a 37ºC por 24 horas. Confirmando-se a suspeita do gênero, as colônias foram submetidas ao teste de aglutinação em lâmina com soro polivalente anti-antígenos somáticos (O) e soro polivalente anti-antígenos flagelares (H) de Salmonella.

Os resultados foram submetidos à análise estatística pelo teste de Tukey (Banzatto & Kronka, 1992).

 

RESULTADOS

Carcaças de Frango

Foram analisadas 50 amostras, isolando-se Salmonella em 33 delas (66,0%).

Na Tabela 1, encontram-se os resultados referentes à comparação do desempenho dos caldos de enriquecimento empregados. Das 33 amostras contaminadas, obteve-se o isolamento de Salmonella em 25 (75,8%) utilizando-se o caldo SCN, em 23 (69,7%) utilizando-se o caldo TN e em 16 (50,8%) com o caldo RVN. O melhor resultado foi obtido empregando-se a associação dos caldos SCN e TN, sendo a detecção de Salmonella em 33 (100%) carcaças. Os resultados não diferiram estatisticamente entre si (p>0,01).

 

 

A Tabela 2 mostra os resultados do isolamento de Salmonella segundo os meios para plaqueamento. Das 33 amostras contaminadas, isolou-se Salmonella em 30 (90,9%) a partir do ágar XLD; 28 (84,8%) a partir do ágar HE; 27(81,8%) a partir do ágar SS; 23 (69,7%) a partir do ágar MC; e 22 (66,7%) a partir do ágar VB. Estatisticamente não houve diferença significativa (p>0,01) entre os resultados obtidos com os meios para plaqueamento utilizados. No entanto, o maior índice de isolamento de Salmonella foi verificado usando-se a combinação dos meios de plaqueamento XLD e HE ou XLD e SS, correspondendo a 32 (97%) amostras positivas.

 

 

Fezes de Aves

Na Tabela 3, estão distribufdos os resultados do isolamento de Salmonella, a partir dos caldos de enriquecimento utilizados. Das 40 amostras analisadas obteve-se o isolamento de Salmonella em 39(97,5%) com o caldo TN; 20(50,0%) com o RVN; e 13(32,5%) com o SCN. O melhor resultado foi obtido através da utilização associada dos caldos TN e RVN, isolando-se Salmonella em 100% das amostras. Houve diferença significativa (p>0,01) entre os resultados positivos, empregando-se os caldos TN, RVN e SCN, sendo o caldo TN superior aos demais.

 

 

A Tabela 4 mostra os resultados do isolamento de Salmonella em fezes de aves poedeiras comerciais segundo os meios para plaqueamento utilizados. Das 40 amostras analisadas, recuperou-se Salmonella em 38 (95,0%) a partir do ágar HE; em 37 (92,5%) a partir do ágar VB; em 36 (90,0,%) a partir do ágar SS; em 34 (85,0%) a partir do ágar XLD; e em 32 (80,0%) a partir do ágar MC. A combinação dos resultados obtidos com o emprego de VB e HE e de VB e SS propiciou o isolamento de Salmonella de todas as 40 amostras contaminadas experimentalmente. As diferenças observadas entre os resultados individuais do plaqueamento não diferiram estatisticamente entre si (p>0,01).

 

 

DISCUSSÃO

Os dados relativos ao desempenho dos caldos enriquecedores, para o isolamento de Salmonella em carcaças de frango (Tabela 1), não mostraram diferença significativa entre si (p>0,01). Esses achados são semelhantes aos encontrados porTaylor & Silliker (1962), Huhtanen & Naghski (1972) e Nogueira & Franco (1995). No entanto, em valores absolutos, o caldo SCN foi superior aos demais, sendo nítida a diferença em relação aos resultados obtidos com o caldo RVN. Vários autores são favoráveis ao uso de caldo SCN (Sen, 1964; Cox et al., 1972; Berchieri Jr. et al., 1983; Armfelt & Korkeala, 1991; Ward,1995). Os resultados relativos ao caldo TN revelaram-se muito próximos dos obtidos com o caldo SCN e a sugestão do seu uso corrobora com os trabalhos de Zajc-Satler & Banic (1965), Van Schothorst & Van Leusden (1975), Infante et al. (1992) e Cherrington et al. (1993). A adição de novobiocina aos caldos enriquecedores favorece o isolamento de Salmonella (Pessoa & Peixoto, 1971). Contudo, a variação de resultados, observada na literatura especializada, pode ser devido à concorrência com outros microrganismos e o tipo de material analisado (Litchfield, 1973, June et al.,1996). À parte dos resultados individuais para cada caldo, a combinação de dois deles pode apresentar melhores resultados, conforme constataram Hajna & Damon, (1956), Smyser & Snoeyenbos (1969), Radan et al. (1970) e Edwards & Ewing (1972). De fato, o isolamento de Salmonella, em todas as carcaças positivas, foi obtido com o conjunto dos resultados obtidos com os caldos SCN e TN.

