Conjugação de controle isotípico para citometria de fluxo

Conjugation of isotypic control for flow cytometry

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Conjugação de controle isotípico para citometria de fluxo

Conjugation of isotypic control for flow cytometry

Juliana Pereira

Pesquisadora HC-FMUSP

^{Correspondência}

Um artigo de Golim et al publicado neste fascículo da Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia aborda um tema extremamente controverso na literatura – o uso do controle isotípico em citometria de fluxo. Por outro lado é um incentivo ao investimento em pesquisa e conseqüente construção de possibilidades de geração de conhecimento e desenvolvimento na área das ciências médicas no Brasil.

A padronização in house da conjugação e validação do controle isotípico (CI) IgG1-FITC estimula e evidencia o potencial do nosso país na produção de tecnologia, reduzindo custos sem perda de qualidade. E nos recupera à memória o enorme potencial dos pesquisadores nacionais na área das ciências médicas, que freqüentemente ficam isolados nas Universidades por falta de oportunidades de investimento.

Durante a leitura deste artigo, vários leitores certamente irão perguntar se a metodologia empregada será levada à prática comercial ou ficará guardada nos arquivos da teoria, mesmo tendo sido demonstrado preliminarmente que o controle isotípico produzido por Golim et al. demonstrou ser superior aos reagentes comerciais.

Basicamente, o controle isotípico é definido como quantidade mínima ou irrelevante de anticorpo (Ac) de mesma classe da imunoglobulina (Ig) do Ac alvo utilizado no painel em CMF. Funciona como controle negativo, revelando a fluorescência basal emitida pela célula alvo marcada com anticorpo não específico a nenhuma proteína desta célula. Desta forma, a principal função do controle isotípico é permitir a quem executa o procedimento padronizar o limite acima do qual os sinais de fluorescência serão interpretados como positivos ou verdadeiros e não apenas "ligações não específicas".

Entretanto, o CI não é um controle negativo perfeito, devido à variabilidade durante a purificação do Ac e da conjugação dos fluorocromos entre os diferentes lotes e fabricantes. Idealmente, a subclasse, a relação fluorocromo/proteína e a concentração do anticorpo isotípico e do anticorpo teste devem ser respeitadas, dificultando seu uso na prática laboratorial. Por outro lado, na execução de um painel de marcadores de superfície para leucemia ou linfoma, para cada anticorpo monoclonal (AcMo) utilizado deve haver um controle isotípico correspondente de mesma subclasse de Ig, mesma relação F/P e mesma fluorescência, o que raramente ocorre no laboratório clínico.

Estas limitações devem ser conhecidas e relevadas durante o uso do controle isotípico. Para alguns autores, em muitos casos, o uso do controle isotípico pode ser preterido devido à presença de um controle negativo em um dos tubos do painel, o que não é incorreto quando a população positiva de interesse é claramente separada da negativa. Neste caso, a população negativa pode ser usada como ponto discriminante entre células positivas e negativas, sem interferir na porcentagem de células positivas, além da redução de custo dos testes.

Outros autores advogam ser imprescindível o uso de CI na formação de laboratoristas em citometria de fluxo, na implantação de novos laboratórios de citometria e durante a avaliação de novos AcMos e novas técnicas. Assim como em procedimento de imunofenotipagem por citometria de fluxo de leucemia e linfoma. Neste caso, o CI fornece elementos indicativos de integridade, de forma que a presença de alto nível de ligação não específica identificada pelo controle isotípico denuncia interferências graves na interpretação dos resultados.

Durante a pesquisa de antígeno expresso em baixa densidade em que não há clara separação entre população positiva e negativa, o controle isotípico também é útil. Apesar de não garantir a estimativa exata da porcentagem de células positivas, contribui para estabelecer confiança de que a população positiva realmente expressa o antígeno pesquisado.

Da mesma forma, na marcação intracelular é apropriado o uso de controle isotípico para monitorar os efeitos do procedimento de fixação, permeabilização e lavagem sobre a autofluorescência e ligações de anticorpos não específicas.

Em resumo, tradicionalmente o controle isotípico é usado para estimar o número de células que reagem de forma não específica com o anticorpo investigado. Entretanto, com o advento dos AcMo diretamente conjugados e da análise multiparamétrica se reduziu a necessidade do uso de um tubo de controle negativo. Alguns consensos em citometria de fluxo recomendam que o uso do controle isotípico é irrelevante e potencialmente fator de erro ou de confusão na pesquisa de antígenos de superfície por citometria de fluxo.

Ao lado de todas as considerações acima, o artigo de Golim et al, que relata a padronização de uma técnica de conjugação de controle isotípico com resultados superiores comparativamente aos reagentes comerciais, é de fundamental importância para todos os que trabalham com citometria de fluxo e estão em busca de redução de custo preservando a qualidade. É importante para o do ponto de vista tecnológico e não deve ser esquecida, mas, outrossim, divulgada e levada adiante pelos autores e outros pesquisadores de interesse comum.

Recebido: 03/12/2007

Aceito: 03/12/2007

Avaliação: O tema abordado foi sugerido e avaliado pelo editor

Conflito de interesse: não declarado

• 1. O'Gorman MR. Isotype controls - Time to Let Go? Comunications in Clinical Cytometry. 1999;38:78-80.
• 2. Keeney M, Gratama JW, Chin-Yee IH, Sutherland DR. Isotype controls in the analysis of lymphocytes and CD34 stem and progenitor cells by flow cytometry - Time to Let Go! Comunications in Clinical Cytometry. 1998;34:280-3.
• 3. Sreena JJ, Tbakhi A, Edinger MG, Tubbs RR. The use of isotypic control antibodies in the analysis of CD3+ and CD3+, CD4+ lymphocyte subsets by flow cytometry. Are they really necessary? Arch Pathol Lab Med. 1997;121:118-21.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Mar 2008
• Data do Fascículo
  Dez 2007