Determinação do 1-hidroxipireno em amostras de urina por cromatografia líquida de alta eficiência - estudo dos parâmetros de validação

Determination of 1-hydroxypyrene in human urine by high-performance liquid chromatography - study of validation parameters

Resumos

Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) correspondem a um grupo de substâncias químicas formadas durante a decomposição térmica de materiais orgânicos e, então, liberadas no meio ambiente. Vários trabalhos têm relatado efeitos adversos produzidos pelos HAPs, sendo muito destes efeitos relacionados ao desenvolvimento de câncer. Segundo a International Agency for Research on Cancer (IARC), seis HAPs são provavelmente carcinogênicos para o homem. Considerando as propriedades toxicológicas e com o intuito de prevenir uma exposição ocupacional a estes compostos, a monitorização biológica por meio da determinação do 1-hidroxipireno urinário é, recomendada. Para tanto, foi necessário validar metodologia para a quantificação do analito proposto. Este trabalho teve como objetivo otimizar as condições de um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e detecção de fluorescência para a análise do 1-hidroxipireno urinário e, ainda, validar os parâmetros analíticos para a determinação deste analito em amostras de urina. O método inclui hidrólise enzimática (²-glicuronidase/arilsulfatase) com posterior extração em fase sólida - SPE (C18). A separação cromatográfica foi consumada com uma coluna LC-PAH (15 cm x 4,6 mmID x 5 µm), fluxo em fase gradiente (metanol 40 e 100%) e finalmente detecção seletiva (excitação - 242 nm e emissão - 388 nm). O método demonstrou ser linear (r² = 0,999) na faixa de concentração estudada (0,2 a 40,0 ng/mL). Os limites de detecção e quantificação foram 0,5 ng/mL e 1,0 ng/mL, respectivamente. Os resultados de precisão e exatidão foram adequados para a análise (CV < 15%) e a recuperação do analito manteve-se na faixa de 80 a 120%. Por fim, o método validado foi considerado adequado para a análise do 1-hidroxipireno urinário.

Análises toxicológicas; Hidrocarbonetos; Aromáticos Policíclicos (HAPs); 1-hidroxipireno

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) constitute a group of chemical substances formed during thermal degradation of organic materials released in the environment. At present, several hundreds of papers reporting adverse effects produced by PAHs are mainly related to cancer development. According to International Agency for Research on Cancer (IARC), six PAHs are probably human carcinogenic. Considering the toxicological properties and with the aim to prevent occupational exposures to these substances, a biological monitoring of urinary 1-hydroxypyrene is recommended. The first step to achieve this goal is to validate a methodology for urinary 1-OHP quantification. This work optimized the conditions of a high performance liquid chromatography system (HPLC) with fluorescence detection and validated the analytical parameters for urine 1-OHP determinations. The method includes an enzymatic hydrolysis (b-glucuronidase/arylsulfatase) followed by a solid phase extraction - SPE (C18). In addition a chromatographic separation was accomplished using a Supelcosil TM LC-PAH (15 cm x 4.6 mmID x 5 µm) with a gradient phase (methanol 40 and 100%) and finally a selective detection (excitation - 242 nm and emission - 388 nm). The method showed linearity (r² = 0.999) with the studied range of concentration (0.2 to 40.0 ng/mL). Detection and quantification limit were 0.5 ng/mL and 1.0 ng/mL, respectively. Relative standard deviation of the method was good (CV<15%), as also was the reproducibility (recovery maintained between 80 and 120%). In conclusion, this validated method can be considered useful for the urinary 1-OHP analyses.

