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Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia

Print version ISSN 1516-8484

Rev. Bras. Hematol. Hemoter. vol.32 no.1 São Paulo Feb. 2010  Epub Mar 19, 2010

http://dx.doi.org/10.1590/S1516-84842010005000005 

Características fenotípicas dos pacientes com anemia falciforme de acordo com os haplótipos do gene da βS-globina em Fortaleza, Ceará

 

Phenotypic characteristics of patients with sickle cell anemia related to βS-Globin gene haplotypes in Fortaleza, Ceara

 

 

Lilianne B. SilvaI; Romélia P. GonçalvesII

IUniversidade Federal do Ceará Fortaleza-CE Farmacêutica bioquímica
IIUniversidade Federal do Ceará Fortaleza-CE Farmacêutica. Professora associada da Universidade Federal do Ceará - Fortaleza-CE

Correspondência

 

 


RESUMO

Foram analisados 47 pacientes com diagnóstico clínico, laboratorial e molecular de anemia falciforme, residentes em Fortaleza, Ceará, com a finalidade de fornecer informações sobre a influência dos haplótipos do gene da βS- globina nas características fenotípicas desta doença. A determinação dos valores hematológicos foi realizada em contador automático de células sanguíneas, e os níveis de HbF foram determinados pela técnica da desnaturação alcalina. O DNA foi isolado de leucócitos, a partir de amostras de sangue total. A análise dos haplótipos da mutação βS foi realizada por PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Lenght Polymorphism), sendo analisados seis sítios polimórficos de restrição. Os pacientes foram divididos em cinco grupos, de acordo com o tipo de haplótipo: Bantu/Bantu, Benin/Benin, Bantu/Benin, Bantu/Atípico e Benin/Atípico. O nível de significância considerado nas análises foi p<0,05. Na comparação entre os haplótipos e as características hematológicas estudadas, apenas os valores de HbF e Ht apresentaram diferença estatisticamente significativa. Os níveis de HbF foram maiores no haplótipo Benin, seguido do haplótipo Bantu, o que está em conformidade com os dados da literatura. Foram demonstrados maior presença de crises vaso-oclusivas e episódios de pneumonia no haplótipo Benin/Atípico do que no haplótipo Bantu/Atípico; e maior presença de crises de infecção urinária no haplótipo Benin/Atípico do que no haplótipo Benin/Benin. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os haplótipos Bantu/Bantu e Benin/Benin em relação às complicações clínicas; entretanto, foi observado que o haplótipo Bantu/Bantu tem uma maior frequência em todos os eventos clínicos estudados quando comparado ao Benin/Benin. Os resultados demonstram que o tipo de haplótipo do gene da βS-globina influencia as características fenotípicas dos pacientes com anemia falciforme, portanto a utilização de técnicas moleculares para a detecção do haplótipo envolvido deve ser considerada como uma importante ferramenta diagnóstica para prever o quadro clínico destes pacientes. Rev. Bras. Hematol. Hemoter.

Palavras-chave: Anemia falciforme; fenótipo; prognóstico; genética.


ABSTRACT

We analyzed 47 patients living in Fortaleza, Ceará with clinical, laboratory and molecular diagnosis of sickle cell anemia, in order to provide information on the influence of the βS-globin gene haplotypes on the phenotypic characteristics of this disease. The evaluation of hematological values was performed using an automated blood cell counter and the levels of HbF were determined by the alkali denaturation technique. The DNA was isolated from leukocytes from a whole blood sample. The analysis of the haplotypes of the βS mutation was achieved by PCR-RFLP, with an assessment of six polymorphic restriction sites. The patients were divided in 5 groups according to the type of haplotype: Bantu/Bantu, Benin/Benin, Bantu/Benin, Bantu/Atypical and Benin/Atypical. The level of significance was set for a p-value < 0.05. In the comparison between the haplotypes and the hematological characteristics, statistically significant differences were seen only for the values of HbF and Ht. The levels of HbF were higher for the Benin haplotype, followed by the Bantu haplotype, which is in agreement with the literature. There were more painful episodes and pneumonia in Benin/Atypical haplotype than in Bantu/Atypical patients, and a higher rate of urinary tract infection in Benin/Atypical haplotype than in Benin/Benin haplotype individuals. There was no statistically significant difference between the Bantu/Bantu and Benin/Benin haplotypes in respect to clinical complications however the Bantu/Bantu haplotype was associated to a higher frequency in all studied clinical events when compared to Benin/Benin haplotype patients. The results show that the type of βS-globin gene haplotype influences the phenotypic characteristics of patients with sickle cell anemia, therefore molecular techniques should be considered to identify the haplotype as an important diagnostic tool to predict the clinical status of these patients. Rev. Bras. Hematol. Hemoter.

