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Polimorfismo genético do fibrinogênio na doença arterial periférica

Genetic polymorphisms of fibrinogen in peripheral artery disease

Resumos

O objetivo do presente estudo foi analisar freqüências alélicas e genotípicas para o gene codificador da cadeia beta do fibrinogênio em pacientes com doença arterial periférica (DAP). Foram estudados 44 pacientes caucasóides do sexo masculino com sintomas clínicos e comprovação angiográfica de DAP, com idade entre 38 e 79 anos (62±8,6 anos). Entre eles, 22 apresentaram obstrução aterosclerótica nas artérias ilíacas, femorais e/ou carótidas e 22 tinham aneurisma de aorta torácica, abdominal ou tóraco-abdominal. O grupo controle foi constituído por 56 indivíduos, sem história clínica de DAP ou alterações ao exame clínico, com idades variando de 43 a 80 anos (59±9,2 anos). Foram excluídos os indivíduos com doença renal, doença hepática ou diabetes mellitus. A análise do polimorfismo genético da cadeia do fibrinogênio foi realizada por PCR (polimerase chain reaction) e RFLP (restriction fragment lenght polimorphism) com a endonuclease Bcl I, identificando-se três genótipos: B1/B1, B1/B2 e B2/B2. A análise estatística incluiu teste exato de Fisher, calculo do odds ratio, teste de Kruskal Wallis e análise de variância (ANOVA). Admitiu-se erro a igual a 5%, com nível de significância para P<0,05. O alelo B1 foi o mais prevalente em pacientes e controles (0,819 e 0,857, respectivamente; P=0,5605), com prevalência do genótipo B1/B1 nos pacientes (65,9%) e controles (71,4%; P=0,6639), seguido de B1/B2 (31,8; 28,6%, respectivamente; P=0,8268). Em conclusão, DAP, independente do tipo de lesão obstrutiva ou aneurismática, apresenta-se indiferente ao polimorfismo Bcl I do fibrinogênio, portanto, sem influência dos alelos B1 e B2 para fibrinogênio e seus respectivos genótipos na doença.

Polimorfismo genético; fibrinogênio; doença arterial periférica


The objective of this study was to analyze the frequencies of the alleles and genotypes of the gene encoder of the fibrinogen b-chain in patients suffering from peripheral artery disease. A total of 62 male Caucasoid patients with ages varying from 38 to 79 years old were studied. All the patients had clinical symptoms of peripheral artery disease, which was later confirmed by angiography. Forty of the patients had atherosclerotic obstructions of the iliac, femoral or carotid arteries and 22 suffered from aneurysms of the thoracic, abdominal or thoracoabdominal aortas. All the patients were submitted to surgery. A control group was formed of 62 individuals, with ages ranging from 43 to 80 years old, without clinical histories or alterations in their clinical examinations of peripheral artery disease. Individuals with renal disease, liver disease or diabetes mellitus were excluded. Analysis of the fibrinogen b-chain was performed using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism with Bcl I endonuclease. Three genotypes, B1/B1, B1/B2 and B2/B2 were identified. Statistical analysis was made using the Fisher Exact test, odds ratio, Kruskal-Wallis test and variance analysis (ANOVA). A p-value = 0.05 was considered significant. The B1 allele was the most prevalent in both patients and the control group (0.819 and 0.857, respectively), with prevalence of the B1/B1 genotype in patients and controls (65.9% vs. 71.4% respectively), followed by B1/B2 (31.8% vs. 28.6% respectively). No significant difference was observed in relation to the Bcl I polymorphisms of the fibrinogen b-chain and obstructive and aneurysmal peripheral artery disease. In conclusion, the B1 and B2 polymorphisms of the fibrinogen b-chain and their respective genotypes do not have any influence in peripheral artery disease.

