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Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas

Print version ISSN 1516-9332

Rev. Bras. Cienc. Farm. vol.42 no.4 São Paulo Oct./Dec. 2006

http://dx.doi.org/10.1590/S1516-93322006000400009 

TRABALHOS ORIGINAIS

 

Vantagens e desvantagens das colunas C18 e C30 para a separação de carotenóides por CLAE

 

Advantages and disadvantages of C18 and C30 columns for HPLC separation of carotenoids

 

 

Itaciara Larroza Nunes; Adriana Zerlotti Mercadante*

Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas

 

 


RESUMO

Estudos têm demonstrado uma alta associação entre ingestão ou nível plasmático de carotenóides e a diminuição do risco ou proteção contra algumas doenças. Estes fatos, bem como a elevada suscetibilidade destes compostos à luz e calor, com formação de isômeros cis, os quais apresentam menor atividade biológica, torna importante o desenvolvimento de sistemas que permitam a separação destes carotenóides em alimentos. Neste trabalho foi avaliada a separação de isômeros geométricos de licopeno, e dos isômeros de posição luteína e zeaxantina, por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utilizando colunas C18 (monomérica, 4 mm, 300 x 3,9 mm) e C30 (polimérica, 3 mm, 250 x 4,6 mm) e diferentes fases móveis, tanto com eluição isocrática como com gradiente. Os carotenóides foram identificados através das características espectrais e co-cromatografia com padrões. As melhores condições cromatográficas foram obtidas em coluna C30 com temperatura de 33 ºC, eluição isocrática a 1 mL/min e fase móvel com metanol (0,1% trietilamina)/éter metil-terc-butílico (50:50) para separar isômeros de licopeno e (95:5) para luteína e zeaxantina. Entretanto, para análise quantitativa, é necessário verificar a repetibilidade da área dos picos na coluna C30. Além disso, a coluna C18 monomérica pode ser empregada para separar luteína e zeaxantina.

Unitermos: Licopeno. Luteína. Zeaxantina. CLAE . Coluna C30. Coluna C18. Isômeros


ABSTRACT

Several studies have demonstrated a high association between dietary intake or plasma levels of carotenoids and the decrease of risk or the protection against some diseases. Taking this into consideration, as well as the high susceptibility of these compounds to light and heat, leading to the formation of cis isomers with lower biological activity, it is important to develop systems that allow the separation of such compounds in foods. This work evaluated the separation of the geometric isomers of lycopene and of the position isomers, lutein and zeaxanthin, by high performance liquid chromatography (HPLC) using C18 (monomeric, 4 mm, 300 x 3.9 mm) and C30 (polymeric 3 mm, 250 x 4.6 mm) columns and many different mobile phases, with either isocratic or gradient elution. The carotenoids were identified by their spectral characteristics and co-chromatography with standards. The best chromatographic conditions were achieved with the C30 column, temperature set at 33 ºC and as mobile phase an isocratic elution of methanol (0.1% triethylamine)/tert-butyl methyl ether (50:50) to separate lycopene isomers and (95:5) for lutein and zeaxanthin, both at 1 mL/min. However, for quantitative analysis, it is necessary to evaluate the peak area repeatability on the C30 column. In addition, the monomeric C18 column can be employed for separation of lutein and zeaxanthin.

Uniterms: Lycopene. Isomers. Lutein. Zeaxanthin. HPLC. C30 column. C18 column.


 

 

INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, o licopeno vem ganhando destaque devido ao seu elevado potencial antioxidante e associação ao menor risco de desenvolvimento de câncer de próstata (Van den Berg et al., 2000; Giovannucci, 2002; Venkateswaran et al., 2004). Estudos têm demonstrado que o elevado consumo de luteína e zeaxantina está relacionado à significativa redução da catarata e da degeneração macular (Junghans et al., 2001; Stringham, Hammond, 2005).

Colunas de fase reversa C18 e C30 vêm sendo amplamente utilizadas para separação de carotenóides. Em geral, melhores separações de carotenos e isômeros têm sido demonstradas com C18 poliméricas do que com monoméricas (Sander et al., 2000). Em coluna C18 monomérica não houve boa separação de isômeros geométricos (ou cis-trans) de carotenóides apolares e entre luteína e zeaxantina (Sander et al., 1994). Por outro lado, a vantagem da coluna C30 (polimérica) em relação à coluna C18 é a possibilidade de separar maior número de isômeros, além de ser a única coluna capaz de separar isômeros de carotenóides não-simétricos, como 13-cis-, 13'-cis-, 9-cis- e 9'-cis-luteína (Emenhiser et al., 1996).

