Utilização da microespectroscopia infravermelha (FT-IR) para teste de algoritmos estatísticos na diferenciação dos micro-organismos Candida albicans, Candida dubliniensis e Candida parapsilosis

Using FT-IR microspectroscopy for testing statistical algorithms for differentiation of Candida albicans, Candida dubliniensis and Candida parapsilosis

ARTIGO ORIGINAL

Utilização da microespectroscopia infravermelha (FT-IR) para teste de algoritmos estatísticos na diferenciação dos micro-organismos Candida albicans, Candida dubliniensis e Candida parapsilosis

Using FT-IR microspectroscopy for testing statistical algorithms for differentiation of Candida albicans, Candida dubliniensis and Candida parapsilosis

Patrícia Marcondes dos Santos^I,*; Maria Angélica Gargione Cardoso^II; Sônia Khouri^III; Alderico Rodrigues de Paula Júnior^IV; Mituo Uehara^V,†; Kumiko Koibuchi Sakane^V

^IInstituto de Pesquisa de Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba – Univap, Av. Shishima Hifumi, 2911, Urbanova, CEP 12244-000, São José dos Campos, SP, Brasil

^IILaboratório de Imunologia e Farmacognosia, Instituto de Pesquisa de Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba – Univap, São José dos Campos, SP, Brasil

^IIILaboratório de Microbiologia, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade do Vale do Paraíba – Univap, São José dos Campos, SP, Brasil

^IVProcessamento de Sinais Biológicos, Instituto de Pesquisa de Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba – Univap, São José dos Campos, SP, Brasil

^VLaboratório de Espectroscopia no Infravermelho, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba – Univap, São José dos Campos, SP, Brasil

RESUMO

As espécies do gênero Candida são causadoras de diversas infecções fúngicas e, nos últimos anos, tem sido desenvolvidas novas tecnologias para auxiliar nos diagnósticos microbiológicos. Dentre as técnicas está a espectroscopia infravermelha junto com a análise estatística multivariada. O objetivo deste trabalho é comparar dois métodos: estatístico (análise multivariada) e não-estatístico (ajuste de curva), utilizando os espectros infravermelhos de Candida albicans, Candida dubliniensis e Candida parapsilosis para testar o potencial do uso de Análise Estatística Multivariada para discriminação de espectros de micro-organismos. Para isso foram obtidos, utilizando o Spectrum Spotlight 400 da PerkinElmer, 54 espectros infravermelhos, sendo 18 de cada espécie, na faixa de 4000 a 1000 cm^–1, com resolução de 4 cm^–1, no modo de transmissão, a 20 ºC. A análise dos espectros foi realizada através de três métodos: (1) inspeção visual direta dos espectros; (2) análise estatística multivariada; (3) ajuste de curva para a determinação de estruturas secundárias de proteínas. Na região de 1200 a 1000 cm^–1, os espectros apresentam diferenças que podem ser percebidas numa inspeção visual direta. Uma banda próxima de 1070 cm^–1 e outra próxima de 1045 cm^–1 apresentam intensidades relativas diferentes para os três espectros. Por outro lado, as bandas da amida I, na região de 1710 a 1590 cm^–1, apresentam aspectos visuais semelhantes com máximo em 1651 cm^–1 para os espectros dos três micro-organismos. Esse fato torna possível submeter a análise estatística multivariada a um teste de sua capacidade de diferenciar três espectros de Candida. A análise estatística multivariada foi aplicada aos 54 espectros para investigar as regiões de 4000 a 1000 cm^–1 com exceção da região de 2600 a 2300 cm^–1 e de 1710 a 1590 cm^–1 que corresponde a das bandas da amida I. A técnica selecionada foi a análise por componentes principais (PCA, Principal Componente Analysis), utilizando os primeiros quatro componentes principais, em conjunto com a técnica hierárquica de análise de agrupamento (HCA, Hierarchical Clustering Analysis) segundo o método de Ward. Foi utilizado para esta análise o software MINITAB 15 e o resultado mostra uma clara discriminação dos espectros dos três micro-organismos nas duas regiões consideradas. Adicionalmente foi obtido o espectro médio de cada micro-organismo nas bandas da amida I na região de 1710 a 1590 cm^–1. Os três espectros médios assim obtidos foram analisados pelo método de ajuste de curva que não é estatístico para determinar as estruturas secundárias de proteínas. Para esta análise o software ORIGIN 7.5 foi utilizado e os resultados obtidos mostram estruturas conformacionais diferentes nos três micro-organismos. Esses resultados confirmam a discriminação obtida através da análise estatística multivariada e visual. Pode-se concluir que as análises estatísticas multivariadas baseadas em análise por componentes principais e análise de agrupamento com uso do algoritmo Ward é potencialmente útil para discriminar micro-organismos através de seus espectros infravermelhos. Além disso, as análises mostram que as bandas da amida I dos espectros infravermelhos de Candida albicans, Candida dubliniensis e Candida parapsilosis fornecem um conjunto de dados cuja estrutura de agrupamento é conhecida e que pode ser útil para testar e validar algoritmos estatísticos de análise de agrupamento.