Key words: Anemia; sickle cell; phenotype; prognosis; genetica.


 

 

Introdução

A anemia falciforme é o resultado de uma mutação pontual (GAGGTG) no códon do gene da globina β, conduzindo a uma substituição de ácido glutâmico por valina na sexta posição da cadeia polipeptídica.1 É caracterizada pela homozigose da hemoglobina S (SS).2

O tipo de variabilidade mais comum no complexo gênico da globina beta é aquele produzido por variações de sequências que alteram o sítio de reconhecimento de uma enzima de restrição. Usando uma série de enzimas de restrição que identificam alterações específicas no DNA, é possível identificar a constituição das regiões adjacentes ao lócus beta. Através da técnica da reação em cadeia mediada pela polimerase para polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição (PCR- RFLP) é possível determinar o padrão de combinação dos sítios polimórficos para qualquer cromossomo, sendo este chamado de haplótipo.3

O tipo de haplótipo associado ao gene da HbS têm importância na gravidade clínica da anemia falciforme, estando relacionado a um quadro clínico e níveis de HbF variados.4,5,6 O haplótipo Senegal está associado a níveis elevados de HbF (> 15%) e curso clínico menos grave da doença; o Benin, a níveis medianos de HbF (5% a 15%) e curso clínico intermediário; o Bantu ou República Centro Africana, a níveis diminuídos de HbF (<5%) e quadro clínico mais grave; e o haplótipo Árabe-Indiano, que apresenta níveis elevados de HbF e curso clínico heterogêneo.7,8

Os haplótipos da anemia falciforme são classificados em cinco tipos diferentes, de acordo com a origem étnica e geográfica onde predominam. O haplótipo Benin (BEN) tem sido associado à África Ocidental; o Bantu ou República Centro Africana (CAR) à África Oriental e Centro-Sul; o Senegal à África Atlântico-Ocidental; o Árabe-Indiano à Índia e Península Arábica e o Camarões à Costa Ocidental Africana.1,7,9

A maioria dos cromossomos com o gene βS tem um dos cinco haplótipos comuns, contudo existe uma minoria de cromossomos, aproximadamente 5%, que estão associados com haplótipos menos comuns, geralmente designados como haplótipos atípicos.10 Segundo Zago et al.,11 os haplótipos atípicos são produzidos por diversos mecanismos genéticos, sendo a recombinação entre dois haplótipos βS típicos o mais comum.

O presente estudo teve como objetivo analisar a influência dos haplótipos do gene da βS-globina nas características fenotípicas da anemia falciforme.

 

Casuística e Método

Trata-se de um estudo corte transversal em 47 pacientes com diagnóstico clínico, laboratorial e molecular de anemia falciforme (forma homozigótica SS), atendidos no ambulatório do serviço de Hematologia de um hospital de referência em Fortaleza, capital do Ceará, todos voluntários, de ambos os sexos. Foram excluídos do estudo os pacientes que receberam transfusão sanguínea nos últimos três meses antes da coleta e os que faziam uso de hidroxiureia ou qualquer medicação que estimule a síntese de hemoglobina fetal. O consentimento informado foi obtido de todos os indivíduos e o estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Ceará.

