Infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi em camundongos: influência do exercício físico versus linhagens e sexos

Resumos

BACKGROUND: Chagas disease is an infection caused by Trypanosoma cruzi that affects eight million people in Latin America. One factor linked to the lifestyle that significantly interferes in the response to infection is physical exercise, depending on the kind, intensity and frequency of the activity practiced. OBJECTIVE: To evaluate the influence of pre-infection chronic moderate aerobic exercise in the development of experimental infection with T. cruzi in mice of two distinct lineages from both sexes. METHODS: 30-day old Swiss and BALB/c mice (male and female) were divided into four groups for each strain and sex (total 16) and named as follows: SM (Swiss males), SF (Swiss females) BM (BALB/c mice) and BF (BALB/c mice). The groups were: NT NI (untrained uninfected) T NI (trained not infected); NT I (untrained infected), TI (trained infected). The aerobic exercise pre-moderate chronic infection training was performed with one daily session for eight weeks, five times a week. The inoculum was 1,400 blood trypomastigotes of Y strain of T. cruzi intraperitoneally. The peak of parasites, parasitemia total and average measurements of the serum activities of CK and CK-MB were evaluated. RESULTS AND CONCLUSIONS: The physical training promoted reduction in peak, parasitemia parasites and total average in animals infected with T. cruzi in both strains and sexes. Physical training induced reduction in serum activities of CK and CK-MB in animals infected with T. cruzi of both sexes and from the two strains, except for females in the Swiss CK activity.

physical training; Trypanosoma cruzi; creatine kinase (CK); creatine kinase-MB (CK-MB); parasite

ARTIGO ORIGINAL

CIÊNCIAS DO EXERCÍCIO E DO ESPORTE

Infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi em camundongos: influência do exercício físico versus linhagens e sexos

Roberta Cristhiany Occhi Soares^I; Cristiano Schebeleski Soares^II; Solange Marta Franzói-de-Moraes^III; Márcia Regina Batista^IV; Heloisa Nakai Kwabara^IV; André Morelli Rodrigues de Sousa^V; Neide Martins Moreira^I; Mônica Lúcia Gomes^VI; Silvana Marques de Araújo^VI

^IPrograma de Pós-Graduação em Ciências da Saúde – Universidade Estadual de Maringá, PR, Brasil

^IIDepartamento de Educação Física – Centro Universitário de Maringá, PR, Brasil

^IIIDepartamento de Ciências Fisiológicas – Universidade Estadual de Maringá, PR, Brasil

^IVDepartamento de Análises Clínicas – Universidade Estadual de Maringá, PR, Brasil

^VDepartamento de Odontologia – Universidade Estadual de Maringá, PR, Brasil

^VIDepartamento de Ciências Básicas da Saúde – Universidade Estadual de Maringá, PR, Brasil

^{Correspondência}

RESUMO

INTRODUÇÃO: A doença de Chagas é uma infecção causada pelo Trypanosoma cruzi que afeta oito milhões de pessoas na América Latina. Um fator ligado ao estilo de vida que interfere significativamente na resposta à infecção é o exercício físico, dependendo do tipo, intensidade e frequência da atividade praticada.

OBJETIVO: Avaliar a influência do exercício físico aeróbio moderado crônico pré-infecção na evolução da infecção experimental pelo T. cruzi em camundongos de duas linhagens distintas pertencentes aos dois sexos.

MÉTODOS: Camundongos Swiss e BALB/c (machos e fêmeas) com 30 dias de idade foram divididos em quatro grupos para cada linhagem e sexo (total de 16) e nomeados como segue: SM (Swiss machos), SF (Swiss fêmeas), BM (BALB/c machos) e BF (BALB/c fêmeas). Os grupos foram: NT+NI (não treinado+não infectado), T+NI (treinado+não infectado), NT+I (não treinado+infectado) e T+I (treinado+infectado). O programa de exercício físico aeróbio moderado crônico pré-infecção foi realizado durante oito semanas, com uma sessão diária de treinamento, cinco vezes na semana. O inóculo foi de 1.400 tripomastígotas sanguíneos da cepa Y do T. cruzi, via intraperitoneal. Foi avaliado o pico de parasitos, parasitemia total média e as medidas das atividades séricas de CK e CK-MB.