Palavras-chave:Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida parapsilosis, Análise estatística multivariada, Microespectroscopia infravermelha, Estruturas secundárias de proteínas.

ABSTRACT

Films of Candida albicans, Candida dubliniensis and Candida parapsilosis were prepared and the infrared spectra of these films were obtained in the region 4000 to 1000 cm^–1, with resolution of 4 cm^–1, in the transmission mode, at 20 ºC. Fifty four spectra were obtained, 18 of each microorganism, with the PerkinElmer Spotlight 400 FT-IR, which has a microscope attached to a FT-IR spectrophotometer. The spectra were analyzed through three methods: (1) mere visual inspection; (2) multivariate statistical analysis; (3) curve-fitting for determining secondary structures of proteins. In the region 1200 to 1000 cm^–1, the spectral bands show differences that can be seen by a mere visual inspection. On the other hand, the amide I bands, in the region 1710 to 1590 cm^–1, have the same visual aspect for the three microorganisms. Multivariate statistical analysis was applied to analyze these amide I bands of all the 54 spectra. Principal component analysis (PCA) and techniques of hierarchical cluster analysis (HCA, Hierarchical Clustering Analysis) according to Ward's method were applied using the software MINITAB 15. The results show a clear discrimination of the three microorganisms. The average spectrum of each microorganism was obtained in the amide I band. Each average spectrum was analyzed by curve-fitting for the determination of secondary structures of proteins. The software used was the ORIGIN 7.5 and the results confirm the discrimination obtained through multivariate statistical analysis. This result shows that multivariate statistical analysis can be useful to discriminate infrared spectra of different microorganisms. Furthermore, this work shows that the amide I bands of the infrared spectra of Candida albicans, Candida dubliniensis, and Candida parapsilosis provide a set of data of known group structure that can be useful to test statistical algorithms of cluster analysis.

Keywords:Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida parapsilosis, Multivariate statistical analysis, Infrared microespectroscopy, Secondary structures of proteins.

Introdução

As espécies do gênero Candida são importantes agentes infecciosos em pacientes hospitalizados. A maioria dos sistemas de identificação disponível, em hospitais, baseia-se nas características fenotípicas dos micro-organismos. Entretanto, esses sistemas são geralmente demorados, apresentando acurácia limitada devido às dificuldades na leitura e interpretação dos resultados (Toubas et al., 2007).

A Candida albicans pode ser considerada a mais importante espécie envolvida em infecções fúngicas, embora as espécies não albicans, como Candida parapsilosis, Candida dubliniensis vem aumentando em importância nos últimos anos (Celebi et al., 2008).

Em estudo realizado por Mähnss et al. (2005), foram comparados diferentes métodos fenotípicos para identificação de Candida spp, e concluíram que não existe um único método capaz de diferenciar todas as espécies, principalmente quando elas possuem características semelhantes, como é o caso de Candida albicans e Candida dubliniensis.