Fibrinogen genetic polymorphisms; peripheral artery disease


ARTIGO ARTICLE

Polimorfismo genético do fibrinogênio na doença arterial periférica

Genetic polymorphisms of fibrinogen in peripheral artery disease

Antônio C. BrandãoI; Daniel M. TrindadeII; Julia HottaIII; Marcela A. PinhelIII; Alexandre M. AnacletoIV; José Maria P. GodoyV; Moacir F. GodoyV; José E. SantosVI; Dorotéia R. S. SouzaVII

IProf. Dr. Adjunto do Depto. de Biologia Molecular da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - Famerp

IIProf. Dr. do Departamento de Genética Molecular da Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto

IIIBióloga Estagiária do Depto. de Biologia Molecular da Famerp

IVMédico do Instituto de Moléstias Cardiovascular de São José do Rio Preto-SP

VProf. Dr. Adjunto do Deptº de Cardiologia e Cirurgia Cardiovascular da Famerp

VIProf. Dr. do Deptº de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP

VIIProfa. Dra. Adjunto do Depto. de Biologia Molecular da Famerp

Endereço para correspondência Endereço para correspondência Antonio Carlos Brandão Rua: Garabed Karabashian, 411 1570-600 — São José do Rio Preto-SP

RESUMO

O objetivo do presente estudo foi analisar freqüências alélicas e genotípicas para o gene codificador da cadeia b do fibrinogênio em pacientes com doença arterial periférica (DAP). Foram estudados 44 pacientes caucasóides do sexo masculino com sintomas clínicos e comprovação angiográfica de DAP, com idade entre 38 e 79 anos (62±8,6 anos). Entre eles, 22 apresentaram obstrução aterosclerótica nas artérias ilíacas, femorais e/ou carótidas e 22 tinham aneurisma de aorta torácica, abdominal ou tóraco-abdominal. O grupo controle foi constituído por 56 indivíduos, sem história clínica de DAP ou alterações ao exame clínico, com idades variando de 43 a 80 anos (59±9,2 anos). Foram excluídos os indivíduos com doença renal, doença hepática ou diabetes mellitus. A análise do polimorfismo genético da cadeia do fibrinogênio foi realizada por PCR (polimerase chain reaction) e RFLP (restriction fragment lenght polimorphism) com a endonuclease Bcl I, identificando-se três genótipos: B1/B1, B1/B2 e B2/B2. A análise estatística incluiu teste exato de Fisher, calculo do odds ratio, teste de Kruskal Wallis e análise de variância (ANOVA). Admitiu-se erro a igual a 5%, com nível de significância para P<0,05. O alelo B1 foi o mais prevalente em pacientes e controles (0,819 e 0,857, respectivamente; P=0,5605), com prevalência do genótipo B1/B1 nos pacientes (65,9%) e controles (71,4%; P=0,6639), seguido de B1/B2 (31,8; 28,6%, respectivamente; P=0,8268). Em conclusão, DAP, independente do tipo de lesão obstrutiva ou aneurismática, apresenta-se indiferente ao polimorfismo Bcl I do fibrinogênio, portanto, sem influência dos alelos B1 e B2 para fibrinogênio e seus respectivos genótipos na doença.

Palavras-chave: Polimorfismo genético; fibrinogênio; doença arterial periférica.

ABSTRACT

The objective of this study was to analyze the frequencies of the alleles and genotypes of the gene encoder of the fibrinogen b-chain in patients suffering from peripheral artery disease. A total of 62 male Caucasoid patients with ages varying from 38 to 79 years old were studied. All the patients had clinical symptoms of peripheral artery disease, which was later confirmed by angiography. Forty of the patients had atherosclerotic obstructions of the iliac, femoral or carotid arteries and 22 suffered from aneurysms of the thoracic, abdominal or thoracoabdominal aortas. All the patients were submitted to surgery. A control group was formed of 62 individuals, with ages ranging from 43 to 80 years old, without clinical histories or alterations in their clinical examinations of peripheral artery disease. Individuals with renal disease, liver disease or diabetes mellitus were excluded. Analysis of the fibrinogen b-chain was performed using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism with Bcl I endonuclease. Three genotypes, B1/B1, B1/B2 and B2/B2 were identified. Statistical analysis was made using the Fisher Exact test, odds ratio, Kruskal-Wallis test and variance analysis (ANOVA). A p-value = 0.05 was considered significant. The B1 allele was the most prevalent in both patients and the control group (0.819 and 0.857, respectively), with prevalence of the B1/B1 genotype in patients and controls (65.9% vs. 71.4% respectively), followed by B1/B2 (31.8% vs. 28.6% respectively). No significant difference was observed in relation to the Bcl I polymorphisms of the fibrinogen b-chain and obstructive and aneurysmal peripheral artery disease. In conclusion, the B1 and B2 polymorphisms of the fibrinogen b-chain and their respective genotypes do not have any influence in peripheral artery disease.

