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Seleção de bacillus spp. para produção de esterases e melhoramento de bacillus cereus (c124)

Selection of bacillus spp. For esterase production and genetic improvement of bacillus cereus (c124)

Resumo

Forty-four Bacillus spp. strains obtained from sugar cane derivates and residues, six of them isolated in this work, were tested using Tween 80 as substrate (agar-Tween 80 medium), in order to determine their esterase activity through the enzymatic index averages. After statistic analysis, B. cereus (C124) strain, which presented better results, was submitted to genetic improvement by treatment with ultraviolet light (UV). The survival curve pointed out 28" as the time necessary to obtain 30% of survivors. Fifty survivors and the wild strain C124 were compared in relation to their esterase activity as mentioned previously. The wild strain and the mutant C124UV35, which showed enzymatic index average higher than C124, were characterized in polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE). Eletrophoretic patterns for total proteins of wild and mutant strain showed different profiles according to number, position and intensity of bands. For esterase, the bands varied only in intensity.

Bacteria; genetic improvement; Bacillus spp.; B. cereus; esterase


Bacteria; genetic improvement; Bacillus spp.; B. cereus; esterase

Seleção de bacillus spp. para produção de esterases e melhoramento de bacillus cereus (c124)

Selection of bacillus spp. For esterase production and genetic improvement of bacillus cereus (c124)

Analucia Longman MendonçaI* * Autor para correspondência ; Rosa de Lima Ramos MarianoII; Janete Magali de AraújoIII; Uided Maaze T. CavalcanteII

IITEP, Depto. de Química e Biotecnologia, Cidade Universitária, 50740-540, Recife, PE

IIUFRPE, Depto. de Agronomia, Fitossanidade, Dois Irmãos, 52171-900, Recife, PE

IIIUFPE, Depto. De Antibióticos, Cidade Universitária, 50670-901, Recife, PE

ABSTRACT

Forty-four Bacillus spp. strains obtained from sugar cane derivates and residues, six of them isolated in this work, were tested using Tween 80 as substrate (agar-Tween 80 medium), in order to determine their esterase activity through the enzymatic index averages. After statistic analysis, B. cereus (C124) strain, which presented better results, was submitted to genetic improvement by treatment with ultraviolet light (UV). The survival curve pointed out 28" as the time necessary to obtain 30% of survivors. Fifty survivors and the wild strain C124 were compared in relation to their esterase activity as mentioned previously. The wild strain and the mutant C124UV35, which showed enzymatic index average higher than C124, were characterized in polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE). Eletrophoretic patterns for total proteins of wild and mutant strain showed different profiles according to number, position and intensity of bands. For esterase, the bands varied only in intensity.

Key words: Bacteria, genetic improvement, Bacillus spp., B. cereus, esterase.

INTRODUÇÃO

As esterases catalisam a hidrólise de um grande número de esteres alifáticos e aromáticos e a ação destas enzimas é geralmente restrita a esteres de ácidos graxos de cadeias curtas. Estas enzimas são amplamente distribuídas nos organismos vivos, como em tecidos de vertebrados, insetos, plantas, frutas cítricas, micobacterias, fungos, e em mamíferos. As esterases vêm sendo estudadas pelo seupotencial em desenvolver aroma emalimentos e na maturação de certos queijos, e, algumas esterases como a lidocaína, procaína e fenacetina possuem importância farmacológica. As esterases podem ser obtidas de microrganismos como Pseudomonas, Bacillus, Brevibacterium, Lactobacillus, Rhodoccoccus, Aspergillus, Geotrichum, etc. (KRISCH, 1971; MATSUNAGA et al., 1974; McKAY, 1993; LAMBRECHTS et al., 1995 ).

Segundo CHRISTOV & PRIOR (1993), as esterases produzidas por microrganismos, inclusive Bacillus subtilis, estão envolvidas na degradação de xilana, com potencial de aplicação na nutrição animal, na indústria de polpa e papel, na síntese de derivados de carboidratos e, quando combinadas com xilanases e celulases, podem também ser aplicadas na bioconversão dos resíduos lignocelulolíticos na fermentação de açúcares produzindo uma variedade de combustíveis e produtos químicos.

O desenvolvimento de mutantes para produção de enzimas comerciais constitui uma importante estratégia, que conduz freqüentemente a um rendimento muito maior que o das linhagens selvagens. Através da engenharia genética foi desenvolvida a primeira enzima lipolítica, a Lipolase, produzida em escala industrial desde 1988, para a indústria de detergentes (UNDERKOFLER, 1976; AUNSTRUP, 1979; GALZY, 1985; NOVO NORDISK, 1992).