Nos últimos anos, novas tecnologias têm sido desenvolvidas para auxiliar o diagnóstico microbiológico de determinadas doenças infecciosas emergentes, principalmente as fúngicas, como as análises imunológicas, bioquímicas e moleculares e mais recentemente as análises baseadas em técnicas por espectroscopia infravermelha em conjunto com a análise estatística multivariada (Beekes et al., 2007; Dziuba et al., 2007; Essendoubi et al., 2005; Maquelin et al., 2002; Naumann, 2000; Sandt et al., 2006; Timmins et al., 1998; Toubas et al., 2007).

A espectroscopia de absorção no infravermelho é uma das técnicas que fornece informações sobre os modos de vibração molecular, que por sua vez dependem da estrutura da molécula.

As vibrações moleculares envolvem energias que correspondem a energias de fótons infravermelhos. Na espectroscopia molecular, tais fótons podem ser absorvidos pela molécula que está sendo objeto de estudo, excitando modos de vibração da molécula, resultando, dessa interação entre fótons e molécula, espectros de absorção na região do infravermelho. Assim, pode-se investigar a geometria e as forças de interação entre os átomos que constituem a molécula, pois seus espectros dependem desses fatores.

O espectro de absorção no infravermelho é um processo que ocorre quando uma radiação eletromagnética incidente tem uma componente com valor de frequência igual à frequência correspondente a uma transição entre dois níveis vibracionais. Somente os modos de vibração que levam a variação no momento dipolar elétrico são observados nos espectros infravermelhos (Colthup, 1997; Sala, 1995).

Há diversos métodos para se realizar a análise estatística multivariada dentre os quais está a análise por componentes principais (PCA, Principal Componente Analysis) e análise por agrupamento (HCA, Hierarchical Clustering Analysis) com o uso do algoritmo Ward. Este algoritmo busca formar grupos minimizando o desvio padrão entre os dados de cada grupo (Everitt, 1994; Ward, 1963). A aplicação de diferentes algoritmos estatísticos em uma análise pode levar a resultados discrepantes. Portanto, é importante comparar os resultados obtidos com a utilização do algoritmo estatístico com os resultados obtidos por métodos não-estatísticos (Manly, 2005). A técnica de ajuste de curvas para a determinação de estruturas secundárias de proteínas é um método não-estatístico que tem sido aplicado para diferenciar espectros infravermelhos de Candida albicans nas formas de levedura e filamentosa (Adt et al., 2006).

O objetivo deste trabalho é comparar os dois métodos: estatístico e não-estatístico, utilizando os espectros infravermelhos de Candida albicans, Candida dubliniensis e Candida parapsilosis para testar o potencial do uso de Análise Estatística Multivariada para discriminação de espectros de micro-organismos.

Materiais e Métodos

Preparação das amostras para espectroscopia no infravermelho

Foram utilizadas cepas padrão (ATCC – American Type Culture Collection) de Candida albicans (ATCC 10231), Candida dubliniensis (ATCC 778157) e Candida parapsilosis (ATCC 22019) mantidas no Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências da Saúde – UNIVAP, respeitando as normas de Biossegurança.

As cepas padrão foram cultivadas em meios específicos para isolamento e identificação (Agar Sabouraud Dextrose – DIFCO) e incubadas por 24 a 48 horas a 35 ºC, conforme protocolo de rotina. Em seguida, foram preparados inóculos de acordo com escala 0,5 de Mc Farland, que corresponde a 1,5 × 10⁸ células/mL. Uma alíquota (300 µL), dos inóculos previamente preparados, foi semeada em superfície com alça de Drigalski (Koneman et al., 2001), em meio de cultura Agar Sabouraud Dextrose (DIFCO) e incubada por 12 horas a 37 ºC. Decorrido o tempo de incubação, cerca de duas alças, de 1 µL, de colônias de leveduras foram ressuspensas em 40 µL de solução fisiológica estéril (0,9 %). A suspensão foi homogeneizada em Vortex por 1 minuto. Em seguida, uma alíquota de 10 µL foi transferida para a janela de fluoreto de cálcio (CaF₂) e mantidas em estufa a 50 ºC por uma hora, para obtenção de um filme transparente.