Toxicological analyses; Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs); 1-Hydroxypyrene; Biological monitoring

TRABALHOS ORIGINAIS

Determinação do 1-hidroxipireno em amostras de urina por cromatografia líquida de alta eficiência - estudo dos parâmetros de validação

Determination of 1-hydroxypyrene in human urine by high-performance liquid chromatography - study of validation parameters

Patrícia Miranda de Faria^*; Henrique Vicente Della Rosa

Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo

RESUMO

Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) correspondem a um grupo de substâncias químicas formadas durante a decomposição térmica de materiais orgânicos e, então, liberadas no meio ambiente. Vários trabalhos têm relatado efeitos adversos produzidos pelos HAPs, sendo muito destes efeitos relacionados ao desenvolvimento de câncer. Segundo a International Agency for Research on Cancer (IARC), seis HAPs são provavelmente carcinogênicos para o homem. Considerando as propriedades toxicológicas e com o intuito de prevenir uma exposição ocupacional a estes compostos, a monitorização biológica por meio da determinação do 1-hidroxipireno urinário é, recomendada. Para tanto, foi necessário validar metodologia para a quantificação do analito proposto. Este trabalho teve como objetivo otimizar as condições de um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e detecção de fluorescência para a análise do 1-hidroxipireno urinário e, ainda, validar os parâmetros analíticos para a determinação deste analito em amostras de urina. O método inclui hidrólise enzimática (β-glicuronidase/arilsulfatase) com posterior extração em fase sólida - SPE (C₁₈). A separação cromatográfica foi consumada com uma coluna LC-PAH (15 cm x 4,6 mmID x 5 &#181;m), fluxo em fase gradiente (metanol 40 e 100%) e finalmente detecção seletiva (excitação - 242 nm e emissão - 388 nm). O método demonstrou ser linear (r² = 0,999) na faixa de concentração estudada (0,2 a 40,0 ng/mL). Os limites de detecção e quantificação foram 0,5 ng/mL e 1,0 ng/mL, respectivamente. Os resultados de precisão e exatidão foram adequados para a análise (CV < 15%) e a recuperação do analito manteve-se na faixa de 80 a 120%. Por fim, o método validado foi considerado adequado para a análise do 1-hidroxipireno urinário.

Unitermos:Análises toxicológicas. Hidrocarbonetos. Aromáticos Policíclicos (HAPs). 1-hidroxipireno.

ABSTRACT

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) constitute a group of chemical substances formed during thermal degradation of organic materials released in the environment. At present, several hundreds of papers reporting adverse effects produced by PAHs are mainly related to cancer development. According to International Agency for Research on Cancer (IARC), six PAHs are probably human carcinogenic. Considering the toxicological properties and with the aim to prevent occupational exposures to these substances, a biological monitoring of urinary 1-hydroxypyrene is recommended. The first step to achieve this goal is to validate a methodology for urinary 1-OHP quantification. This work optimized the conditions of a high performance liquid chromatography system (HPLC) with fluorescence detection and validated the analytical parameters for urine 1-OHP determinations. The method includes an enzymatic hydrolysis (b-glucuronidase/arylsulfatase) followed by a solid phase extraction - SPE (C₁₈). In addition a chromatographic separation was accomplished using a Supelcosil ^TM LC-PAH (15 cm x 4.6 mmID x 5 &#181;m) with a gradient phase (methanol 40 and 100%) and finally a selective detection (excitation - 242 nm and emission - 388 nm). The method showed linearity (r² = 0.999) with the studied range of concentration (0.2 to 40.0 ng/mL). Detection and quantification limit were 0.5 ng/mL and 1.0 ng/mL, respectively. Relative standard deviation of the method was good (CV<15%), as also was the reproducibility (recovery maintained between 80 and 120%). In conclusion, this validated method can be considered useful for the urinary 1-OHP analyses.

Uniterms:Toxicological analyses. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). 1-Hydroxypyrene. Biological monitoring.

INTRODUÇÃO

O termo Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HPAs) refere-se a uma classe de compostos orgânicos, que contém dois ou mais anéis aromáticos condensados, constituídos de átomos de carbono (C) e hidrogênio (H). À temperatura ambiente os HAPs são sólidos e as características gerais comuns a esta classe de compostos são: o alto ponto de fusão e ebulição, a baixa pressão de vapor e a pouca solubilidade em água, a qual tende a diminuir com o aumento da massa molecular. Os HAPs são solúveis em muitos solventes orgânicos, altamente lipofílicos e considerados quimicamente inertes (WHO, 1998).