MENDONÇA et al. (1996) realizaram pesquisa com quarenta e quatro linhagens de Bacillus spp., avaliando a produção de proteases, enzimas muito utilizadas na indústria de detergentes. Estas mesmas linhagens foram testadas no presente trabalho quanto à produção de esterases, visando a obtenção de uma linhagem produtora de proteases e esterases. Assim, os objetivos do presente trabalho foram isolamento e caracterização semiquantitativa de linhagens de Bacillus spp. quanto à produção de esterases; obtenção e seleção de mutantes com maior produção de esterases e comparação dos padrões eletroforéticos para proteínas totais e esterases da linhagem selvagem e do mutante selecionado.

MATERIAL E MÉTODOS

Linhagens utilizadas. Foram utilizadas quarenta e quatro linhagens selvagens de Bacillus spp. (Tabela I) isoladas e identificadas como descrito por MENDONÇA et al. (1996).

Caracterização semiquantitativa de Bacillus spp. quanto à produção de esterases. Para a caracterização semiquantitativa das linhagens de Bacillus spp. quanto à produção de esterases foi utilizado o método de difusão em ágar com modificações e a atividade esterásica foi testada utilizando Tween 80 como substrato (meio ágar-Tween 80) (SIERRA, 1957; MENDONÇA et al., 1996). O índice enzimático foi estimado medindo-se os dois diâmetros perpendiculares dos halos de degradação e da média computada, subtraindo-se o diâmetro do crescimento bacteriano. O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente ao acaso com quarenta e quatro tratamentos e seis repetições. Os dados foram submetidos a análise de variância e teste de Tukey para comparação das médias.

Melhoramento genético de Bacillus cereus (C 124) . Inicialmente foi realizada a curva de crescimento da linhagem selvagem deB. cereus(C 124), selecionada entre as melhores produtoras de esterases, para se determinar o número de células viáveis na suspensão a ser utilizada na irradiação com UV (KIRÁLI et al., 1974). Para obtenção da curva de sobrevivência foi utilizada a metodologia de AZEVEDO & COSTA (1973). De acordo com os dados obtidos através da curva de sobrevivência da linhagem C124, esta cultura foi submetida à radiação UV por 28" que corresponde a uma sobrevivência de 30 %. Dentre os sobreviventes foram escolhidas ao acaso, cinquenta colônias que foram testadas quanto à produção de esterases em comparação com a linhagem selvagem, conforme descrito por MENDONÇA et al. (1996). Os resultados foram analisados estatisticamente como no ítem anterior. Para verificação de auxotrofia do mutante selecionado, a linhagem C124 e o mutante selecionado foram cultivados por 24 h em meio AN e transferidos para placas de Petri com meio mínimo de Davies e para meio completo AN, utilizado como controle, sendo incubados por 24 h a ± 28ºC.

Determinação dos padrões eletroforéticos em gel de poliacrilamida (PAGE). A determinação dos padrões eletroforéticos em gel de poliacrilamida (PAGE) para proteínas totais e esterases da linhagem selvagem C124 e do mutante selecionado C124UV35 foi realizada segundo PACCOLA-MEIRELLES et al. (1988). Na corrida para proteínas totais foi utilizado dodecil sulfato de sódio (SDS). As determinações quantitativas de proteínas nos extratos celulares de cada amostra foram realizadas de acordo com LOWRY et al. (1951) e a concentração utilizada foi de 75 μg/ml.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Caracterização semiquantitativa das linhagens selvagens de Bacillus spp. quanto à produção de esterases. Os resultados de atividade esterásica, expressos na forma de índice enzimático, mostram que as linhagens Bacillus sp. (C117) e B. cereus (C124) apresentaram os maiores índices, 1,07 e 0,93 cm, respectivamente (Tabela II). C124 não diferiu estatísticamente de 14 linhagens, as quais também não diferiram das linhagens restantes que apresentaram atividade enzimática positiva entre 0,70 e 0,84 cm.

Com relação a frequência do número de linhagens observou-se que 15, 6, 20 e 3 linhagens apresentaram, respectivamente, dimensão do halo de degradação em classes variando de 0,0 a 070; 0,71 a 0,80; 0,81 a 0,90 e 0,91 a 1,10 cm (Figura I).