Key words: Fibrinogen genetic polymorphisms; peripheral artery disease.

Introdução

O fibrinogênio, uma glicoproteína plasmática com ação no final da cascata de coagulação sangüínea, é também reconhecido como fator de risco para a doença arterial coronariana (DAC), acidente vascular cerebral (AVC) e doença arterial periférica (DAP).1-6 Após a clivagem pela trombina, essa proteína forma monômeros de fibrina, os quais se polimerizam no processo de coagulação. Nesse contexto, o fibrinogênio, bem como a fibrina e seus produtos de degradação, pode se acumular na placa aterosclerótica e estimular a proliferação de células musculares lisas. Além disso, a organização de trombos também está envolvida na progressão da aterosclerose.7,8

Vários fatores parecem influenciar a concentração plasmática de fibrinogênio, como tabagismo, idade, obesidade, nível de colesterol, diabetes mellitus, consumo de álcool, ingestão de fibras, uso de contraceptivos orais e menopausa. Além disso, estimativas de herdabilidade dos níveis plasmáticos de fibrinogênio variam de 27% a 51%.1

O fibrinogênio é composto por três cadeias polipeptídicas conhecidas como a, b e g, com simetria bilateral, organizadas e conectadas por pontes bissulfeto, cujos genes estão localizados no cromossomo 4 humano na região 4q28, constituindo um conjunto de aproximadamente 50 kb. Entretanto, o processo que coordena a expressão dos três genes ainda é obscuro. Nesse caso, parece que a cadeia b atua como fator limitante na síntese dos outros dois componentes do fibrinogênio.9,10

O polimorfismo b Bcl I, localizado na região 3' do gene Ab é associado a aterosclerose periférica.4 Essa variante funcional pode resultar da substituição de guanina por adenina na posição b 448, com troca de arginina por lisina, posicionada a 13 resíduos de aminoácidos antes do grupo carboxil terminal da cadeia b do fibrinogênio. Isso gera a expressão de dois alelos identificados como B1 e B2, cujas combinações permitem três genótipos B1/B1, B1/B2 e B2/B2, em cerca de 67, 30 e 3% da população, respectivamente.4

Este estudo teve como objetivo analisar freqüências alélicas e genotípicas para o gene codificador da cadeia b do fibrinogênio em pacientes com doença arterial periférica.

Casuística e Método

Foram estudados cem indivíduos caucasóides do sexo masculino, entre eles 44 pacientes com sintomas clínicos e comprovação angiográfica de DAP, com idade entre 38 e 79 anos (média e desvio padrão = 62 ± 8,6 anos). Desses, 22 apresentaram obstrução aterosclerótica nas artérias ilíacas, femorais e/ou carótidas e 22 tinham aneurisma de aorta torácica, abdominal ou tóraco-abdominal. O grupo controle constituiu-se de 56 indivíduos, sem história clínica ou alterações ao exame clínico, cuja idade variou de 43 a 80 anos (média e desvio padrão = 59 ± 9,2 anos). Foram excluídos os indivíduos com doença renal, doença hepática ou diabetes mellitus. Todos os indivíduos concordaram em participar do estudo pelo Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

Análise molecular

O DNA genômico foi extraído de leucócitos de sangue periférico (5 mL) coletados com EDTA. A extração foi realizada em três etapas, compreendendo: 1) lise das células sangüíneas e desnaturação com solução de brometo dodeciltrimetilamonio (DTAB); 2) desproteinização com clorofórmio; 3) precipitação do DNA e ressuspensão via brometo cetilmetrimetilamonio (CTAB).11

