Anticorpos antileucotoxina contra Actinobacillus actinomycetemcomitans em amostras de soro e saliva de pacientes com periodontite juvenil localizada

Anti-leukotoxin antibodies against Actinobacillus actinomycetemcomitans in serum and saliva samples from patients with localized juvenile periodontitis

Microbiologia

Anticorpos antileucotoxina contra Actinobacillus actinomycetemcomitans em amostras de soro e saliva de pacientes com periodontite juvenil localizada^†

Anti-leukotoxin antibodies against Actinobacillus actinomycetemcomitans in serum and saliva samples from patients with localized juvenile periodontitis

Roberto Issamu NAKAGAWA^*

Valéria H. GUAZELI-AMIN^**

Mirian Marubayashi HIDALGO^***

Wilson TREVISAN Jr.^****

Eiko Nakagawa ITANO ^****

NAKAGAWA, R. I.; GUAZELI-AMIN, V. H.; HIDALGO, M. M.; TREVISAN Jr., W.; ITANO, E. N. Anticorpos antileucotoxina contra Actinobacillus actinomycetemcomitans em amostras de soro e saliva de pacientes com periodontite juvenil localizada. Pesqui Odontol Bras, v. 15, n. 1, p. 5-11, jan./mar. 2001.

A leucotoxina de Actinobacillus actinomycetemcomitans é considerada seu principal fator de virulência com potencial de causar agressão às defesas do hospedeiro. No presente trabalho, foram analisados os níveis séricos e salivares de anticorpos antileucotoxina de A. actinomycetemcomitans em soros e salivas de pacientes com periodontite juvenil localizada (PJL) e controles saudáveis. Adicionalmente, foi realizada a análise de complexo imune (CI) nas amostras de saliva. Foram utilizados os métodos ELISA clássico com a leucotoxina obtida por gel filtração em Sephadex G-200 e ELISA de captura utilizando IgG de coelho anti-A. actinomycetemcomitans FDC Y4 leucotóxico adsorvido com uma cepa da mesma espécie, porém, não leucotóxica. Os resultados obtidos demonstraram níveis séricos de IgG significativamente mais elevados em pacientes com PJL em relação aos controles sadios, tanto por ELISA clássico como por ELISA de captura (p < 0,05). No entanto, não foram observadas diferenças entre os níveis de IgG, IgA-S e CI nas salivas dos indivíduos examinados. Estes resultados sugerem que, embora A. actinomycetemcomitans apresente vários fatores de virulência que afetam a resposta imune do hospedeiro, ocorre resposta imune à leucotoxina nos pacientes com PJL. Esse aumento de IgG na circulação sangüínea pode contribuir na defesa do hospedeiro, limitando a lesão nas regiões periodontais amplamente colonizadas por A. actinomycetemcomitans.

UNITERMOS: Imunoglobulinas; Periodontite juvenil localizada; Actinobacillus actinomycetemcomitans; ELISA; Complexo antígeno-anticorpo.

INTRODUÇÃO

A periodontite juvenil localizada (PJL) é uma forma de periodontite caracterizada pela rápida progressão afetando, em especial, os primeiros molares e incisivos. Os pacientes apresentam anormalidades nos neutrófilos polimorfonucleares (PMN)^2,6,11 e freqüentemente a doença está associada à presença de Actinobacillus actinomycetemcomitans^1,24.

Entre os vários fatores biologicamente ativos produzidos pelo A. actinomycetemcomitans que podem interferir no mecanismo de defesa do hospedeiro, existe uma leucotoxina que apresenta massa molecular de 115 a 180 kDa²³, capaz de destruir especificamente PMN e monócitos humanos^6,20. Os produtos da lise celular liberados contribuem para a lesão tecidual e a diminuição dos monócitos acarreta alteração da resposta imune ao agente infeccioso^10,18,19.

