Frequência do polimorfismo da glicoproteína IIIa de plaquetas (PlA2) em mulheres com diabetes mellitus tipo 2

Platelet glycoprotein IIIa polymorphism (PlA2) frequency in Type 2 diabetic women

ARTIGO ARTICLE

Frequência do polimorfismo da glicoproteína IIIa de plaquetas (Pl^A2) em mulheres com diabetes mellitus tipo 2

Platelet glycoprotein IIIa polymorphism (Pl^A2) frequency in Type 2 diabetic women

Anna L. Soares^I; Marinez O. Sousa^II; Fernanda R. Freitas^III; Michelle A. R. Borges^IV; Pedro W. Rosário^IV; Geralda F. G. Lages^V; Jarbas E. Cardoso^V; Karina B.G. Borges^II; Ana Paula S. M. Fernandes^II; Maria das Graças Carvalho^II

^IFarmacêutica-bioquímica

^IIProfessora Adjunta do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Farmácia da UFMG – Belo Horizonte-MG

^IIIBolsista de iniciação científica

^IVMédica(o) da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte-MG

^VFarmacêutica(o)-bioquímica(o) do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Farmácia da UFMG

^{Correspondência}

RESUMO

O polimorfismo da glicoproteína IIIa de plaquetas está associado a um aumento no risco de doenças arteriais coronarianas. Mulheres com diabetes mellitus tipo 2 apresentam um aumento de cinco vezes no risco para doenças arteriais coronarianas quando comparadas com mulheres não-diabéticas. O objetivo do presente estudo foi verificar a frequência do polimorfismo da glicoproteína IIIa (Pl^A2) em mulheres com diabetes mellitus tipo 2 e comparar com a frequência descrita na literatura. A análise do polimorfismo Pl^A2 foi realizada para 62 mulheres com diabetes mellitus tipo 2 através da reação em cadeia da polimerase seguida de análise do polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição (PCR-RFLP). As frequências observadas foram 81% para Pl^A1A1, 18% para Pl^A1A2 e 1% para Pl^A2A2. Não houve diferença significativa entre as frequências observadas e as frequências descritas na literatura. Nossos resultados sugerem que a frequência do polimorfismo Pl^A2 em mulheres com diabetes mellitus tipo 2 é a mesma observada na população em geral.

Palavras-chaves: Plaquetas; glicoproteína IIIa; polimorfismo; diabetes tipo 2; mulheres.

ABSTRACT

The platelet glycoprotein IIIa polymorphism is associated to an increased risk of coronary heart disease. Type 2 diabetic women present a fivefold higher risk of coronary heart disease compared to non-diabetic women. The aim of this study was to verify the frequency of the glycoprotein IIIa polymorphism (Pl^A2) in type 2 diabetic women and compare this result with the frequency reported for the general population. The PlA polymorphisms of 62 type 2 diabetic women were determined by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The resulting frequencies were 81% for Pl^A1A1, 18% for Pl^A1A2 and 1% for Pl^A2A2. There was no significant difference between observed frequencies and the frequencies described in the literature. Our results suggest that the frequency of the glycoprotein IIIa polymorphism, Pl^A2, in type 2 diabetic women is similar to that observed in general population

Key words: Platelets; glycoprotein IIIa; polymorphism; Type 2 diabetes; women.

Introdução

As plaquetas são pequenos fragmentos citoplasmáticos de megacariócitos que não possuem núcleo, apresentam diâmetro de 2 µm e vida média de seis a dez dias.¹ Apesar da aparência morfológica simples na microscopia ótica, as plaquetas possuem uma estrutura funcional complexa que permite um rápido reconhecimento da lesão vascular e início da formação do tampão plaquetário.^1,2

A glicoproteína IIbIIIa é o receptor de superfície plaquetário mais abundante e apresenta um papel fundamental na formação de trombos, pois promove a ligação das plaquetas por intermédio do fibrinogênio e do fator de von Willebrand.³