RESULTADOS E CONCLUSÃO: O treinamento físico promoveu nas duas linhagens e em ambos os sexos redução no pico de parasitos e na parasitemia total média em animais infectados pelo T. cruzi. O treinamento físico promoveu redução nas atividades séricas de CK e CK-MB em animais infectados pelo T. cruzi, de ambos os sexos, das duas linhagens, exceto para fêmeas Swiss na atividade de CK e CK-MB.

Palavras-chave: treinamento físico, Trypanosoma cruzi, creatina quinase (CK), creatina quinase-MB (CK-MB), parasitemia.

INTRODUÇÃO

A doença de Chagas é uma infecção causada pelo Trypanosoma cruzi que afeta oito milhões de pessoas na América Latina¹. Um fator ligado ao estilo de vida que interfere significativamente na resposta à infecção é o exercício físico, dependendo do tipo, intensidade e frequência da atividade praticada^2,3.

A literatura tem referido que uma ou poucas sessões de exercício, quer seja realizado em intensidade moderada quer seja extenuante ou de longa duração, inibem linfócitos T helper do tipo 1 (Th1), de caráter inflamatório, e estimulam linfócitos T helper do tipo 2 (Th2), de caráter anti-inflamatório⁴. A diferença entre a intensidade de realização do exercício reside no fato de que o exercício físico moderado, mesmo durante a infecção, pode não alterar ou melhorar a resposta imunológica do hospedeiro, tanto em infecções virais⁵ quanto em infecções parasitárias^3,6, enquanto que o exercício extenuante promove maior risco para o desenvolvimento de infecções⁷ e piora a resposta imunológica do hospedeiro⁸.

Um estudo recente utilizando programa de treinamento físico com intensidade moderada para camundongos BALB/c concluiu que o exercício crônico é capaz de melhorar a resposta do organismo à infecção pelo Trypanosoma cruzi, diminuindo significativamente o pico de parasitos e aumentando a sobrevida³.

A diferença da resposta entre sexos também é um fator que afeta a relação entre exercício e infecção. Na maioria dos estudos com doenças parasitárias, inclusive com o T. cruzi, os hormônios sexuais femininos aparecem relacionados diretamente com uma melhor resposta do organismo à infecção, enquanto os hormônios sexuais masculinos aparecem associados a um aumento de suscetibilidade⁹. Em roedores, a ovariectomia esteve relacionada a uma menor resistência de fêmeas à infecção pelo T. cruzi¹⁰, enquanto a orquiectomia se relacionou com uma melhora da resposta de machos à infecção^11,12. Nas infecções por vírus o estrogênio possui atividade de redução da resposta pró-inflamatória e de estimulação da resposta anti-inflamatória, que está ligada a uma melhor resposta à infecção¹³.

A creatina fosfoquinase (CPK) é uma grande proteína encontrada em duas ou mais formas. Estas formas – isoenzimas diméricas – são constituídas por duas subunidades polipeptídicas distintas, M e B. Três isoenzimas de CPK são naturalmente encontradas em tecidos humanos: CK-MM (músculo esquelético), CK-MB (músculo cardíaco) e CK-BB (cérebro)^14,15.

Devido ao tamanho restritivo das CKs que as impede de serem liberadas do tecido hospedeiro para a corrente sanguínea, salvo em caso de lesão da membrana, a presença destas proteínas no soro é utilizada para diagnosticar e avaliar os danos celulares causados por fatores tais como doenças ou exercício físico. Assim, CK e CK-MB são as enzimas mais amplamente utilizadas como marcadores no diagnóstico da lesão do miocárdio e músculo esquelético¹⁶.

Na infecção experimental pelo T. cruzi foi observada uma correlação positiva entre os níveis plasmáticos de CK-MB e os infiltrados inflamatórios e uma não correlação desta enzima com os ninhos de parasitos. Tais informações sugerem que as lesões no miocárdio ocorrem em função da resposta inflamatória e não do efeito direto do T. cruzi e que a medida da atividade da CK-MB pode ser usada como um marcador de lesão cardíaca¹⁷.

Na literatura não são encontradas referências que avaliam a relação da atividade de CK e CK-MB, T. cruzi, exercício físico, diferença entre sexos e linhagens em camundongos ou ratos. As informações obtidas são encontradas em trabalhos comparando somente duas das três variáveis e, em alguns casos, utilizando outro tipo de intervenção e/ou tratamento.