Quanto ao método utilizado, os resultados obtidos neste trabalho encontram apoio na literatura, com o relato da utilização de meios sólidos para verificação da atividade enzimática em microrganismos, com resultados positivos. MONTENECOURT & EVELEIGH (1977) utilizaram o teste semiquantitativo por difusão para determinação da produção de celulase por Trichoderma viride Pers. : Fr . . DICKMAN & PATIL (1986) também usaram o método de difusão, e obtiveram resposta rápida e eficiente para produção de cutinase por fungos fitopatogênicos. Este método também foi usado por WILLIAMS et al. (1990) para seleção de microrganismos produtores de proteases, capazes de quebrar as pontes disulfídricas de queratina, visando a obtenção de um método alternativo para o aproveitamento das penas em criadouros de aves, através da biodegradação das mesmas por microrganismos com atividade queratinolítica. MENDONÇA et al. (1996), testaram as mesmas 44 linhagens quanto a produção de proteases pelo teste semiquantitativo em meios sólidos, observando que Bacillus cereus (C124) apresentou o melhor desempenho em meio ágar - hemoglobina.

As esterases são importantes enzimas estudadas tanto no campo científico, como nas aplicações industriais em alimentos, papel e outras (CHISTOV & PRIOR, 1993). A escolha do substrato para a determinação das atividades esterásicas foi direcionada para Tween 80, pois o uso dos Tweens é indicado para o estudo da especificidade das esterases que hidrolizam esteres de ácidos graxos de cadeias curtas, as lipases (enzimas cuja função biológica é catalisar a hidrólise de triacilgliceróis de cadeia longa) e as esterases produzidas por microrganismos podem ser obtidas isoladas ou associadas, e o conceito de ativação interfacial, característico da maioria das lipases, não é suficiente para distinguir entre lipases e esterases, sugerindo a possibilidade da produção de lipases pelos Bacillus testados. (KOUKER & JAEGER, 1987; LAMBRECHTS et al., 1995). Diante destes resultados, foi constatada a eficiência da linhagem B. cereus (C124) na produção de esterases.

Melhoramento genético de Bacillus cereus (C124). Os índices enzimáticos observados durante a caracterização semiquantitativa de esterases em meio sólido, mostraram o bom desempenho da linhagem B. cereus (C124), a qual foi conseqüentemente, selecionada para o melhoramento genético. De acordo com a curva de crescimento de C124, foi constatado que 65 % de transmitância correspondeu a uma concentração de células da ordem de 107 ufc/ml. Após a realização da curva de sobrevivência de C124 e através da equação obtida por regressão linear: [Y = 107,84 - 2,795 X (R2 = 0,951 = 95,10%)], ficou estabelecido o tempo de 28 '' para DL70 (dose letal), visando posterior obtenção de mutantes melhorados desta linhagem. Segundo AZEVEDO (1985), quando se trabalha com produção, deve-se obter mutantes com sobrevivência acima de 10 %, o que está em concordância com o tempo de exposição escolhido. A análise morfológica dos sobreviventes obtidos mostrou características fenotípicas similares, sendo selecionadas ao acaso cinquenta colônias, as quais foram caracterizadas semiquantitativamente quanto à produção de esterases, através das médias dos índices enzimáticos, no meio de cultura utilizado anteriormente. O resultado da análise de variância mostrou que houve diferença estatística significativa entre as médias dos índices enzimáticos dos sobreviventes e a da linhagem selvagem B.cereus (C124). As comparações das médias dos índices enzimáticos de C124 e dos sobreviventes (C124UV1 a C124UV50) encontram-se na Tabela III.

A análise da Tabela III mostra que o mutante C124UV35 apresentou índice enzimático superior em 47 % ao selvagem B. cereus (C124), enquanto que os mutantes C124UV12 e C124UV11 apresentaram também índices enzimáticos superiores a linhagem selvagem em 43 % e 42 %, respectivamente. A obtenção de um mutante, segundo GALZY (1985), só era possível se uma seleção permitisse colocá-lo em evidência.

A utilização de UV como indutor de mutação encontra apoio na literatura como na indução de mutantes produtores de amilase em Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn por meio de diferentes radiações, entre elas UV, realizada por MEYRATH et al. (1971). MONTENECOURT & EVELEIGH (1977) usaram o mesmo teste para selecionar mutantes de Trichoderma viridae a fim de obter maior produção de celulase. Os mutantes também foram obtidos após radiação UV, porém com taxa de sobrevivência de 0,1 %, apresentando halos duas a três vezes maiores que os parentais. MENDONÇA et al. (1996) também apresentaram resultados utilizando UV para indução de mutação, quando compararam a linhagem selvagem B. cereus (C124) com mutantes quanto a produção de proteases. O mutante C124UV35 mostrou índice enzimático superior em 50 % ao selvagem no meio ágar-hemoglobina.