Os HAPs podem ser formados a partir da decomposição térmica de materiais orgânicos, que contenham carbono e hidrogênio. A formação é baseada em dois grandes mecanismos: pirólise ou combustão incompleta e processos de carbonização. Os tipos de HAPs formados parecem depender mais das condições de combustão do que do tipo de material orgânico queimado. A quantidade de HAPs formada sob condições definidas de pirólise depende, no entanto, da temperatura de reação, bem como do material (Bjorseth, 1985).

Desde 1775, quando Sir Percival Pott relatou que limpadores de chaminé na Inglaterra, freqüentemente, desenvolviam alguns tipos de câncer, em particular o escrotal, ouve-se falar dos HAPs. Mais de 150 anos se passaram para que estes compostos fossem reconhecidos como agentes carcinogênicos (Grimmer, 1983; IARC, 1983, 1984, 1985; Bjorseth, 1985; Jongeneelen, 1997; WHO, 1998). Segundo a International Agency for Research on Cancer (IARC), seis HAPs são provavelmente carcinogênicos para o homem: benzo(a)antraceno, benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, benzo(a) pireno, dibenzo(a,h) antraceno e indeno(1,2,3-cd)pireno.

Não obstante o crescente estudo em torno do assunto, inexiste a padronização de procedimentos analíticos para a determinação dos HAPs. Além disto o número de HAPs relatados é desconhecido, fazendo o termo "HAPs Total" incerto. Assim, a fim de reduzir estas incertezas, muitas medidas e estudos são necessários para diversas fontes de emissão. A determinação destas substâncias pode ser realizada através da avaliação ambiental das misturas de HAPs e/ou de um único HAP envolvido. O pireno, um HAP não-carcinogênico, está presente em praticamente todas as misturas de HAPs em concentrações relativamente altas (de 2 a 10%) e constantes. Há informações de que esta substância está presente como o maior componente do conteúdo total dos HAPs encontrados no ambiente e, em vista de sua abundância, o seu produto de biotransformação, o 1-hidroxipireno (1-OHP), foi selecionado para avaliar a exposição a essas substâncias (IARC, 1983; Jongeneelen et al., 1985, 2001; Buchet et al., 1992; Bouchard et al., 1998; Dor et al., 2000).

A difusão destes compostos no ambiente, tanto ocupacional como geral, e a sua característica toxicológica (suspeita e evidência de carcinogenicidade) indicam a grande relevância do estudo do ponto de vista ambiental e biológico com a finalidade de prevenção e promoção da saúde dos trabalhadores. Para tanto, foi necessário validar metodologia específica e sensível para a quantificação precisa e exata do 1-hidroxipireno urinário, já preconizado pela American Conference of Governmental Industrial Hygienists (ACGIH) em 2003 como indicador biológico da exposição aos HAPs. A fim de atingir tal objetivo, este trabalho definiu o estudo dos parâmetros de validação como linearidade, limite de detecção, limite de quantificação, precisão inter e intradia, recuperação e exatidão.

MATERIAL E MÉTODOS

As amostras de urina destinadas à otimização dos parâmetros para a validação do método analítico para a determinação do 1-OHP foram preparadas a partir de um pool de urina, obtido de alunos de pós-graduação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. As amostras foram colhidas, homogeneizadas e adicionadas com solução padrão de 1-hidroxipireno em diferentes concentrações para o preparo da curva de calibração e estudo de linearidade, limite de detecção, limite de quantificação, precisão inter e intradia, recuperação e exatidão.

Neste trabalho foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência Hewlett Packard^® (HP), modelo 1100 Series, equipado com desgaseificador a vácuo (G1322A), bomba binária (G1312A), injetor automático (G1313A), compartimento de coluna com termostato (G1316A), detector de arranjo de diodos - DAD (G1315A) e um detector de fluorescência HP 1046A, acoplado a computador modelo Vectra XM, série 4-5/150.