Por outro lado, as propriedades leucotóxicas de A. actinomycetemcomitans podem ser moduladas pelo soro humano e animal^14,23,25,26 e tem sido relatado por alguns autores aumento nos níveis de anticorpos específicos em pacientes com periodontites^13,26. Todavia, os dados encontrados na literatura são conflitantes^7,17,21. Em amostras de saliva, HIDALGO et al.⁷, corroborado por MONCADA et al.¹⁵ e RUBIRA et al.¹⁶, não observaram diferenças entre pacientes e controles.

Considerando-se a importância da leucotoxina como um dos principais fatores de agressão ao hospedeiro e a capacidade de modulação pelo soro humano de sua atividade, o presente trabalho teve como objetivo verificar os níveis séricos e salivares de anticorpos antileucotoxina de A. actinomycetemcomitans em pacientes com PJL e controles. Adicionalmente, investigou-se a presença de complexos imunes (CI) contendo anticorpos específicos para este microrganismo na saliva.

MATERIAL E MÉTODOS

Pacientes e indivíduos saudáveis

Dez pacientes da Clínica de Periodontia, do Departamento de Medicina Oral e Odontologia Infantil da UEL, apresentando evidências clínicas e radiográficas de perda óssea alveolar localizada nos primeiros molares e incisivos permanentes com envolvimento de, no máximo, 14 dentes foram selecionados. Seis indivíduos pertenciam ao sexo feminino e 4 ao masculino, com idades entre 15 e 30 anos. Como controles, foram selecionados 10 indivíduos sadios sem evidência clínica ou radiográfica de doença periodontal e com idade e sexo semelhantes à população em estudo. Ninguém havia estado em tratamento com antibióticos durante os 3 meses anteriores à coleta de material e todos assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido após informação. Este estudo foi aprovado pela Comissão de Bioética da Universidade Estadual de Londrina.

Obtenção das amostras de saliva e soro

A obtenção das amostras de saliva e soro foi realizada segundo o descrito por HIDALGO et al.⁷ e, depois de aliquotadas, foram armazenadas a –20ºC.

Obtenção do extrato de A. actinomycetemcomitans

As amostras de A. actinomycetemcomitans FDC Y4 foram obtidas segundo o descrito por HIDALGO et al.⁸. Posteriormente, foi realizada a determinação de proteínas a partir do sobrenadante segundo método Folin descrito por LAYNE¹² e os extratos foram aliquotados e armazenados a –80ºC.

Obtenção da leucotoxina de A. actinomycetemcomitans FDC Y4

Segundo GUAZELI-AMIN⁵, amostra de extrato sonicado da cepa A. actinomycetemcomitans FDC Y4 (1,4 mg de proteína/ml) foi aplicada em coluna de Sephadex G-200 (2 x 50 cm) e as frações obtidas foram analisadas em espectrofotômetro a 280 nm.

Obtenção de IgG de coelho anti-extrato sonicado de A. actinomycetemcomitans FDC Y4

Amostra de extrato sonicado de A. actinomycetemcomitans FDC Y4 (150 mg/ml) foi emulsificada com adjuvante incompleto de Freund e aplicada por via subcutânea em três doses, com intervalos de 15 dias, em coelhos jovens, machos, pesando aproximadamente 3,5 kg. Após a sangria de prova e titulação do soro por imunodifusão dupla, realizou-se a sangria branca. A amostra de soro imune obtida foi passada na coluna de Sepharose-proteína G para purificação de IgG e, em seguida, adsorvida por 1 h a 37ºC e 18 h a 4ºC v/v, com 1,6 mg/ml de isolados de A. actinomycetemcomitans denominados de E8 e E10 previamente testados e considerados não leucotóxicos⁵.

Adsorção do conjugado anti-IgG humana peroxidase

Para adsorção do conjugado anti-IgG humana marcado com peroxidase, inicialmente foi obtido complexo IgG de coelho Sepharose-proteína G. A amostra de soro normal de coelho (3 ml) foi passada na coluna de Sepharose-proteína G (1,0 ml) e, após exaustivas lavagens com PBS, 10 ml (1/1.000) de conjugado IgG de camundongo anti-IgG humana foram passados 3 vezes na mesma coluna. Esse conjugado adsorvido na diluição final aproximada de 1/2.000 foi utilizado para detecção de complexos imunes.