A solubilidade de fluoreto de cálcio em água é pequena, 0,0015 g/100 mL (18 ºC) e 0,0016 g/mL (20 ºC) (Budavari, 1996). Alguns autores tais como Barbosa (2007), Stuart (1997) e Toyran et al. (2004) consideram o fluoreto de cálcio insolúvel em água. No nosso experimento, foram utilizadas as janelas de CaF₂ pelo tempo de contato de poucos minutos contando a partir da colocação da solução na janela até ser colocada na estufa. Além disso, os espectros obtidos de C. albicans conferem com os publicados na literatura (Adt et al., 2006; Toubas et al., 2007).

Espectroscopia no infravermelho e pré-processamento dos dados

Os espectros foram obtidos na faixa de 4000 a 1000 cm^–1, com resolução de 4 cm^–1, no modo de transmissão com 32 varreduras, com intervalo de 1 cm^–1, a 20 ºC. Foi utilizado Spectrum Spotlight 400 FT-IR da PerkinElmer, que tem um microscópio acoplado a um espectrofotômetro infravermelho com transformada de Fourier.

Os dezoito espectros de cada espécie de Candida foram pré-processados com software Spectrum 5.3 (PerkinElmer), onde foram feitas as correções de linha de base, suavização espectral utilizando o algoritmo Savistzky Golay (9 pontos) e normalização. Os espectros médios de cada espécie são mostrados na Figura 1.

Análise dos dados

Neste trabalho os espectros infravermelhos de C. albicans, C. dubliniensis e C. parapsilosis foram analisados através de três métodos: (1) inspeção visual direta dos espectros; (2) análise estatística multivariada; (3) ajuste de curva para o estudo das estruturas secundárias de proteínas.

Para a análise visual foi calculado o espectro médio de cada tipo de cepa utilizando 18 espectros pré-processados. Os espectros médios de cada tipo de cepa foram impressos na forma de gráfico em uma escala e faixa apropriada para ressaltar as diferenças entre eles.

Os algoritmos utilizados para a análise estatística multivariada foram a Análise de Componentes Principais (PCA) juntamente com a Análise de Agrupamento Hierárquico (HCA). O PCA consiste em projetar os parâmetros espectrais originais em novos eixos de forma que o primeiro eixo fica na direção de maior variabilidade dos parâmetros. Os demais eixos são perpendiculares aos eixos anteriores sempre na direção de maior variabilidade remanescente. As novas variáveis são denominadas de componentes principais e são os autovetores da matriz de covariância dos parâmetros originais. Os autovalores desta matriz representam variâncias das novas variáveis. Para aplicações em espectroscopia, em geral, os primeiros principais componentes (três a cinco) captam mais de 95% da variabilidade dos parâmetros originais e os demais podem ser considerados como ruído e desprezados. Isto permite uma grande redução da dimensionalidade de parâmetros o que facilita a fase de classificação (Johnson e Wichern, 1992). Após a redução da dimensionalidade, algoritmos de classificação podem ser utilizados. Um método que permite visualizar os dados é o método HCA que procura agrupamento de dados semelhantes utilizando alguma medida de distância entre os dados. Neste trabalho foi selecionado o algoritmo de Ward. Para visualizar os resultados da análise de agrupamento pode-se utilizar o dendrograma também disponível em diversos softwares, dentre eles, o MINITAB 15, utilizado neste trabalho.

Aplicamos o método de ajuste de curvas para determinar as estruturas secundárias de proteínas, na região de 1710 a 1590 cm^–1, correspondente à banda da amida I. Nesse método supõe-se que a banda da amida I seja a soma de várias componentes lorentzianas. A função lorentziana, L(x), é definida por:

onde x_o dá a posição do pico da função, w é um parâmetro que especifica a largura e A é a área total sob a curva a partir da linha de base. O valor de pico, L(x_o), é dado por:

de modo que quanto menor for a largura w, maior será o valor de pico.

A derivada segunda da banda da amida I fornece os picos das componentes lorentzianas (Byler e Susy, 1986). As larguras das componentes lorentzianas são ajustadas, pelo método dos mínimos quadrados, para que a soma das componentes lorentzianas reproduza, o melhor possível, a banda original. Para o cálculo da derivada segunda e o ajuste pelo método dos mínimos quadrados foram utilizados os softwares Spectrum 5.3 e ORIGIN 7.5 respectivamente. Alguns autores utilizam gaussianas em lugar de lorentzianas para o ajuste da banda da amida I (Toyran et al., 2004).