Após a revisão da literatura, optou-se por extrair o analito da urina e identificá-lo segundo Jongeneelen, et al., 1987. A técnica de extração inclui hidrólise enzimática do conjugado com 12,5 de mL β-glicuronidase/arilsulfatase, seguida de purificação da amostra em um cartucho C₁₈ - octadecil sílica (Jongeneelen et al.,1986; Faria, 2003). A separação e a identificação ocorrem por cromatografia líquida de alta eficiência - CLAE com detecção por fluorescência (Jongeneelen et al., 1986, 1987; Buchet et al., 1992; Elovaara et al., 1995; Hatjian et al., 1995; Ovrebo et al., 1995; Bouchard et al., 1996; Moen et al., 1996; Nielsen et al., 1996; Roggi et al., 1997; Lafontaine et al., 2000; Faria, 2003).

Para verificar a faixa de linearidade do método foram adicionadas, ao pool das amostras de urina, soluções-padrão de 1-OHP, de modo a obter as seguintes concentrações: 0,2; 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 10; 20; 40; 80; 120; 160 e 200 ng/mL. A curva de calibração para o 1-OHP foi preparada na faixa de concentração de maior interesse (0,5 a 40 ng/mL), verificando-se a resposta da curva "área do pico x concentração do 1-OHP".

Amostras de urina obtidas de seis indivíduos (pool de urina) e amostras de metanol enriquecidas com padrão de 1-OHP, nas concentrações 0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 30 e 40 ng/mL e o branco, foram preparadas em seis replicatas e analisadas. Os dados deste estudo foram utilizados a fim de avaliar a interferência da matriz biológica na análise dentro das condições otimizadas.

O limite de detecção (LD) foi obtido a partir da análise de amostra de urina adicionada de 0,1; 0,2; 0,5 e 1,0 ng de 1-OHP/mL e o limite de quantificação (LQ) foi obtido a partir da análise de amostra adicionada de 1,0 ng de 1-OHP/mL de urina. Recomenda-se que o LD seja de duas a três vezes superior ao ruído da linha de base e pode ser expresso pela equação: LD = DP x 3,3/inclinação da reta e o LQ, definido pela equação: LQ = DP x 10/inclinação da reta, deve ser, no mínimo, cinco vezes superior a qualquer interferência da amostra branco no tempo de retenção do analito. Nas equações citadas o DP corresponde ao desvio-padrão do intercepto com o eixo do y de várias curvas de calibração construídas contendo concentrações do analito próximas ao suposto limite de quantificação. O pico de resposta do analito no LQ deve ser identificável e reprodutível com precisão de 20% e exatidão de 80 a 120% (Chasin et al., 1994, 1998; Brasil, 1999).

Para avaliar a precisão, a recuperação e a exatidão do método, amostras de urina enriquecidas com três concentrações diferentes: 2,0 (CB), 20,0 (CM) e 30,0 (CA) ng/mL de 1-OHP foram preparadas em sextuplicata, segundo o procedimento descrito por Faria (2003), e analisadas no mesmo dia, para o estabelecimento da precisão intradia, e preparadas e analisadas em cinco dias consecutivos, para a precisão interdias. A precisão foi avaliada de acordo com os coeficientes de variação obtidos nas análises. A recuperação do 1-OHP em amostras de urina foi avaliada por comparação da concentração obtida, quando a amostra, contendo o analito, foi submetida ao processo de extração, em relação à concentração obtida quando a amostra, sem a presença do analito, foi submetida ao processo de extração, com adição do padrão antes da análise no HPLC; e a exatidão foi avaliada, por meio da concentração teórica, pela porcentagem de inexatidão ou tendenciosidade (bias) representada pela equação:

RESULTADOS

A otimização de um método precede a validação, já que as condições analíticas, uma vez otimizadas, não devem ser alteradas após a sua validação. Validar é estar com o objetivo voltado para a confiabilidade analítica do laboratório e do método escolhido e otimizado para se obter resultados que se enquadrem às necessidades do problema em questão (Chasin et al., 1994, 1998; Hanks, 1995; Jenke, 1996; Brasil, 1999).

A análise realizada com detecção fluorescente (FLD) mostrou-se específica para o analito proposto, conforme ilustrado na Figura 1 e as condições cromatográficas otimizadas para a melhor separação cromatográfica estão expressas na Tabela I.