Análise de IgG e IgA-S antileucotoxina de A. actinomycetemcomitans nas amostras de soro e saliva por ELISA clássico

A placa de ELISA foi sensibilizada com a leucotoxina obtida através de gel filtração (fração I - 8,7 mg/ml) diluída em tampão carbonato-bicarbonato (0,1 N) em um volume final de 200 ml (v/v) e incubada durante uma hora a 37ºC seguida de uma noite a 4ºC. Após esse período, a placa foi bloqueada com leite desnatado 5% e Tween 20 a 0,5% em PBS por 1 h seguida de quatro lavagens em PBS-Tween-leite. As amostras de soro (1/200) ou saliva (1/10) dos grupos estudados foram incubadas por 1 h. Posteriormente, a placa foi novamente lavada e incubada com conjugado anti-IgG humana peroxidase (1/2.000 – Sigma, EUA) por 1 h. Para a análise de IgA-S, foi utilizada IgG de camundongo antipeça secretora de IgA humana (1/5.000 – Sigma, EUA) seguida de conjugado anti-IgG de camundongo peroxidase (1/8.000 – Sigma, EUA) e solução de ortofeniletilenodiamine di-hidrocloreto, sendo a leitura realizada a 492 nm (Multiskan).

Análise de IgG antileucotoxina de A. actinomycetemcomitans nas amostras de soro e saliva por ELISA de captura

Foi utilizada a mesma metodologia descrita para o ELISA clássico, porém, as placas de ELISA foram inicialmente tratadas com IgG de coelho anti-A. actinomycetemcomitans FDC Y4 adsorvida com cepa da mesma espécie não leucotóxica, para subseqüentemente serem sensibilizadas com o extrato sonicado de A. actinomycetemcomitans FDC Y4 (50 mg/ml).

Análise de imunocomplexos em amostras de saliva

Utilizando-se a mesma metodologia descrita para o ELISA clássico, as placas de ELISA foram sensibilizadas com a IgG de coelho anti-A. actinomycetemcomitans FDC Y4 adsorvida com cepa da mesma espécie não leucotóxica. Após bloqueio, as placas foram tratadas com amostras de saliva e a seguir com o conjugado IgG de camundongo anti-IgG humana-peroxidase adsorvida com IgG de coelho.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada pelo testes ANOVA e t de Student, considerando-se estatisticamente significantes os resultados com valores p < 0,05.

RESULTADOS

Obtenção da leucotoxina de A. actinomycetemcomitans

A cromatografia do extrato sonicado de A. actinomycetemcomitans FDC Y4 em coluna de Sephadex G-200 resultou em dois picos com absorção a 280 nm (Gráfico 1). As amostras pertencentes ao primeiro pico foram agrupadas em um "pool" denominado fração I. Esta foi analisada quanto à sua pureza através de eletroforese em gel de poliacrilamida e quanto à sua atividade leucotóxica através da dosagem de lactato desidrogenase (LDH) citoplasmática liberada por células P3UI (mieloma de camundongo) com ela incubadas⁵.

Análise de IgG sérica antileucotoxina

Os resultados das médias de densidades ópticas (DO) a 492 nm dos ensaios com soros de pacientes com PJL (n = 10) foram de 0,81 ± 0,17 para ELISA clássico e 0,21 ± 0,03 para ELISA de captura. Para os soros controles, a média foi de 0,53 ± 0,16 e 0,09 ± 0,01, respectivamente. As diferenças entre pacientes e controles foram estatisticamente significantes (p < 0,05) nos dois testes (Gráfico 2).