Utilizando coluna C30 e eluição isocrática de metanol (MeOH)/éter metil-terc-butílico (TBME) (50:50) como fase móvel, foram separados trans- e 5-cis-licopeno em tecidos humanos (Fang et al., 2002), enquanto que foram separados o trans-licopeno e mais 4 isômeros cis em pasta de tomate (Böhm et al., 2002).

Gradiente linear e fases móveis contendo misturas de MeOH/TBME/H2O para separar trans- e cis-licopeno em coluna C30 foram utilizados em diversos estudos. Com estas condições, foram separados trans- e 5-cis-licopeno e outros 4 isômeros cis de licopeno em dieta, tecidos e soro de ratos (Boileau et al., 2000, 2001), trans- e 4 isômeros cis de licopeno em padrão isomerizado (Böhm , 2001), enquanto Re et al. (2001) reportaram a separação de trans-, 5-cis-, 9-cis, 13-cis- e 15-cis-licopeno em padrão e purê de tomate incubado em suco gástrico humano. Em tomate variedade tangerina, foram separados trans- e 11 isômeros cis de licopeno (Ferruzzi et al., 2001) e Hackett et al. (2004) demonstraram a separação de trans-, 5-cis-licopeno e 7 isômeros cis de licopeno em padrão isomerizado e oleo-resinas de tomate. Cabe destacar que a maioria dos isômeros cis não foi identificada nestes trabalhos.

Separação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) de luteína e zeaxantina em alimentos, utilizando condições cromatográficas semelhantes às citadas para licopeno, tem sido utilizada por diversos autores. Coluna C30 e fases móveis contendo diferentes concentrações de MeOH/TBME/H2O em sistema de gradiente foram utilizadas para separação desses carotenóides em amostras de milho (Moros et al., 2002), trigo (Hentschel et al., 2002) e batata branca e amarela (Breithaupt, Bamedi, 2002), sendo que em todos os casos foi relatada boa separação dos picos de luteína e zeaxantina na linha de base.

Apesar do maior uso da coluna C30 para separar carotenóides, a separação de luteína, zeaxantina e seus isômeros geométricos também foi realizada em colunas de fase normal. Humphries, Khachik (2003) empregaram coluna ciano para avaliar a distribuição de isômeros de luteína (all-trans-, 13,13'-dicis-, 9-cis- e 9'-cis-luteína) e de zeaxantina (all-trans-, 9-cis- e 13-cis-zeaxantina) em frutas, vegetais, trigo e massas. Panfili et al. (2004) usaram coluna de sílica para separação de all-trans-luteína e dos seus isômeros 13,13'-dicis-, 9-cis- e 9'-cis- em cereais. Mendes-Pinto et al. (2004) compararam coluna de fase reversa polimérica C18 e de fase normal ciano para separar carotenóides em uvas, obtendo separação dos picos de luteína e zeaxantina somente quando utilizada fase normal.

Devido à presença de um grande número de ligações duplas conjugadas na estrutura, os carotenóides são suscetíveis a alterações químicas quando expostos à luz e calor, formando isômeros cis, que possuem menor atividade biológica. Desta forma, é importante desenvolver sistemas que permitam a separação destes carotenóides em alimentos. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a separação de isômeros geométricos de licopeno e dos isômeros de posição luteína e zeaxantina por CLAE, utilizando colunas C18 e C30.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Reagentes

Foram utilizados padrões de all-trans-licopeno, 5-cis, 9-cis, 13-cis-licopeno, luteína e zeaxantina provenientes da DSM Nutritional Products (Suíça) e cristal de all-trans-licopeno obtido a partir de tomate fresco (Nunes, Mercadante, 2004).

Os reagentes utilizados para obtenção de licopeno foram de grau p.a., enquanto que para análise cromatográfica todos os solventes foram de grau cromatográfico e previamente filtrados em sistema Millipore de filtração a vácuo, com membrana para solvente orgânico de 0,45 mm. Imediatamente antes da análise por CLAE, os padrões foram solubilizados e filtrados em membrana de polietileno com 0,22 µm de poro.

Preparação e isomerização do licopeno

Cristais de licopeno foram obtidos de tomate fresco de acordo com Nunes, Mercadante (2004). A metodologia consistiu de (1) etapa preliminar para remoção de água com quatro extrações de 30 minutos, cada uma com 30 mL de etanol comercial e posterior descarte do solvente, (2) quatro extrações de 120 minutos com acetato de etila, cada extração com razão massa/solvente de 10:7, (3) eliminação do solvente em evaporador rotatório e (4) duas cristalizações com diclorometano/etanol (1:4).