O segmento polimórfico do gene para a cadeia b do fibrinogênio foi amplificado por PCR (polymerase chain reaction). Em cada reação utilizou-se 0,5 µL de cada desoxinucleotídeo (0,8 mM); 2,5 µL de tampão PCR 10X; 2,5 µL de dimetilsulfóxido 10%; 2,5 µL de cada primer (2,5mM); 0,2 µL de Taq polimerase (5 U/µL); 11µL de água Milli Q; 2 µL de DNA genômico diluído (0,2mg). Foram utilizados os primers P1: 5'-ACCTGGTTTCTCTGCCACAAG -3' e P2: 5'-AATAGTTCTCATACCAAGTGT-3'. A amplificação foi realizada com desnaturação inicial a 94ºC por cinco minutos seguido de 35 ciclos a 95ºC por um minuto para desnaturação do DNA, 55ºC por um minuto para anelamento dos primers, 72ºC por dois minutos para extensão da amplificação e ciclo final a 72ºC por sete minutos. As amostras foram expostas a enzima de restrição Bcl I e mantidas em banho-maria a 37ºC, overnight, para reconhecimento das substituições das bases nitrogenadas guanina por adenina no códon B448.12 A enzima Bcl I não atinge o produto da amplificação referente ao alelo B1, nesse caso os segmentos apresentam 2.500pb, enquanto em B2 ocorre restrição enzimática gerando fragmentos de 1.100 e 1.400pb. Desse modo, três genótipos podem ser identificados: B1/B1, B1/B2 e B2/B2.

O produto de reação foi aplicado em gel de agarose a 1% preparado com tampão TEB diluído dez vezes e brometo de etídeo (0,2 mg/L), submetido a eletroforese em corrente contínua de 200 V por 20 minutos, utilizando-se como padrão ladder 500pb (Gibco).

Análise estatística

Freqüências alélicas e genotípicas foram comparadas entre pacientes e controles utilizando-se o teste exato de Fisher. Procedimento semelhante foi realizado para os pacientes subdivididos de acordo com o tipo de lesão arterial, considerando-se aqueles com DAP obstrutiva (DAPO) ou DAP aneurismática (DAPA). A influência dos alelos e genótipos na presença ou ausência da doença foi verificada pelo cálculo dos produtos cruzados (odds ratio) com intervalo de confiança (IC) de 95%. Admitiu-se erro a de até 5%, sendo considerados significantes valores de P< 0,05.

Resultados

A distribuição das freqüências alélicas e genotípicas para a cadeia b do fibrinogênio, referente a 44 pacientes e 56 controles para a cadeia b do fibrinogênio, é apresentada na tabela 1. O alelo B1 foi o mais representado nos pacientes e controles (0,819; 0,857, respectivamente; P=0,5605). O genótipo B1/B1 foi detectado em 65,9% dos pacientes e 71,4% (P=0,6639) dos controles, seguido de B1/B2 (31,8; 28,6%, respectivamente; P=0,8268). O genótipo B2/B2 foi observado apenas em um paciente (2,3%) e sem representatividade nos controles.

A tabela 2 mostra a distribuição dos alelos e genótipos para o fibrinogênio em pacientes com DAPO ou DAPA. Nota-se semelhança entre os grupos, sendo o alelo B1 mais freqüente em pacientes com obstrução ou aneurisma (0,886; 0,773, respectivamente; P=0,2565). O genótipo B1/B1 destacou-se com prevalência de 77,2% na DAPO e 54,5% em pacientes com DAPA (P=0,2027). O genótipo B2/B2 foi detectado em apenas um paciente com DAPA (4,5%), sem ocorrência em DAPO. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos, confirmando-se pelo cálculo do odds ratio para os genótipos e alelos da cadeia b do fibrinogênio (Tabela 3).