Estudos recentes têm mostrado que o polimorfismo na glicoproteína IIIa (Pl^A2), em homozigose, está associado a um risco três vezes maior de doença cardiovascular isquêmica e de quatro vezes maior de infarto do miocárdio. A influência funcional do polimorfismo sobre a reatividade da plaqueta permanece sem explicação.^4,5 A associação entre o alelo Pl^A2 e eventos cardiovasculares ainda não é considerada um achado consistente,⁶ entretanto, já foi descrito que o alelo Pl^A2 está associado a um aumento da agregação plaquetária³ e que o polimorfismo promove uma interação mais intensa com o fibrinogênio.⁷

Homens e mulheres com diabetes mellitus tipo 2 apresentam um risco aumentado para doença arterial coronariana (DAC) devido às complicações macrovasculares inerentes à doença.^8,9 Para os homens há duplicação do risco total para DAC quando comparados com homens sem diabetes, e para as mulheres há um aumento de cinco vezes quando comparadas com mulheres não-diabéticas. O aumento do risco cardiovascular para mulheres diabéticas já foi confirmado por estudos epidemiológicos.^10,11

Entre os indivíduos não diabéticos, as mulheres apresentam um risco cardiovascular menor que o dos homens. De fato, o diabetes "anula" o efeito protetivo da mulher em relação à doença cardiovascular. Nas mulheres, o controle glicêmico é afetado pela alta incidência de distúrbios alimentares, uso de contraceptivo hormonal, menstruação, gravidez e climatério. Outros fatores também contribuem para aceleração do risco de DAC em mulheres com diabetes, tais como hipertensão arterial, dislipidemia, obesidade central, depressão e baixo nível socioeconômico.¹¹

Mulheres com níveis normais de estrógeno, geralmente apresentam baixo risco cardiovascular. Na menopausa, com a redução do estrógeno, observa-se aumento do LDLc, redução do HDLc, aumento na deposição de gordura abdominal e hipertensão. Todo esse fenômeno é acompanhado pelo aumento da idade.¹²

Frente a esse cenário, o presente estudo teve como objetivo verificar a frequência do polimorfismo Pl^A2 em mulheres com diabetes mellitus tipo 2 e comparar a frequência observada com a descrita na literatura.

Casuística e Método

Este estudo transversal recebeu parecer favorável do Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG - COEP e do Comitê de Ética em Pesquisa da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte. Todas as participantes receberam esclarecimento sobre os objetivos, responderam a ficha clínica e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE.

Foram selecionadas 62 mulheres com faixa etária entre 40 e 75 anos e com diagnóstico clínico de diabetes mellitus tipo 2, segundo os critérios da Organização Mundial de Saúde (1999). Foram excluídas as mulheres que estavam em tratamento de reposição hormonal, tabagistas, pacientes com história clínica de tumor maligno, doença infecciosa aguda, trombose venosa profunda, tromboembolismo pulmonar, infarto agudo do miocárdio e desequilíbrio metabólico.

As amostras de sangue venoso foram obtidas utilizando-se tubos com EDTA do sistema Vacuette® (Geiner Bio-One). As amostras de DNA foram obtidas a partir de 300 µL de sangue total, submetidos ao processo de precipitação com acetato de amônia (segundo o protocolo e os reagentes do Wizard Genomic DNA Purification Kit - Promega®).

Para a pesquisa do polimorfismo no gene da glicoproteína IIIa de plaqueta foi utilizada a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), seguida de digestão com enzima de restrição para análise do polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição (RFLP), utilizando-se os oligonucleotídeos e a metodologia descrita por Pamukcu,⁵ conforme exposto abaixo.

Após a extração de DNA total, uma região de 282 pares de bases do gene codificador da GPIIIa foi amplificada, utilizando-se os oligonucleotídeos 5 GCT CCA ATG TAC GGG GTA AAC 3 e 5 GGG GAC TGA CTT GAG TGA CCT 3. As condições da reação de PCR consistiram de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento a 55ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 45 segundos, precedidos de um passo inicial de desnaturação a 94ºC por 4 minutos e finalizados com um passo de 72ºC por 8 minutos. O produto de PCR de 282pb foi submetido à digestão com a enzima de restrição Msp I (Promega®). A presença do polimorfismo cria uma sequência que a enzima Msp I reconhece e leva à quebra do fragmento em duas partes, uma de 125pb e outra de 157pb. Indivíduos heterozigotos para o polimorfismo apresentam três fragmentos (282, 157 e 125pb) e homozigotos possuem os dois fragmentos (157 e 125pb).