O estudo da influência do exercício físico aeróbio na evolução da infecção experimental pelo T. cruzi relacionando sexo, atividade de CK e CK-MB e genética do hospedeiro apresenta inúmeros pontos interessantes que podem ser elucidados, trazendo novas informações tanto com relação ao exercício em si como novas alternativas para o tratamento e qualidade de vida de pacientes infectados pelo T. cruzi.

Diante do apresentado, a proposta deste trabalho foi avaliar a influência do exercício físico moderado na evolução da infecção experimental pelo T. cruzi em camundongos de duas linhagens distintas pertencentes aos dois sexos.

MATERIAIS E MÉTODOS

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Conduta Ética no Uso de Animais em Experimentação (CEAE/UEM) sob o parecer 076/2008.

Animais

Foram utilizados camundongos das linhagens Swiss e BALB/c (machos e fêmeas), com aproximadamente 30 dias de idade. Quatro grupos para cada linhagem e sexo (total de 16) foram constituídos para a realização dos experimentos: NT+NI (não treinado+não infectado), T+NI (treinado+não infectado), NT+I (não treinado+infectado) e T+I (treinado+infectado) (tabela 1).

Os animais foram acondicionados em caixas de polipropileno (dimensão 414 x 344 x 168mm) tampadas com grade zincada com depressão central para deposição da ração e para garrafa de água. As caixas foram mantidas em biotério climatizado (temperatura entre 22 e 24ºC) com ciclo claro/escuro de 12 horas, forradas com maravalha e limpas três vezes na semana, com água (clorada) e ração (Nuvilab Cr-1^® da Nuvital^®) disponíveis ad libitum.

Para avaliar a evolução da infecção, 50% dos animais foram sacrificados no oitavo dia de infecção e a outra metade foi mantida viva para o acompanhamento da parasitemia.

Protocolo de exercício físico

Os animais foram submetidos ao exercício físico aeróbio moderado crônico pré-infecção em esteira rolante (Inbrasport^® modelo Classic CI^®) com adaptador para treinamento de animais de pequeno porte e com um sistema que permite a programação das sessões de treinamento e controle digital da velocidade com sensibilidade de dois metros por minuto (m/min). O protocolo de exercício físico utilizado corresponde a um esforço moderado^3,18. Não foram utilizados mecanismos de choque ou similares para induzir o animal a se exercitar. Foi considerado um período inicial de uma semana de treinamento para excluir animais considerados inaptos para o exercício físico.

O programa de exercício físico foi realizado durante oito semanas, sendo composto por uma sessão diária de treinamento, cinco vezes na semana, com duração de 30 a 45 minutos com velocidade de seis a 14m/min na primeira semana, 45 a 60 minutos e velocidade de oito a 16m/min na segunda semana e 60 minutos com velocidade de 10 a 20m/min nas demais (velocidade média de 13m/min nas quatro primeiras semanas e de 17,5m/min nas quatro últimas).

Infecção

O inóculo utilizado foi de 1.400 formas tripomastígotas sanguíneos da cepa Y do T. cruzi¹⁹, via intraperitoneal. Os animais foram infectados três dias após o término do programa de exercício físico crônico pré-infecção.

Curva de parasitemia

A parasitemia foi avaliada utilizando a técnica de Brener²⁰ retirando 5µL de sangue da cauda e examinando-se 50 campos entre lâmina e lamínula (22mm x 22mm), diariamente, do quarto ao 11º dia de infecção. A curva de parasitemia foi traçada utilizando a média da contagem de parasitos dos animais inoculados para cada grupo.

Coleta de material biológico

No oitavo dia de infecção, 50% dos animais foram sacrificados por meio do aprofundamento da anestesia inalatória com éter etílico (etoxietano). Posteriormente, foi realizada punção cardíaca para coleta de sangue. Com uma seringa heparinizada era obtido cerca de 1mL de sangue para camundongos BALB/c e de 2mL de sangue para camundongos Swiss. Em tubos de ensaio (tipo hemólise) o sangue foi mantido em banho de gelo até ser centrifugado a 2.000 RPM, o sobrenadante retirado e centrifugado a 4.000 RPM, em centrífuga refrigerada a 4ºC e em seguida dividido em alíquotas de 85μL em tubos tipo Eppendorf, sendo congelado a –70ºC para avaliar a medida das atividades séricas de CK e CK-MB.