A determinação dos valores hematológicos foi realizada em contador automático de células sanguíneas (modelo Sysmex KX-21N, Roche). A determinação da concentração de hemoglobina fetal foi realizada pelo método de desnaturação alcalina.12

O DNA foi isolado de leucócitos, a partir de amostras de sangue total, seguindo o protocolo de Sambrook et al.13 A análise dos haplótipos da mutação bS foi realizada por meio da técnica da reação em cadeia mediada pela polimerase para polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição (PCR-RFLP), sendo analisados seis sítios polimórficos de restrição, seguindo a metodologia de Sutton et al. 14: 1. XmnI 5'γG, 2. Hind III γG, 3. Hind III γª, 4. Hinc IIψβ , 5. Hinc II 3'ψβ, 6. Hinf I 5'β.

Os pacientes foram divididos em cinco grupos, de acordo com o tipo de haplótipo: Bantu/Bantu, Benin/Benin, Bantu/Benin, Bantu/Atípico e Benin/Atípico.

Análise estatística

O GraphPad Prism (versão 5.0) foi o programa utilizado para a realização da análise estatística. O teste utilizado para avaliação da distribuição normal das variáveis contínuas foi o Kolmogorov-Smirnov. O teste Anova foi utilizado para a comparação múltipla de médias entre os haplótipos e os valores de HbF, He, Hb, Ht, leucócitos e plaquetas; e o pós-teste Newman-Keuls para identificar quais grupos foram diferentes. O teste exato de Fisher foi utilizado na comparação de proporções entre os haplótipos e as complicações clínicas dos pacientes. O nível de significância estatística considerado na análise foi p < 0.05.

 

Resultados

Os valores hematológicos de todos os pacientes do estudo estão representados na Tabela 1. Apenas a concentração de HbF não apresentou distribuição normal em seus valores.

 

 

A comparação múltipla de médias entre os cinco haplótipos apresentou diferença estatisticamente significativa apenas para os valores de HbF (p=0,0018) e Ht (p=0,0298). Após a utilização do pós-teste estatístico foi observada diferença em relação à HbF entre os grupos Bantu/Bantu (6,14 ± 3,46) x Bantu/Atípico (10,88 ± 2,78) (p<0,05), Benin/ Benin (8,56 ± 1,93) x Benin/Atípico (1,43 ± 1,17) (p<0,05), Bantu/Benin (6,47 ± 3,59) x Bantu/Atípico (10,88 ± 2,78) (p<0,05) e Bantu/Atípico (10,88 ± 2,78) x Benin/Atípico (1,43 ± 1,17) (p<0,01). Em relação ao Ht foi observada diferença entre os grupos Bantu/Bantu (25,98 ± 2,86) x Bantu/Benin (22,54 ± 3,19) (p<0,05) (Tabela 2 e Gráfico 1).

 

 

Os pacientes com o haplótipo Bantu/Atípico obtiveram menor presença de crises vaso-oclusivas e episódios de pneumonia quando comparados aos pacientes com o haplótipo Benin/Atípico. Crises de infecção urinária foram mais frequentes nos pacientes com o haplótipo Benin/Atípico do que nos pacientes com o haplótipo Benin/Benin. Todas as outras comparações entre os haplótipos e a presença de complicações clínicas não obtiveram diferença estatisticamente significativa (Tabela 3).

 

 

Discussão

Em relação aos valores hematológicos dos pacientes estudados, apenas a concentração de HbF não apresentou distribuição normal em seus valores, mostrando que não há uma distribuição simétrica nos resultados. A média da concentração de hemoglobina fetal no presente estudo foi de 6,72 ± 3,73 (Tabela 1). Os resultados foram semelhantes aos demais estudos da literatura. A concentração média de HbF encontrada por Queiroz15 foi de 6,45%; Figueiredo et al.16 encontraram uma HbF de 6,35%; Galiza Neto et al. 17 valores de HbF de 7,61; e Gonçalves1 valores de 8,25%.

Na comparação entre os haplótipos e as características hematológicas estudadas, apenas os valores de HbF e Ht apresentaram diferença estatisticamente significativa. (Tabela 2).