Análise de IgG salivar antileucotoxina

Nos ensaios com salivas de pacientes com PJL (n = 10), os resultados das médias de DO a 492 nm foram de 0,13 ± 0,04 para ELISA clássico e 0,20 ± 0,04 para ELISA de captura. Com as salivas dos controles saudáveis, a média foi de 0,09 ± 0,02 e 0,18 ± 0,04, respectivamente. Nenhuma diferença foi observada entre pacientes e controles nos dois testes (Tabela 1).

Análise de IgA-S salivar antileucotoxina

A comparação entre as médias não apresentou diferença estatística, sendo de 0,10 ± 0,05 para pacientes com PJL e 0,09 ± 0,02 para controles (Tabela 1).

Análise de complexos imunes

Como apresentado na Tabela 1, as médias dos resultados da análise de CI foram de 0,09 ± 0,03 e 0,09 ± 0,02, respectivamente para as salivas de pacientes com PJL e controles, não apresentando portanto nenhuma diferença estatisticamente significante.

DISCUSSÃO

Há na literatura controvérsias quanto aos níveis séricos de imunoglobulinas específicas para A. actinomycetemcomitans em pacientes com PJL. Enquanto alguns autores demonstraram um aumento nos níveis de anticorpos em pacientes com periodontites^13,26, outros não encontraram diferenças^17,21. HIDALGO et al.⁷ sugeriram que a ausência de anticorpos poderia ser decorrente da falta de uma resposta imune específica devido à atividade da leucotoxina e/ou do(s) fator(es) supressor(es) presente(s) em A. actinomycetemcomitans, ou ainda devido ao mecanismo de tolerância já que A. actinomycetemcomitans pertence à microbiota normal da boca.

Um dos fatores de virulência de A. actinomycetemcomitans relacionado com a PJL é a leucotoxina. Para se certificar de que os anticorpos detectados em pacientes com PJL são de fato contra a leucotoxina, é necessária a sua utilização na forma purificada. No entanto, foi verificado que a atividade leucotóxica declina significativamente no processo de purificação, sendo observada atividade muito menor na fração obtida por gel filtração seguida de refracionamento em coluna de troca iônica⁵. A perda substancial da atividade biológica da leucotoxina também foi descrita por DiRIENZO³ em processos de purificação por cromatografia de afinidade utilizando anticorpos monoclonais. Por isso, no presente trabalho, foi utilizada a leucotoxina semipurificada em coluna de Sephadex G-200 (fração I).

Os resultados de ELISA clássico utilizando a leucotoxina demonstraram um nível sérico de IgG significativamente maior em soros de pacientes com PJL em relação aos soros controles. Os resultados também demonstraram níveis de IgG significativamente maiores nos soros de pacientes com PJL, quando analisados por ELISA de captura. Possivelmente, por ser uma fração semipurificada, contendo antígenos mais específicos como a leucotoxina, foi possível discriminar os grupos de pacientes e controles.

As IgGs do soro também podem estar presentes na saliva²². O aumento do nível sérico de IgG não foi acompanhado pelo aumento no nível salivar de IgG em pacientes com PJL, concordando com alguns relatos da literatura^7,16.

Além de IgG, a IgA secretora produzida na mucosa é importante contra a colonização ou invasão de microrganismos por meio de sua ação neutralizante⁹. Por isso, foi analisado, no presente trabalho, o nível de IgA-S em amostras de saliva dos grupos estudados, mas não foi demonstrada diferença significativa. Este resultado poderia ser devido à formação de complexos imunes, conseqüentemente bloqueando o sítio combinatório da Ig. Assim, foi analisado adicionalmente o nível de CI nestas amostras de saliva.

Os resultados obtidos não demonstraram diferenças entre o nível de CI em amostras de saliva de pacientes com PJL e controles saudáveis. Por isso, a ausência de anticorpos específicos na saliva poderia ser explicada pela pequena amostragem analisada, diferenças de cepas regionais de A. actinomycetemcomitans, reações cruzadas em decorrência da utilização de leucotoxina semi-purificada, ausência de resposta imune localizada na mucosa oral, ou ainda pela degradação das Igs. Nesse sentido, GREGORY et al.⁴ encontraram, em sobrenadante de cultura de A. actinomycetemcomitans, enzimas proteolíticas que foram capazes de clivar in vitro IgG, IgA e IgM. Os autores também mostraram uma intensa degradação de IgG e IgA em amostras de fluido gengival de pacientes com PJL em comparação com indivíduos com periodonto saudável.