Da análise dos resultados relativos aos meios de cultivo para plaqueamento, XLD, HE, SS, MC e VB (Tabela 2), pode-se depreender que não houve diferença significativa entre eles (p>0,01). No entanto, assim como para os caldos enriquecedores, observou-se um destaque numérico quanto à eficiência do ágar XLD em relação aos demais, seguido pelo ágar HE e pelo ágar SS. Uma vez mais, a literatura especializada apresenta referências a todos como meios indicados para o isolamento de Salmonella (Montford & Thatcher, 1961; Mccain & Powell, 1390; Mccarthy, 1966; King & Metzger, 1968; Isenberg et al., 1969; Taylor & Schelhart, 1967, 1969, 1971; Pollock & Dahlgren, 1974; Berchieri jr. et al.,1983; Bourhy et al, 1990; Mrden et al., 1990; Hoszowsky, 1991; Sherrod et al., 1995; Yuno .et al, 1995; e Petersen, 1997). Conforme constatou-se na avaliação dos caldos enriquecedores, notou-se que a associação de dois ou mais meios de isolamento aumentou a eficiência quanto à positividade para Salmonella. Com a combinação dos resultados dos meios de cultivo, ágar XLD e ágar HE ou dos ágar XLD e ágar SS, obteve-se o isolamento de Salmonella em 32 (97,0%) carcaças analisadas.

Quanto ao exame bacteriológico de fezes contaminadas experimentalmente, a princípio as amostras continham números elevados de Salmonella (dados não apresentados). Nessas condições, todos os meios de cultivo utilizados, para o enriquecimento ou para o isolamento, apresentaram o mesmo desempenho, permitindo a recuperação de salmonelas a partir de todas as amostras testadas. As diferenças surgiram quando a quantidade de células viáveis de Salmonella adicionada às fezes foi reduzida. Com relação aos caldos de enriquecimento, houve diferença significativa (p> 0,01) quanto à recuperação dos oito sorotipos (Agona, Anatum, Enteritidis, Havana, Infantis, OwaLam, Schwazengrund e Typhimurium) inoculados nas amostras de fezes, sendo observada a supremacia do caldo TN em relação aos caldos RVN e SCN. Segundo Read et al. (1994), a freqüência de isolamento de diferentes sorotipos de Salmonella altera-se conforme os meios utilizados para enriquecimento e plaqueamento do material examinado. Contudo, o mesmo não se constatou para os meios de plaqueamento, pois os sorotipos foram recuperados de maneira análoga, concordando com Arroyo & Arroyo (1995), que afirmam que o isolamento de Salmonella não depende do meio seletivo utilizado e nem do sorotipo inoculado, mas da concentração de Salmonella na amostra e da presença de competidores. De fato, antes de se diminuir a quantidade de Salmonella nas amostras de fezes a serem examinadas, todos os sorotipos de Salmonella foram recuperados das amostras de fezes, através de todos os caldos de enriquecimento e meios de plaqueamento. A análise conjunta dos resultados experimentais com quantidade maior e menor de células viáveis de salmonelas reforça o conceito de que a presença de outras bactérias, principalmente enterobactérias, dificulta a ação dos caldos de enriquecimento sobre os microrganismos competidores. Assim, a superioridade do caldo TN foi notória, recuperando Salmonella de 39 das 40 amostras contaminadas (Tabela 3). No que concerne aos meios para plaqueamento, embora não tenha ocorrido diferença significativa (p>0,01) entre os valores obtidos para os diferentes meios e os oito sorotipos de Salmonella, é possível destacar maior eficiência do ágar HE, seguido VB e do SS, tendo o ágar XLD rendimento superior apenas em relação ao ágar MC (Tabela 4).

Comparando-se os resultados obtidos no isolamento de Salmonella em carcaças de frango e em fezes de aves, verifica-se que houve uma diferença quanto ao desempenho dos caldos seletivos de enriquecimento e dos meios seletivos para plaqueamento. Para o isolamento de Salmonella em carcaças de frango, o melhor resultado individual foi observado com a utilização do caldo de enriquecimento SCN (75.8%) e do ágar XLD (90.9%). Entretanto, alcançou-se 100% de isolamento de Salmonella com a combinação dos caldos SCN e TN, e com a associação dos meios para plaqueamento ágar XLD e HE ou ágar XLD e SS, obteve-se 97% de positividade de Salmonella. Por outro lado, para o isolamento de Salmonella das fezes de aves, o melhor resultado individual foi conseguido com a utilização do caldo TN (97.5%) e do ágar HE (95,0%). Mas 100% do isolamento de Salmonella foi conseguido com a combinação dos resultados com os caldos TN e RVN e plaqueamento nos agares HE e VB ou SS e VB. Dessa forma, os resultados do presente trabalho demonstram a dificuldade de se determinar qual o melhor caldo ou ágar para utilização no isolamento de Salmonella em diferentes tipos de amostras. Porém, deixa claro que o melhor desempenho advém da combinação de dois ou mais caldos de enriquecimento e meios para plaqueamento.

 

AGRADECIMENTOS

Ao Sr. Antônio José dos Santos e à Sra. Aparecida Rodrigues Batista, pela assistência laboratorial, e ao CNPq e à FAPESP pelo apoio financeiro.

 

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