As áreas de componentes das bandas de amida I são relacionadas às quantidades de estruturas conformacionais. As porcentagens das conformações α-hélice, β-folha, ao acaso e dobras/voltas são estimadas calculando a razão entre a área de cada componente e a área total que é a área de todos os componentes (Stuart, 1997; Surewicz e Mantsch, 1988).

A Tabela 1 mostra os parâmetros do espectrofotômetro e softwares utilizados no trabalho.

Resultados e Discussões

A Figura 1 apresenta o espectro infravermelho médio dos três micro-organismos analisados.

O espectro de Candida albicans está de acordo com o publicado na literatura. (Adt et al., 2006; Toubas et al., 2007). Essendoubi et al. (2005) utilizaram a segunda derivada dos espectros infravermelhos de espécies Candida, entre eles os de Candida albicans e Candida parapsilosis para rápida identificação utilizando análise de cluster hierárquica. Tintelnot et al. (2000) compararam duas espécies fortemente relacionadas: Candida albicans e Candida dubliniensis utilizando espectroscopia FT-IR combinada com análise de cluster hierárquico. Timmins et al. (1998) notaram uma diferença muito pequena nos espectros infravermelhos de micro-organismos estudados, entre eles: Candida albicans e Candida dubliniensis. Suas bandas são muito largas com contornos muito complexos, o que tornam sua discriminação difícil por inspeção visual rápida e sugerem como o método para discriminação, a análise estatística multivariada.

A Tabela 2 apresenta as regiões espectrais em que se encontram bandas características de biomoléculas e as interpretações aproximadas dessas bandas (Mantsch e Chapman, 1996; Maquelin et al., 2002; Twardowski e Anzenbacher, 1994).

A Figura 1 mostra, conforme as interpretações dadas na Tabela 2, que os espectros das três espécies de Candida apresentam predominância das bandas de proteínas e de carboidratos.

Análise dos espectros infravermelhos

São apresentadas a seguir as análises dos espectros obtidos a partir de três métodos distintos: (1) inspeção visual direta; (2) análise estatística multivariada (MVA, Multivariate Statistical Analysis); (3) ajuste de curva para analisar a banda da amida I, na região de 1710 a 1590 cm^–1.

Inspeção visual direta

A região de 1200 a 1000 cm^–1 corresponde a bandas de absorção de carboidratos presentes na parede celular dos três micro-organismos.

A parede celular é uma estrutura rígida que mantém a integridade da célula e interage com o meio que se encontra. É localizada na parte externa da membrana celular e é composta principalmente de glucanas e mananas e de pequenas quantidades de quitinas e lipídios. As glucanas e mananas se combinam formando as glicoproteínas, manoproteínas e glicomanoproteínas (Chaffin, 2008; Gompertz et al., 2008). Manoproteínas se encontram na superfície externa da célula e sua quantidade varia exponencialmente entre as fases estacionárias e de crescimento das células e também conforme as condições do meio, tais como nutrientes e disponibilidade de oxigênio (Chaffin, 2008).

Na região de 1200 a 1000 cm^–1 observam-se duas bandas nos três espectros, sendo uma próxima de 1070 cm^–1 e outra próxima de 1045 cm^–1. Adt et al. (2006) atribuíram essas bandas a vibrações das ligações C-O-C do anel de polissacarídeos. A primeira corresponde a do glicogênio e dos ácidos nucléicos e a segunda de manoproteínas. As intensidades relativas dessas duas bandas são diferentes para os três espectros, mostrados na Figura 2.

A inspeção visual direta permite distinguir os espectros infravermelhos das três espécies de Candida. Esse fato torna possível submeter a análise estatística multivariada a um teste da sua capacidade de diferenciar espectros de micro-organismos.

Análise estatística multivariada

A análise estatística multivariada tem sido utilizada para o estudo de espectros de micro-organismos, com vistas a uma rápida diferenciação desses micro-organismos (Beekes et al., 2007; Dziuba et al., 2007; Essendoubi et al., 2005; Maquelin et al., 2002; Naumann, 2000; Sandt et al., 2006; Timmins et al., 1998; Toubas et al., 2007).