A partir dos resultados obtidos, o mutante C124UV35 foi selecionado por apresentar índice enzimático maior que o da linhagem selvagem B. cereus (C124), procedendo-se a verificação de auxotrofia. Foi observado o crescimento tanto no meio completo AN quanto no meio mínimo, e portanto o mutante selecionado não foi considerado auxotrófico. A indução de mutação foi realizada para a obtenção de mutantes quanto à produção de esterases, considerando uma sobrevivência de 30 % (AZEVEDO, 1985), obtida após a irradiação com UV.

Caracterização eletroforética de Bacillus cereus (C124) e mutante selecionado. Foram comparados os perfis de bandas de proteínas totais e de esterases para melhor caracterizar a linhagem selvagem C124 e o mutante C124UV35. As Figuras II e IV mostram o padrão eletroforético de proteínas totais e esterases, respectivamente, e a Figura III apresenta o zimograma dos perfis de proteínas totais (Fig. II) com os valores de Rf correspondentes a algumas bandas de C124 e do mutante selecionado.



A análise do perfil eletroforético para proteínas totais (Figuras II e III) mostrou diferenças entre a linhagem selvagem e o mutante. Nas variações observadas, notou-se a banda de Rf 0,18, presente no mutante e ausente na selvagem. Nas bandas com Rf 0,28 e 0,30 ocorreram diferenças quanto ao aumento da intensidade, apresentado pela linhagem C124UV35, e ausência da banda Rf 0,28 na linhagem selvagem. A banda com Rf 0,41 só foi observada na linhagem selvagem, enquanto que a Rf 0,42 aparece na selvagem e com maior intensidade para o mutante. A banda com Rf 0,51 surgiu somente no mutante C124UV35, porém as de Rf 0,52 e 0,57 foram comuns às duas linhagens, apresentando maior densidade na linhagem selvagem. No entanto, a grande maioria das bandas mostraram padrões similares para as duas linhagens analisadas.

Na análise do padrão eletroforético para esterases (Figura IV), a linhagem selvagem apresentou banda mais densa do que o mutante, o que não implica em variabilidade genética. O uso da eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para proteínas solúveis em água tem se constituído num instrumento valioso para caracterização e identificação de microrganismos. Segundo SMIBERT & KRIEG (1994), linhagens de uma mesma espécie podem apresentar padrões de proteínas similares que, entretanto, não são necessariamente iguais. Segundo PACCOLA-MEIRELLES et al. (1988), a técnica da eletroforese constitui o melhor instrumento para estudos de variação genética, possibilitando a detecção de diferenças através dos padrões das bandas. As diferenças apresentadas indicam a ocorrência de mutação para uma maior atividade esterásica, apesar dos padrões eletroforéticos mostrarem similaridade entre a linhagem mutante e a selvagem.

AGRADECIMENTOS

A equipe de trabalho agradece o apoio recebido do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Fundação Instituto Tecnológico do Estado de Pernambuco (ITEP) e do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).

Received: 11 August 1997;

Revised: 23 September 1997;

Accepted: 03 June 1998.