O estudo de linearidade do método para 1-OHP foi realizado abrangendo a faixa de 0,2 a 200 ng/mL (Figura 3).

A curva de calibração utilizada para a quantificação do analito em estudo, preparada com um pool de amostras de urina adicionadas com o 1-OHP, apresentou relação linear entre o sinal gerado pelo equipamento e a concentração do 1-OHP na faixa de concentração de 0,5 a 40,0 ng de 1-OHP/mL de urina, faixa dinâmica de interesse neste estudo. Cada ponto corresponde à média dos valores encontrados na análise das triplicatas. Estes resultados estão demonstrados na Tabela II e Figura 4.

As curvas de calibração em metanol e em amostras de urina podem ser observadas graficamente na Figura 5. As equações de regressão linear são: y = 1,4358x - 0,7677 (metanol), com coeficiente de determinação de 0,9986 e y = 15,677x - 11,26 (urina), com coeficiente de determinação de 0,9897.

Os resultados para coeficiente angular/inclinação da reta (a) e intercepto (b), da equação da reta y = ax + b, estão representados na Tabela III.

Obedecendo à definição do LD como sendo a quantidade da amostra que gera uma resposta duas a três vezes maior que o nível do ruído, com coeficiente de variação inferior a 20%, e do LQ como sendo a quantidade da amostra que gera uma resposta cinco vezes maior que o nível do ruído, com precisão de 20% e exatidão de 80 a 120% (Collins, Braga, Bonato, 1997; Chasin, et al., 1994, 1998; BRASIL, 1999), os valores de LD e LQ para o 1-OHP estão descritos nas Tabelas IV e ^V, e apresentados na Figura 6.

Para demonstrar a confiabilidade do método para a determinação de 1-hidroxipireno em amostras de urina, os resultados, referentes aos parâmetros de precisão, recuperação e exatidão, estão apresentados a seguir.

A precisão intra- e inter-dias (ensaio), obtida por meio de Análise de Variância (ANOVA) e descrita como coeficiente de variação (CV), com lote de seis amostras de urina adicionadas de 2, 20 e 30 ng/mL, preparadas no mesmo dia e em cinco dias diferentes, respectivamente, está reportada na Tabela VI.

A recuperação mede a eficiência do procedimento de extração de um método analítico dentro de um limite de variação. Porcentagens de recuperação próximas a 100% são desejáveis, porém, admitem-se valores menores, por exemplo, de 50 a 60%, desde que a recuperação seja precisa.

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

A procura de indicadores biológicos confiáveis para o estudo da exposição humana aos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) estabelece crescente necessidade para a realização de diversos estudos e pesquisas. O 1-hidroxipireno urinário tem sido proposto nos estudos de exposição humana aos HAPs e, levando-se em conta que até o presente não se dispõe do Índice Biológico Máximo Permitido (IBMP), o presente estudo foi desenvolvido, com o intuito de colaborar com estas pesquisas.

As análises por CLAE para a separação e identificação dos metabólicos dos HAPs são essencialmente baseadas na separação por fase reversa, aplicada em diversos estudos destes compostos (Jongeneelen et al.,1986, 1987; Buchet et al., 1992; Elovaara et al., 1995; Hatjian et al., 1995; Ovrebo et al., 1995; Bouchard et al, 1996; Moen et al., 1996; Nielsen et al., 1996; Roggi et al., 1997; Lafontaine et al., 2000).

A análise por cromatografia líquida em fase reversa do 1-hidroxipireno (metabólico hidroxilado dos HAPs) foi satisfatória, como pode ser observado nas Figuras 1 e 2, com cromatogramas em alta resolução e baixo nível de compostos interferentes na faixa do analíto em estudo.

Considerando a viabilidade na determinação do 1-OHP conforme relatado na literatura cientifica é necessário que a validação da metodologia, a ser adotada, seja realizada.