Para promover a isomerização, os cristais foram dissolvidos em diclorometano/metanol (2:8) e aquecidos no escuro em banho-maria a 90 ± 5 ºC durante 2 horas.

Análise por CLAE

Foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência, com detector de arranjo de diodos (DAD) (Waters, modelo 996), sistema quaternário de bombeamento de solventes (Waters, modelo 600), injetor Rheodyne com válvula de injeção de 20 µL, forno externo com controle de temperatura, desgaseificador "on line" e sistema de aquisição e processamento de dados Millenium (Waters). Os espectros foram adquiridos entre 250 e 600 nm e os cromatogramas processados no comprimento de onda máximo.

Para a separação de isômeros de licopeno, foram testadas as condições cromatográficas descritas na Tabela I em coluna C30 polimérica da marca YMC (3 µm, 250 x 4,6 mm), sempre com vazão de 1mL/min. As condições de fases móveis avaliadas em coluna C18 monomérica Nova-Pak (4 µm, 300 x 3,9 mm), mantida a 29 ºC e vazão de 1 mL/min, sempre utilizando MeOH/EtOAc (50:50) como solvente de injeção, estão apresentadas na Tabela II.

 

 

 

 

Para separação de luteína e zeaxantina em coluna C30 foram testadas fases móveis com eluição isocrática contendo MEOH/TBME (50:50 ou 95:5) e temperatura da coluna de 33 ºC. Em coluna C18 foram avaliadas fases móveis com eluição isocrática contendo misturas de ACN/EtOAc/H2O (88:6:6, 88:8:4, 88:10:2 ou 92:2:6) e gradiente linear de ACN/EtOAc/H2O de 88:2:10 para 85:15:0 em 20 minutos com temperatura da coluna mantida a 29 ºC. Para as duas colunas, a vazão de todas as fases móveis foi de 1 mL/min, sempre utilizando MeOH como solvente de injeção.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Isômeros de licopeno

Os padrões de isômeros 5-cis-, 9-cis-, 13-cis- e all-trans-licopeno utilizados neste trabalho apresentaram lmax e forma do espectro similares aos previamente relatados na literatura (Hengartner et al., 1992; Schierle et al., 1997; Mercadante et al., 1999; Nunes, Mercadante, 2004), como mostra a Figura 1. Como a ligação dupla na posição 5 não está em conjugação com a cadeia poliênica, o espectro do 5-cis-licopeno é idêntico ao do all-trans-, enquanto que os espectros dos demais isômeros cis apresentaram deslocamento hipsocrômico de 6 a 7 nm. Além disso, verifica-se que a intensidade do pico cis (a 359 nm) vai aumentando à medida que a isomeria está localizada mais ao centro da cadeia, como nos espectros do 9-cis- e 13-cis-licopeno.

 

 

Dentre as fases móveis testadas em coluna C30, as que promoveram a melhor separação dos isômeros de licopeno do padrão termicamente isomerizado e dos padrões da DSM foram: MeOH (0,1% TEA)/TBME (50:50) em modo isocrático e gradiente linear de MeOH (0,1% TEA)/TBME de 60:40 para 50:50 em 20 minutos, ambas com vazão de 1 mL/min, temperatura da coluna de 33 ºC e utilizando como solvente de injeção MeOH/TBME (50:50).

Optou-se por trabalhar com a fase móvel no modo isocrático devido às dificuldades encontradas no recondicionamento da coluna com a utilização de gradiente. Mesmo após 30 minutos de recondicionamento, a repetibilidade da área do pico do all-trans-licopeno foi baixa (desvio-padrão relativo (%RSD) de 5,0 para 8 injeções seguidas) e o número de picos minoritários separados foi diferente em cada corrida, o que pode ser constatado na Figura 2.

 

 

A utilização de gradiente em coluna C30 para separação de isômeros de licopeno em diversas matrizes tem sido utilizada por muitos autores (Boileau et al., 2000, 2001; Böhm, 2001; Re et al., 2001; Ferruzzi et al., 2001; Hackett et al., 2004) sendo que em nenhum destes trabalhos foram mencionados problemas com o recondicionamento da coluna ou co-eluição de picos.

Mouly et al. (1999), ao estudarem a determinação da origem geográfica de suco de laranja da variedade valencia através do perfil cromatográfico de carotenóides obtido por CLAE em coluna C30, utilizando como fase móvel gradiente linear de MeOH/TBME/H2O, observaram que após aproximadamente 100 injeções realizadas nesta coluna, os picos de isoluteína e zeaxantina passaram a co-eluir. Não foi citado o tempo de recondicionamento da coluna entre as injeções.