  • AUNSTRUP, K..  Production,  isolation    and   economics  of   extracellular   enzimes.  In:     WINGOARD, L.; KATCHALASKI-KATZIR,  E. ; GOLDSTEIN, L. Appl. Biochem. Bioeng.  New York: Academic Press, 1979. V. 2,  p. 27 - 69.
  • AZEVEDO, J. L.  Mutaçăo e  agentes  mutagęnicos. In: Genética  de microrganismos  em biotecnologia  e   engenharia   genética  Piracicaba :  Fundaçăo  de  Estudos Agrários Luiz de Queiroz, 1985. Cap. 12, p. 11-16.
  • AZEVEDO, J. L. De ; COSTA, S. O. P. Da.  Exercícios práticos de genética Săo Paulo :  Ed. Da  Universidade de  Săo Paulo/Companhia Editora Nacional, 1973.  P.154-161.
  • CHRISTOV, L. P. ; PRIOR, B. A.  Esterases of xylan - degrading microorganisms: Production, properties and significance. Enzyme  Microbiol. Technol,  v. 15,  June,  p. 460 - 475, 1993.
  • DICKMAN,  M.  B. ; PATIL,  S.  S.   A  rapid  and  sensitive  plate  assay  for  the  detection of  cutinase produced  by plant  pathogenic  fungi.  Phytopathol.,  St. Paul,  v.76,  n.5, p.473-475, 1986.
  • GALZY, P.   A engenharia genética.  In:  SCRIBAN, R.  Biotecnologia  Săo Paulo,  Manole, 1985. Cap. 1, parte IV, p. 281-288.
  • KIRÁLY,   Z. ;   KLEMENT,   Z. ;   SLYMOSY,  F. ;  VÖROS,   J.  Methods  in  plant   pathology  Amsterdam:  Elsevier  Scientific  Publishing ,  1974.  Cap. VI,  p.161-166.
  • KOUKER, G. ;  JAEGER, K. E.  Specific and sensitive plate assay for bacterial lipases. Appl. Environ. Microbiol.,  Jan.,  p.211 - 213, 1987.
  • KRISCH, K.  Carboxylic ester hydrolases. In: The enzymes New York: Academic Press, 1971. V. V, p. 43 - 69.
  • LAMBRECHTS, C.; ESCUDERO, J.; GALZY, P.  Purification and properties of three esterases from Brevibacterium sp.  R 312. J. Appl. Bacteriol.,  v. 78,  p. 180 - 188, 1995.
  • LOWRY,   O.  H.;  ROSEBROUGH,  N.  J.;  FARR,   A.  L. ;  RANDALL,  R. J.   Protein  measurement  with  the folin phenol  reagent. J. Biol. Chem.,  Bethesda, 195l,  v. 193, n. 1,  p. 265-275, 1951.
  • MATSUNAGA, A.; KOYAMA, N.; NOSOH, Y.  Purification and properties of esterase from Bacillus stearothermophilus Arch. Biochem. Biophys., v. 160, p. 504 - 513, 1974.
  • McKAY, A. M.  A review: Microbial carboxylic ester hydrolases (E.C. 3.1.1) in food technology. Lett. Appl. Microbiol., v. 16, p. 1 - 6, 1993.
  • MENDONÇA, A. L.; MARIANO, R. L. R.; ARAUJO, J. M. ; CAVALCANTE, U. M. T.  Bacillus sp. produtores de proteases: Isolamento, caracterizaçăo e melhoramento de B. cereus (C124). Arq. Biol. Tecnol. Curitiba, v. 39, p. 359-372, 1996.
  • MEYRATH, J.;  BAHN, M.;  HAN, H. E. ; ALTMANN, H.  Induction  of  amylase-producing   ;mutants in   Aspergillus   oryzae by different  irradiations.  Int.  At.  Energy  Agency, Vienna, v. 134,  n. 14,   p. 137-155, 1971.
  • MONTENECOURT,   B.  ;  EVELEIGH,  D.  E.  Semiquantitative  plate  assay   for  determination  of cellulase production by  Trichoderma  viride  Appl. Environ. Microbiol., Washington,   v. 33,  n. 1,  p. 178 - 183, 1977.
  • NOVO NORDISK   Enzimas - campos de aplicación Bioindustrial Group. Bagsvaerd, 1992. p. 2-48.
  • PACCOLA - MEIRELLES,   L.  D. ;   VALARINI,   M.   J. ;   AZEVEDO,  J.  L. ;  ALFENAS ,  A.  C.    Manual  de  técnicas  eletroforéticas  em  microrganismos  Piracicaba : Fundaçăo de  Estudos Agrários Luiz de Queiroz , 1988.  54 p.
  • SIERRA, G.   A simple method for the detection of  lipolytic activity of microrganisms and some observations on the influence of the contact between cells and fatty substrates. Antoine Van Leeuwenhoek Amsterdam,  v. 23,  p. 15-22, 1957.
  • SMIBERT,  R . M. ; KRIEG, N. R.  Phenotypic  characterization.  In:   Methods  for  general  and molecular bacteriology   Washington : American  Society of Microbiology, Washington, 1994. cap. 25.
  • UNDERKOFLER,  L.  A.   Microbial  enzymes.   In:   MILLER,  B.  M. ;   LITSKY,  W.    Industrial microbiology  New York:  Mc Graw-Hill,   1976.   cap. 7,  p. 128-164.
  • WILLIAMS,  C.  M.;    RICHTER,  C.  S.;   MacKENZIE  JR.,  J.  M. ;   SHIH,  J.  C.  H.   Isolation, identification  and  characterization  of  a  feather-degrading  bacterium. Appl. Environ. Microbiol. Washington,  v. 56,  n. 6, p. 1509 - 1515, 1990.
  • *
    Autor para correspondência
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      21 Set 2011
    • Data do Fascículo
      Jun 1998

    Histórico

    • Aceito
      03 Jun 1998
    • Revisado
      23 Set 1997
    • Recebido
      11 Ago 1997
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