Determinação das atividades séricas de CK E CK-MB

Para a análise foram utilizados os kits comerciais para dosagem de CK-NAC FS IFCC e CK-MB FS, ambos fabricados por DiaSys Diagnostic Systems GmbH & Go. KG, importados e distribuídos por Biosys Ltda. Para realização dos testes utilizou-se do aparelho Selectra E, um analisador automático bioquímico fotométrico. O método de leitura deste aparelho é feito através de teste UV otimizado de acordo com DGKC (Sociedade Germânica de Química Clínica) e IFCC (Federação Internacional de Química Clínica) expressando os resultados em U/I.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

As comparações estatísticas foram realizadas através do programa Assistat versão 7.5 (disponibilizado pela Universidade Federal de Campina Grande, Brasil), utilizando-se de análise de variância (ANOVA), seguido do teste de Tukey (para resultados que apresentaram normalidade), teste de Mann-Whitney (teste U) (para resultados da parasitemia que não apresentaram normalidade), teste de Kruskal-Wallis (para os demais resultados que não apresentaram normalidade), e também o programa Microsoft Excel, versão 2007 (Microsoft). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão, sendo adotado nível de significância de 10%.

RESULTADOS

Tanto na linhagem Swiss quanto na BALB/c, para ambos os sexos, os grupos treinados e infectados (T+I) apresentaram pico de parasitos menor que seus respectivos controles (NT+I). A diferença foi significativa para machos Swiss e fêmeas BALB/c (figuras 1 e 2).

Nas figuras 3 e 4 pode ser observado que o pico de parasitos foi estatisticamente maior em animais BALB/c machos do grupo treinado e infectado (T+I) que em animais Swiss do mesmo sexo (p < 0,10). Para a comparação de fêmeas, o pico de parasitos foi maior em animais Swiss (SF e BF/T+I) (p < 0,05). Fêmeas Swiss (SF) treinadas e infectadas (T+I) apresentaram maior pico de parasitos que machos da mesma linhagem e grupo (SM/T+I) (p < 0,05).

A parasitemia total média foi estatisticamente menor para camundongos da linhagem Swiss, de ambos os sexos, pertencentes ao grupo treinado e infectado (T+I) (tabela 2).

Para animais machos não treinados e infectados (NT+I), a parasitemia total média foi maior para a linhagem Swiss (p < 0,10). Entre camundongos fêmeas, a parasitemia total média também foi estatisticamente maior para a linhagem Swiss do grupo não treinado e infectado (SF/NT+I – p < 0,05). Para os grupos treinados e infectados (SF e BF/ T+I), a parasitemia foi maior para a linhagem BALB/c (p < 0,05) (figura 5).

Para animais treinados e infectados (T+I), a comparação entre sexos apresentou maior parasitemia total média somente para camundongos machos da linhagem Swiss (SM) (p < 0,05) (figura 6).

O treinamento físico promoveu redução estatística nas atividades séricas de CK e CK-MB para as duas linhagens, em ambos os sexos, exceto para camundongos Swiss fêmeas na atividade de CK e CK-MB (tabela 3).

Fêmeas Swiss tiveram níveis de atividade de CK e CK-MB estatisticamente menores em todos os grupos (figura 7).

Animais BALB/c machos (BM) treinados e infectados (T+I) apresentaram atividade sérica de CK e CK-MB significativamente menor que machos Swiss (SM) do mesmo grupo (figura 8).

Para a linhagem BALB/c, fêmeas não treinadas e infectadas (NT+I) mostraram níveis de atividade de CK e CK-MB significativamente menores que os machos do mesmo grupo (figura 9).

Fêmeas Swiss, não treinadas e infectadas (NT+I), apresentaram níveis de atividade de CK e CK-MB significativamente menores que machos Swiss do mesmo grupo (figura 10).

DISCUSSÃO

Este estudo avaliou a influência de um programa de treinamento físico aeróbio realizado em esteira rolante por oito semanas antes da infecção em ambos os sexos de duas linhagens de camundongos, sendo uma linhagem isogênica (camundongos BALB/c) e outra não isogênica (camundongos Swiss).

A comparação entre sexos nas duas linhagens de camundongos demonstrou que o treinamento físico reduz a carga parasitária para machos e fêmeas em ambas as linhagens. Em estudos realizados avaliando doenças parasitárias, inclusive pelo T. cruzi, foram observadas relações positivas na resposta do organismo à infecção para o sexo feminino^9-12. No entanto, para este estudo, fêmeas submetidas ou não ao treinamento físico não apresentaram carga parasitária menor quando comparadas com camundongos machos.