A concentração de HbF fetal é descrita como haplótipo dependente e diretamente correlacionada ao curso clínico da doença.18,19,20 Os níveis de HbF no haplótipo Bantu/Atípico (10,88 ± 2,78) foram superiores aos níveis dos haplótipos Bantu/Bantu (6,14 ± 3,46), Bantu/Benin (6,47 ± 3,59) e Benin/Atípico (1,43 ± 1,17); e o haplótipo Benin/Benin (8,56 ± 1,93) apresentou níveis superiores em relação ao haplótipo Benin/Atípico (1,43 ± 1,17). Esses resultados estão de acordo com os dados da literatura, que relata maiores níveis de hemoglobina fetal associados ao haplótipo Benin seguido do haplótipo Bantu.7,8

Os haplótipos atípicos foram encontrados associados aos haplótipos Bantu e Benin, indicando a ocorrência de diversos mecanismos genéticos que poderiam ser responsáveis pela variação das concentrações de HbF entre os portadores do haplótipo atípico, o que é demonstrado quando comparados os níveis de HbF dos haplótipos Bantu/Bantu (6,14 ± 3,46), Bantu/Atípico (10,88 ± 2,78); e haplótipos Benin/Benin (8,56 ± 1,93) e Benin/Atípico (1,43 ± 1,17).1,10,11,21

Em relação ao Ht, o haplótipo Bantu/Bantu (25,98 ± 2,86) apresentou níveis superiores ao haplótipo Bantu/Benin (22,54 ± 3,19), o que corresponde com os resultados encontrados por Galiza Neto et al.17 Resultados diferentes foram encontrados por Fleury22 e Gonçalves et al.1 A correlação entre os níveis de Ht e os haplótipos não tem sido foco de muitas pesquisas, pois não há relatos na literatura que evidenciem a influência dos haplótipos no volume globular das hemácias.

Estudos anteriores sugerem que o haplótipo Bantu está associado a uma maior incidência de complicações clínicas do que o haplótipo Benin .1,7,8,23,24 Em nosso estudo houve diferença estatisticamente significativa apenas entre os haplótipos Bantu/Atípico e Benin/Atípico em relação à presença de crises vaso-oclusivas e episódios de pneumonia; e entre Benin/Atípico e Benin/Benin em relação às crises de infecção urinária (Tabela 3). Foi demonstrada maior presença de crises vaso-oclusivas e episódios de pneumonia no haplótipo Benin/Atípico do que no haplótipo Bantu/Atípico; e maior presença de crises de infecção urinária no haplótipo Benin/Atípico do que no haplótipo Benin/Benin. Os haplótipos atípicos em heterozigose com os haplótipos Bantu e Benin podem ser responsáveis pela variação na presença das complicações clínicas do nosso estudo em relação aos dados da literatura. 1,10,11,21

Não houve diferença estatisticamente significativa entre os haplótipos Bantu/Bantu e Benin/Benin em relação às complicações clínicas, entretanto foi observado que o haplótipo Bantu/Bantu tem uma maior frequência em todos os eventos clínicos estudados quando comparado ao Benin/Benin. Foi encontrado um pequeno número de pacientes com o haplótipo Benin/Benin no estudo, o que pode ter levado a resultados sem diferença significativa na comparação de proporções entre estes grupos.

Os resultados demonstram que o tipo de haplótipo do gene da βS- globina influencia as características fenotípicas dos pacientes com anemia falciforme, portanto a utilização de técnicas moleculares para a detecção do haplótipo envolvido deve ser considerada como uma importante ferramenta diagnóstica para prever o quadro clínico destes pacientes.

 

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Correspondência:
Lilianne Brito da Silva
Rua Dr. José Lourenço, 1820 Apto.502 - Aldeota
60115-281- Fortaleza-CE - Brasil
E-mail: liliannebrito@hotmail.com

Recebido:27/04/2009
Aceito após modificações: 05/07/2009

 

 

Avaliação: Editor e dois revisores externos
Conflito de interesse: sem conflito de interesse

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