O produto da digestão foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida a 6%, seguido de coloração pela prata. O padrão de peso molecular "1Kb Plus" (Gibco®) foi utilizado como referência nas eletroforeses. Os fragmentos com menos de 100pb não são visualizados no gel corado.

Para as variáveis contínuas foram calculados os valores de média e desvio-padrão. As variáveis discretas estão apresentadas como frequências absolutas e relativas. As frequências encontradas foram comparadas com as frequências descritas no estudo de Framingham³ utilizando-se o teste de χ² no programa Prism 3.0.

Resultados

As características clínicas e metabólicas das pacientes avaliadas no presente estudo estão apresentadas na Tabela 1. As participantes apresentavam um bom controle do perfil lipídico, função renal preservada e não eram obesas, dados que confirmam a homogeneidade do grupo. A Figura 1 ilustra os resultados obtidos para identificação do polimorfismo no gene da glicoproteína IIIa (Plª), através da técnica de PCR-RFLP, em participantes deste estudo. Os resultados das frequências absolutas e relativas do polimorfismo para a GPIIIa obtidos neste estudo estão relacionados na Tabela 2.

As frequências descritas no estudo de Framingham para o polimorfismo Pl^A2 são: 71,5% para ^A1A1; 26,0 % para ^A1A2 e 2,5% para ^A2A2.³ Não foi encontrada diferença significativa entre as frequências deste estudo com as referenciadas.

Discussão

Indivíduos diabéticos apresentam o mesmo risco cardíaco de indivíduos não diabéticos que já sofreram um evento cardiovascular.¹³ Mulheres diabéticas apresentam um risco cardíaco semelhante ao de homens diabéticos, perdendo o efeito protetivo relacionado ao sexo feminino.¹¹ Dessa forma, é de grande interesse conhecer marcadores moleculares de pacientes diabéticos para melhor avaliar os fatores que contribuem para as complicações macrovasculares decorrentes da evolução natural da doença e também para estabelecer tratamentos diferenciados.

A glicoproteína GPIIbIIIa da superfície de plaquetas é um receptor de membrana para o fibrinogênio e fator de von Willebrand e tem um papel importante na agregação plaquetária. A presença do alelo A2 na GPIIIa está associada com um aumento do risco para doença cardiovascular.⁵

A frequência observada do polimorfismo Pl^A2, no presente estudo, para as pacientes diabéticas não difere da frequência descrita para pacientes diabéticos de um modo geral e para a população não-diabética.^3,14 Dessa forma, o presente estudo vem corroborar com outros que não observam associação entre a presença do alelo A2 e diabetes mellitus tipo 2, apesar da limitação do tamanho do grupo estudado. Por outro lado, cabe ressaltar que o presente estudo avaliou um grupo mais restrito quanto ao gênero, homogêneo e com um risco aumentado para doenças coronarianas (mulheres com diabetes tipo 2, não tabagistas, sem terapia de reposição hormonal e sem evento isquêmico prévio).

Outros estudos já relataram que não há associação entre o polimorfismo da GPIIIa e a progressão das lesões macrovasculares no diabetes mellitus tipo 2.^15,16 Porém, estudos complementares são necessários para confirmar ou refutar essa evidência.

A partir dos resultados obtidos neste estudo pode-se concluir que a frequência do polimorfismo Pl^A2 em mulheres com diabetes mellitus tipo 2 é a mesma observada na população em geral.

Recebido: 29/07/2008

Aceito: 25/08/2008

Suporte Financeiro: CNPq, Fapemig

Avaliação: Editor e dois revisores externos

Conflito de interesse: não declarado

Depto. de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) – Belo Horizonte-MG

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Mar 2009
• Data do Fascículo
  Fev 2009

Histórico

• Aceito
  25 Ago 2008
• Recebido
  29 Jul 2008