Quando utilizada fase móvel no modo isocrático, o valor do RSD de 3 injeções da área do pico do all-trans-licopeno foi de 0,7% e o número de picos minoritários foi sempre o mesmo. Neste caso somente após, aproximadamente, 250 injeções passou a ocorrer falta de repetibilidade da área dos picos e dos tempos de retenção.

A Figura 3a apresenta a melhor condição cromatográfica para separação dos padrões de 13-cis-, 9-cis-, 5-cis- e all-trans-licopeno, utilizando a coluna C30 em modo isocrático, sendo que a ordem de eluição dos picos foi a mesma da encontrada no gradiente empregado neste estudo e da reportada por Re et al. (2001), embora neste trabalho tenha sido utilizada fase móvel contendo H2O, além de MeOH e TBME, e sistema de gradiente.

 

 

Embora não tenha ocorrido separação entre all-trans- e 5-cis-licopeno na linha de base em nenhuma das fases móveis e colunas testadas no presente trabalho, estes dois compostos foram melhor resolvidos quando utilizada coluna C30, com o 5-cis- eluindo logo após o all-trans-licopeno. Este fato foi verificado também por Boileau et al. (2000, 2001) e Re et al. (2001), ambos utilizando coluna C30 e fases móveis em sistema gradiente.

Utilizando a coluna C18 (Figura 3b), o 9-cis-licopeno eluiu junto com o all-trans-licopeno, com separação parcial do 13-cis-licopeno em todas as condições avaliadas.

Luteína e zeaxantina

Os padrões de all-trans-luteína e all-trans-zeaxantina apresentaram lmax e forma do espectro similares aos previamente relatados na literatura (Britton, 1995; Zanatta, Mercadante, 2007) (Figura 4). A all-trans-zeaxantina apresenta uma ligação dupla conjugada (l.d.c) a mais na estrutura do que a all-trans-luteína e conseqüentemente um lmax com maior comprimento de onda (5 nm). Entretanto, o fato de esta l.d.c estar localizada no anel b explica a estrutura fina (%III/II) reduzida da mesma, quando comparada com a all-trans-luteína (Britton, 1995).

 

 

Como pode ser observado nas Figuras 5a e 5b, a melhor separação dos padrões de luteína e zeaxantina foi também obtida em coluna C30. Resultados semelhantes foram apresentados por Sander et al. (1994) em estudo comparativo de fases estacionárias C18 (monomérica e polimérica) e C30 na separação de padrões de diversos carotenóides.

 

 

Zanatta, Mercadante (2007) obtiveram resoluções similares dos picos de luteína e zeaxantina em extrato de camu-camu utilizando as mesmas colunas C18 monomérica (gradiente linear de ACN/H2O/EtOAc, partindo de 88:10:2, atingindo 85:0:15 em 15 min, e 70:0:30 em 35 min, mantendo até o final) e C30 polimérica (gradiente de H2O/MeOH/TBME de 5:80:5 atingindo 0:95:5 em 12 min, 0:89:11 em 25 min, 0:75:25 em 40 min e 0:50:50 em 60 min) usadas no presente estudo.

 

CONCLUSÃO

No presente trabalho a coluna C30 polimérica mostrou maior poder de resolução tanto na separação dos isômeros 5-cis, 9-cis- e 13-cis-licopeno quanto de luteína e zeaxantina. Pelo fato destes isômeros serem os mais encontrados em alimentos processados, o uso da coluna C30 é recomendado apesar do éter metil-terc-butílico, utilizado na fase móvel e da própria coluna apresentarem elevado custo no Brasil. Entretanto, caso o objetivo seja acompanhar as mudanças quantitativas é necessário verificar a ocorrência de problemas com a repetibilidade das áreas dos picos separados em coluna C30. Além disso, a coluna C18 monomérica pode ser empregada quando o objetivo foi separar os isômeros de posição luteína e zeaxantina.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à FAPESP pela bolsa do primeiro autor e auxílio financeiro e a DSM Nutritional Products (Suíça) pela doação dos padrões.

 

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Recebido para publicação em 09 de fevereiro de 2006
Aceito para publicação em 18 de agosto de 2006

 

 

* Correspondência:
A. Z. Mercadante
Faculdade de Engenharia de Alimentos
Departamento de Ciência de Alimentos
UNICAMP - Cx. Postal 6121
CEP 13083-862
Campinas - SP - Brasil
E-mail: azm@fea.unicamp.br

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