Os estudos que avaliam a relação entre o exercício físico e a infecção pelo T. cruzi têm apontado que o treinamento físico aeróbio realizado antes da infecção pode interferir na resposta do hospedeiro ao parasito; entretanto, o modo e o quanto tais alterações interferirão no curso da infecção ainda não estão bem esclarecidos^3,21. Os dados obtidos para parasitemia apresentam diferenças significativas e apontam tendência observada em outros estudos realizados recentemente³, nos quais os animais que são submetidos ao treinamento físico e depois à infecção respondem melhor ao agente infeccioso. O sexo²², a idade²³ e a constituição genética do hospedeiro podem influenciar o curso da infecção pelo T. cruzi no vertebrado²⁴.

A resposta genética de cada linhagem e sexo apresentam pontos interessantes a serem elucidados em trabalhos futuros abordando a imunogenética envolvida nos mecanismos de defesa dos animais.

A grande variação individual nos níveis de atividade sérica de CK e CK-MB observada neste trabalho é um ponto a ser esclarecido. Vale destacar que problemas metodológicos não devem ser considerados, uma vez que todas as orientações das bulas dos kits das enzimas foram seguidas e que a faixa de temperatura de manutenção do soro utilizada foi respeitada.

O nível elevado das atividades de CK e CK-MB para os grupos de camundongos não treinados e infectados e diminuição da atividade destas enzimas para os grupos treinados e infectados, para ambas as linhagens, exceto para fêmeas Swiss, aponta que a infecção interfere nos níveis circulantes destas enzimas e que o treinamento físico propicia uma redução nos níveis de atividade das mesmas. Este fenômeno poderia ser explicado por uma adaptação do organismo dos animais submetidos ao treinamento na depuração da enzima no sangue²⁵.

Newham et al.²⁶ sugeriram três explicações para o efeito adaptativo do treinamento: uma mudança no padrão de recrutamento de fibras musculares, que, com o decorrer das sessões de exercício, preservaria fibras musculares danificadas; adaptação da fibra muscular, tornando-a mais resistente ao estresse provocado pelo exercício; e fim do ciclo de crescimento e substituição das fibras. Estes esclarecimentos responderiam o resultado encontrado neste estudo, em que os animais submetidos ao treinamento e à infecção não somaram a resposta da inflamação nos tecidos causada pelo agente infeccioso e pelo treinamento físico, podendo o exercício ter causado efeito protetor tecidual.

Os níveis de atividade de CK também apresentam diferenças quando feitas comparações entre sexos em humanos. O sexo feminino apresenta menor atividade sérica desta enzima em repouso em comparação com o sexo masculino. Essa diferença aumenta de forma excessiva após o exercício²⁷. Os mesmos autores observaram tal diferença comparando homens e mulheres sedentários, realizando teste em bicicleta ergométrica utilizando 50% do O₂ máximo. Os homens apresentaram níveis séricos de CK cinco vezes maiores, a partir de valor inicial (no tempo zero), indo de 122mU/mL para 664mU/mL, e as mulheres obtiveram um aumento de duas vezes o valor inicial (72mU/mL para 152mU/mL).

Várias teorias já foram propostas para explicar as diferenças observadas na atividade sérica de CK para os sexos. Uma delas discute as variações no recrutamento de fibras musculares ou a diferença de massa muscular notadas entre homens e mulheres^28,29. O papel do estrogênio e seus derivados também tem sido implicado na redução dos níveis de CK em mulheres comparadas aos homens. O estrógeno parece proteger o músculo da lesão decorrente do exercício³⁰. No estudo em questão, tanto camundongos Swiss fêmeas quanto BALB/c, de modo geral, apresentaram esta diferença em relação ao sexo masculino.

Os resultados obtidos nestes experimentos sugerem o envolvimento de alterações fisiológicas decorrentes da genética do hospedeiro e dos sexos. A influência do treinamento físico promoveu, nas duas linhagens e em ambos os sexos, redução no pico de parasitos, na parasitemia total média e nas atividades séricas de CK e CK-MB em animais infectados pelo T. cruzi, exceto para fêmeas Swiss na atividade de CK e CK-MB.

Todos os autores declararam não haver qualquer potencial conflito de interesses referente a este artigo.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  29 Maio 2012
• Data do Fascículo
  Fev 2012