No estudo da linearidade do método não foi possível obter uma relação linear entre a concentração do 1-OHP, na faixa de 0,2 a 200 ng de 1-OHP/mL de urina, e a resposta do detector, pois o coeficiente de determinação (r²) de 0,9527 foi insatisfatório (Figura 3) (Chasin et al., 1994). Todavia, os dados obtidos pelo estudo de linearidade na faixa de interesse do método (0,2 a 40,0 ng 1-OHP/mL urina) demonstraram uma resposta linear entre a concentração do analito e a intensidade do sinal gerado por porcentagem (%) de fluorescência, satisfatória (r² = 0,999), conforme preconizado por Chasin et al. (1994, 1998) (Figura 4). O estudo de linearidade foi primeiramente realizado desconhecendo-se as reais concentrações do 1-OHP urinário durante uma exposição ocupacional.

De acordo com alguns autores, a sensibilidade é definida como a inclinação da curva de calibração que possibilite a medida em qualquer ponto (Miller, Miller,1988; Angerer et al., 1992; Chasin et al., 1998; Leite, 1998). Quanto maior for a inclinação da curva de calibração maior será a sensibilidade e especificidade do método. No presente estudo, a curva de calibração, preparada com um pool de amostras de urina, apresentou inclinação de 15,68 e a curva de calibração, preparada em metanol, apresentou inclinação de 1,44 (Figura 5 e Tabela III). A análise destes valores de inclinação demonstra que o método é mais seletivo e sensível quando a quantificação do analito é realizada com uma curva de calibração preparada com amostras de urina.

Os limites de detecção e quantificação foram adequados para a finalidade proposta. Obedecendo ao critério preconizado pela ANVISA (Brasil, 1999) os resultados adotados neste trabalho foram de 0,5 ng/mL para detecção e 1,0 ng/mL para uma quantificação precisa e exata do 1-OHP urinário.

A precisão do método é o parâmetro que avalia a proximidade entre as várias medidas efetuadas em uma mesma amostra. Este parâmetro deve ser determinado em um mesmo dia (precisão intra-dia) e em dias diferentes (precisão inter-dias). A medida de precisão pode ser expressa através do cálculo do desvio padrão e do coeficiente de variação (CV%), não se admitindo valores superiores a 15%, obtidos em condições determinadas de repetibilidade e/ou reprodutibilidade (Jenke, 1996; Chasin et al, 1998; FDA, 1998; Brasil, 1999). Recomenda-se, no mínimo, a análise de três concentrações (baixa, média e alta) dentro da faixa de limite esperado, realizando-se, pelo menos, cinco réplicas (Brasil, 1999). Neste trabalho o estudo de precisão foi realizado em sextuplicata, o que permitiu o tratamento estatístico das amostras em um intervalo de confiança de 95% de probabilidade na tabela t de Student (Chasin et al., 1998).

A imprecisão entre dias expressada como coeficiente de variação (CV) foi relatada na literatura em diversos trabalhos como 13,3%, 5,5% e 5,9% nas concentrações de 6, 3 e 1 ng/mL, respectivamente (Roggi, 1997; Siwinska, 1998).

De acordo com o preconizado e adotado neste trabalho, os resultados de precisão obtidos foram considerados satisfatórios e adequados (CV<15%). Os resultados, mesmo que de maneira aproximada, estão de acordo com os relatados na literatura para o analito em estudo. O estudo de recuperação demonstrou ser adequado, com resultados dentro da faixa de aceitação de 80 a 120% (Chasin et al., 1994, 1998; Brasil, 1999), conforme descritos na Tabela VII e os resultados obtidos no estudo de exatidão e reportados na Tabela VIII estão de acordo com o preconizado, com uma porcentagem (%) de inexatidão menor que os 15% sugeridos (Chasin et al., 1998).

A validação do método para a determinação do 1-OHP em amostras de urina, sugerido por Jongeneelen (1986), foi satisfatória atendendo os objetivos deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

À FAPESP, pela concessão da bolsa de Doutorado (processo 00/05556-7).

Recebido para publicação em 01 de outubro de 2002.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Mar 2010
• Data do Fascículo
  Jun 2004

Histórico

• Recebido
  01 Out 2002