Análises estatísticas multivariadas baseadas em análise por componentes principais (PCA, Principal Component Analysis) e análise de agrupamento (HCA, Hierarchical Clustering Analysis) foram utilizadas para analisar os espectros dos três micro-organismos. Paras as análises de agrupamento foram utilizados os quatro primeiros componentes principais, por conter aproximadamente 99% das informações iniciais, conforme mostra pelos Scree plot, Figuras 3a, b. Esse alto grau de representação em um pequeno número de componentes demonstra uma grande correlação entre os dados analisados. Pelos gráficos dos Score, Figuras 3c, d, pode-se confirmar a grande contribuição do primeiro componente em separar os espectros analisados. O Loading plot da Figuras 3e, f, projetado a partir dos componentes principais, ilustra a contribuição das variáveis espectrais originais para a formação dos quatro primeiros componentes principais. As principais variações podem ser observadas nas regiões entre 1200 a 1000 cm^–1 onde é possível fazer a diferenciação dos espectros por inspeção direta visual.

Os componentes principais, utilizadas nesta análise (Figuras 3a, c, e, foram calculadas a partir da matriz de covariância formada por dados espectrais em quase toda sua extensão, região de 4000 a 1000 cm^–1, com exceção da região de CO₂, entre 2600 e 2300 cm^–1.

Para o agrupamento hierárquico foi utilizado o algoritmo Ward, considerado o mais eficiente método de agrupamento hierárquico (Everitt, 1994; Ward, 1963). O resultado, mostrado no dendrograma da Figura 4 apresenta uma clara discriminação entre os três espectros. No dendrograma são visualizadas as distâncias entre os grupos (cluster) de forma decrescente, e quanto menor a distância, maior a semelhança entre as observações. Essa distância é mensurada a partir da matriz das distâncias euclidianas utilizando-se a soma dos desvios quadráticos dos pontos para o centroide, calculo feito pelo algoritmo Ward. Para a criação da matriz das distâncias euclidianas são utilizadas as componentes principais (PC's) originadas da matriz de covariância dos valores de absorbância dos espectros (medida adimensional). Logo, a distância no dendrograma representa a distância geométrica entre pontos no espaço multidimensional, sendo esta, um parâmetro adimensional (Cormack, 1971; Romesburg, 1990).

As bandas da amida I, na região de 1710 a 1590 cm^–1, apresentam o mesmo aspecto visual nos espectros dos três micro-organismos. Aplicamos a análise estatística multivariada a essas bandas da amida I, utilizando os mesmos parâmetros da análise anterior e, o resultado, apresentado no dendrograma da Figura 5, mostra que o algoritmo utilizado conseguiu diferenciar os três espectros. Esse resultado demonstra que, mesmo nos casos em que os espectros de diferentes micro-organismos apresentem o mesmo aspecto visual, a análise estatística multivariada pode ser potencialmente útil para diferenciar os espectros desses micro-organismos (Essendoubi et al., 2005; Naumann, 2000; Timmins et al., 1998; Tintelnot et al., 2000; Toubas et al., 2007).

Um bom teste para qualquer algoritmo estatístico é tomar um conjunto de dados com uma estrutura de agrupamento conhecida e verificar se o algoritmo é capaz de reproduzir essa estrutura. Com relação aos espectros de Candida albicans, Candida dubliniensis e Candida parapsilosis, a banda de amida I foi analisada através de um método não-estatístico, com base em conhecimento a respeito de estruturas secundárias de proteínas.

Ajuste de curva

As estruturas secundárias de proteínas se refletem nas bandas de amida I e amida II. No entanto, na de amida II, surgem muitas vezes misturadas as bandas de aminoácidos residuais. Assim, a amida I que corresponde às vibrações de estiramento de C=O do grupo peptídico é mais utilizada para análise de estruturas secundárias de proteínas (Barth, 2007; Byler e Susi, 1986; Stuart, 1997; Surewicz e Mantsch, 1988; Twardowski e Anzenbacher, 1994).