Os resultados obtidos sugerem que, embora A. actinomycetemcomitans apresente vários fatores de virulência que afetam a resposta imune do hospedeiro, resposta imune humoral à leucotoxina pode ser demonstrada na PJL. O aumento de IgG na circulação sangüínea pode contribuir na defesa do hospedeiro limitando a lesão às regiões periodontais amplamente colonizadas por A. actinomycetemcomitans.

CONCLUSÕES

1. Embora A. actinomycetemcomitans apresente atividade leucotóxica para monócitos humanos, ocorre resposta imune para a leucotoxina em pacientes com PJL, com aumento de IgG na circulação sangüínea.

2. Não foi observada diferença estatisticamente significante nos níveis salivares de IgG e IgA-S antileucotoxina em pacientes com PJL e indivíduos saudáveis e este resultado não se deve à formação de complexos imunes na saliva.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem aos técnicos Mário Sumigawa Kaminami e Nilson de Jesus Carlos, pela excelente colaboração durante todo o desenvolvimento do trabalho e aos órgãos financiadores CPG/UEL e PROUNI/CCS/UEL.

NAKAGAWA, R. I.; GUAZELI-AMIN, V. H.; HIDALGO, M. M.; TREVISAN Jr., W.; ITANO, E. N. Anti-leukotoxin antibodies against Actinobacillus actinomycetemcomitans in serum and saliva samples from patients with localized juvenile periodontitis. Pesqui Odontol Bras, v. 15, n. 1, p. 5-11, jan./mar. 2001.

The leukotoxin produced by Actinobacillus actinomycetemcomitans is considered the major virulence factor with potential to cause damage to the host defenses. The present work analyzed the serumal and salivary levels of antibodies against the leukotoxin produced by A. Actinomycetemcomitans, in patients with Localized Juvenile Periodontitis (LJP) and in healthy controls. Additionally, analysis of the immune complex (IC) was carried out in saliva samples . The classic ELISA method, with leukotoxin obtained through Sephadex G-200 gel filtration, and the capture ELISA method, using rabbit anti-A. Actinomycetemcomitans (leucotoxic, FDC Y4, IgG) adsorbed with a non-leukotoxic strain of A. actinomycetemcomitans, were used. The results obtained demonstrated significantly higher serumal levels of IgG in patients with LJP, when they were compared with the healthy controls, both for the classic and capture ELISA methods (p < 0.05). However, no significant differences were observed between the salivary levels of IgG, SIgA and IC in the examined individuals. These results suggest that even though A. actinomycetemcomitans presents virulence factors that affect the immune response, there is immune response to leukotoxin in LJP patients. This increase of IgG in the blood stream might contribute to host defense, limiting the lesion to the periodontal regions already colonized by A. actinomycetemcomitans.

UNITERMS: Immunoglobulins; Localized juvenile periodontitis; Actinobacillus actinomycetemcomitans; Enzyme-linked immunosorbent assay; Antigen-antibody complex.

Recebido para publicação em 22/03/2000

Enviado para reformulação em 29/11/2000

Aceito para publicação em 23/01/2001

* Pós-graduando em Microbiologia; ** Professora Assistente; **** Professores Adjuntos – Universidade Estadual de Londrina - UEL.

Apoio financeiro da CPG/UEL e PROUNI/CCS/UEL.

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†

Parte de Dissertação de Mestrado.

***

Professora Assistente – Universidade Estadual de Maringá - UEM.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Abr 2001
• Data do Fascículo
  Mar 2001

Histórico

• Aceito
  23 Jan 2001
• Recebido
  22 Mar 2000
• Revisado
  29 Nov 2000