Discussão

O polimorfismo Bcl I para a cadeia a do fibrinogênio, é representado neste estudo principalmente pelo alelo B1 em controles e pacientes, independente de DAP obstrutiva ou aneurismática, enquanto o alelo B2 mostra prevalência igualmente reduzida entre os grupos (0,143; 0,181, respectivamente). Freqüências reduzidas do alelo B2 também foram detectadas por Fowkes et al1 em pacientes com DAP (0,197), embora significantemente aumentada em relação aos controles (0,097). Nesse caso, registraram freqüência de 29,6% de pacientes homozigotos ou heterozigotos para o alelo B2, contra 15,8% dos controles. No presente estudo, os genótipos com pelo menos um alelo B2 também foram preferencialmente observados nos pacientes (34,1%) em relação aos controles (28,6%), embora sem diferença significante entre os grupos. Nesse caso, o tamanho reduzido da casuística pode se tornar um fator limitante na análise dos dados.

Éster de colesterol, colesterol e fibrinogênio são os principais componentes da placa aterosclerótica, sendo que a concentração do fibrinogênio na lesão parece ser proporcional ao conteúdo de lipídios.7, 13 Nesse contexto, estudos revelam associação entre níveis de fibrinogênio e alelo B2 nas doenças cardiovasculares.5 Estudos in vitro demonstaram absorção do fibrinogênio por pérolas de oleato de colesteril e lecitina, sendo tal absorção proporcionalmente maior de acordo com o aumento da concentração de éster de colesterol na superfície das pérolas.14 Entretanto, a influência do alelo B2 pode não apenas mediar a concentração do fibrinogênio, mas associar-se a um desequilíbrio de ligação com genes vizinhos ou variações em sua estrutura.1

O estudo de Edinburgh, envolvendo quarenta casos de aneurisma de aorta abdominal, mostrou que tanto o fibrinogênio como os dímeros da fibrina apresentam-se associados com aumento significante para o risco da doença, provavelmente por deposição da fibrina no saco aneurismático.6 Singh et al,15 em estudo retrospectivo realizado na Noruega abrangendo 6.386 indivíduos, confirmaram a relação entre aumento nos níveis plasmáticos de fibrinogênio e aneurisma de aorta abdominal. Nesse contexto, considerando a associação entre os níveis de fibrinogênio e o alelo B2,5 no presente estudo a presença do alelo B2, principalmente nos pacientes com DAPA (0,227) comparado àqueles com DAPO (0,114), pode ser um fator de risco para a doença, o que deve ser investigado em casuísticas amplas, incluindo também dosagens bioquímicas.

Vários polimorfismos do gene b para o fibrinogênio, além do Bcl I, têm sido investigados e caracterizados em relação ao nível plasmático de fibrinogênio, incluindo o Hae III localizado na região promotora em posição 455. Entretanto, há ainda aspectos polêmicos quanto à sua associação com DAP e doença arterial coronariana (DAC). Lee et al6 encontraram freqüência significantemente aumentada do polimorfismo 455G/A em pacientes com DAP em relação aos controles, mas não para DAC. é possível que o loco polimórfico b Hind III (posição 148), associado intimamente com b Hae III, afete a interação deste sítio regulador e fatores de transcrição induzidos ou modulados pelo cigarro, que é fator de risco importante para DAC e DAP e determinante do fibrinogênio plasmático.4

Nesse contexto, este estudo, embora com resultados não mostrados, registrou tabagismo em 45% dos pacientes com DAPO e 36% daqueles com DAPA, além de hipertensão arterial (40% e 55%, respectivamente). Nesse caso, embora não detectada no presente trabalho associação entre polimorfismo Bcl I e DAP, é possível que esses fatores associados à presença do alelo B2 identifiquem um subgrupo de pacientes que deve ser caracterizado em uma casuística ampla. Em conclusão, embora neste estudo DAP aterosclerótica obstrutiva ou aneurismática apresenta-se indiferente ao polimorfismo b Bcl I, a presença do alelo B2 associado a outros fatores de risco para doença aterosclerótica deve ser avaliado.

Recebido: 28/04/2004

Aceito após modificações: 28/07/2004

Avaliação: Editor e dois revisores externos.

Conflito de interesse: não declarado

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  • Endereço para correspondência
    Antonio Carlos Brandão
    Rua: Garabed Karabashian, 411
    1570-600 — São José do Rio Preto-SP
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      31 Mar 2005
    • Data do Fascículo
      2004
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