Os espectros no infravermelho entre 1590 a 1710 cm^–1 dos três micro-organismos são visualmente semelhantes apresentando um contorno com máximo em 1651 cm^–1 acompanhado de um pequeno ombro (vide Figura 1).

Muitos autores (Byler e Susi, 1986; Grdadolnik, 2002; Stuart, 1997) indicam o método de ajuste de curva da banda de amida I como um dos melhores métodos para estimar a estrutura secundária. Os parâmetros necessários para o ajuste tais como número e posição de bandas, são obtidos pela segunda derivada dos espectros (Stuart, 1997). As posições destas bandas servem de parâmetros de entrada para ajuste de curva para a banda de amida I original.

As Figuras 6-9 apresentam as áreas dos componentes da amida I e a decomposição da banda da amida I em seus componentes lorentzianos, para os três micro-organismos.

As frações das áreas dos componentes de amida I são mostradas na Tabela 3.

Observamos que as posições de números de ondas dos componentes de amida I entre os micro-organismos são muito próximas, mas suas áreas assumem valores diferentes. Como a área se relaciona com a população, o resultado de cálculos indica quantidades diferentes de estruturas secundárias nos três micro-organismos. Por exemplo, a banda de amida I de Candida parapsilosis referente à conformação parallel β – sheet (β – folha paralela) não é observada e a de Candida albicans é muito reduzida. Na Candida dubliniensis, todas as conformações estão presentes e a maior área corresponde a turns & bends (voltas/dobras), ao passo que na Candida albicans, a maior área corresponde a antiparallel β – sheet (β – folha antiparalela) e para Candida parapsilosis, random coil (ao acaso).

Os resultados confirmam a discriminação dos espectros obtida através da análise estatística multivariada.

Conclusão

Os espectros infravermelhos de Candida albicans, Candida dubliniensis e Candida parapsilosis foram analisados por inspeção visual direta, através da análise estatística multivariada e através do método de ajuste de curva. Os resultados e conclusões tiradas deste trabalho são:

• Os espectros apresentam, na região de 1200 a 1000 cm

  ^–1, diferenças que podem ser percebidas numa inspeção visual direta. As bandas da amida I na região de 1710 a 1590 cm

  ^–1 apresentam o aspecto visual semelhante nos espectros dos três micro-organismos. É necessário, portanto, submeter a análise estatística multivariada a um teste de sua capacidade para diferenciar espectros de micro-organismos;

• Análises estatísticas multivariadas baseadas em análise por componentes principais (

  PCA,

  Principal Component Analysis),

  com a utilização dos quatro primeiros componentes principais e análise de agrupamento (

  HCA,

  Hierarchial Clustering Analysis) com o uso do algoritmo

  Ward, foram aplicadas aos 54 espectros para investigar as regiões de 4000 a 1000 cm

  ^–1 com exceção da região de 2600 a 2300 cm

  ^–1 e de 1710 a 1590 cm

  ^–1 que corresponde a das bandas da amida I. Os resultados mostram uma clara discriminação entre os três micro-organismos em ambas as análises; e

• O método do ajuste de curva que não é estatístico é aplicado a essas bandas de amida I para determinação de estruturas secundárias de proteínas. Os resultados obtidos indicam quantidades diferentes de estruturas secundárias nos três micro-organismos, confirmando a discriminação feita pela análise estatística multivariada. Esse estudo mostra o potencial desta técnica para diferenciação de micro-organismos através de seus espectros infravermelhos.

Além disso, as bandas da amida I dos espectros infravermelhos, dos três micro-organismos investigados, fornecem um conjunto de dados cuja estrutura de agrupamento é conhecida e que pode ser útil para testar algoritmos estatísticos de análise de agrupamento.

O método estatístico apresentado neste trabalho pode ser aplicado a outros algoritmos de análise de agrupamento que se pretenda testar e utilizar para a discriminação de micro-organismos através de seus espectros infravermelhos.

Agradecimentos

Um dos autores (P. M. S.) agradece pela bolsa de estudos concedida pela CAPES.

Recebido: 24/03/2012

Aceito: 18/07/2012

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Jan 2013
• Data do Fascículo
  Dez 2012

Histórico

• Recebido
  24 Mar 2012
• Aceito
  18 Jul 2012