ÓXIDO NÍTRICO E DINÂMICA DE CA²⁺ EM CARDIOMIÓCITOS: INFLUÊNCIA DA CAPACIDADE DE EXERCÍCIO

NITRIC OXIDE AND CA2+ DYNAMICS IN CARDIOMYOCYTES: INFLUENCE OF EXERCISE CAPACITY

ÓXIDO NÍTRICO Y DINAMICA DE CA2+ EN CARDIOMIOCITOS: INFLUENCIA DE LA CAPACIDAD DE EJERCÍCIO

RESUMO

Introdução:

A capacidade intrínseca para o exercício aeróbico está relacionada com o inotropismo cardíaco. Por outro lado, a participação do óxido nítrico (NO) como mensageiro intracelular sobre a dinâmica do Ca²⁺ ainda permanece desconhecida em ratos com diferentes capacidades intrínsecas para o exercício.

Objetivo:

Avaliar se o NO modula diferentemente o transiente intracelular de Ca²⁺ e liberações espontâneas de Ca²⁺(sparks) em cardiomiócitos de ratos com diferentes capacidades intrínsecas para o exercício.

Métodos:

Ratos machos Wistar foram selecionados como desempenho padrão (DP) e alto desempenho (AD), de acordo com a capacidade de exercício até a fadiga, mensurada através de teste de esforço progressivo em esteira. Os cardiomiócitos dos ratos foram utilizados para determinar o transiente intracelular de Ca²⁺ e Ca²⁺sparks em microscópio confocal. Para estimar a contribuição do NO foi utilizado o inibidor das sínteses do NO (L-NAME, 100 µM). Os dados foram analisados através de ANOVA two-way seguido do pós-teste de Tukey e apresentados como médias ± EPM.

Resultados:

Os cardiomiócitos de ratos AD exibiram aumentos na amplitude do transiente de Ca²⁺ em comparação aos DP. Entretanto, o L-NAME aumentou a amplitude do transiente de Ca²⁺ somente em ratos DP. Não foram encontradas diferenças na constante de tempo de decaimento do transiente de Ca²⁺ (t) em cardiomiócitos de ratos com DP e AP, contudo, a administração do L-NAME diminuiu o t em cardiomiócitos em ambos os grupos. cardiomiócitos de ratos AD apresentaram menor amplitude e frequência de Ca²⁺sparks em comparação ao grupo DP. A administração de L-NAME aumentou a amplitude de Ca²⁺sparks em cardiomiócitos do grupo AD.

Conclusão:

O NO modula o transiente de Ca²⁺ e as sparks de Ca²⁺ em cardiomiócitos de ratos com diferentes capacidades intrínsecas para o exercício.

Descritores:
NG-Nitroarginina metil éster; aptidão física; miócitos cardíacos; cálcio

ABSTRACT

Introduction:

The intrinsic capacity to aerobic exercise is associated with cardiac inotropism. On the other hand, the contribution of nitric oxide (NO) as an intracellular messenger on Ca2+ dynamics remains unknown in rats with different intrinsic capacities to exercise.

Objective:

To evaluate whether NO modulates differently Ca2+ intracellular transient and spontaneous Ca2+ releases (sparks) in cardiomyocytes of rats with different intrinsic capacities to exercise.

Methods:

Male Wistar rats were selected as standard-performance (SP) and high-performance (HP), according to the exercise capacity until fatigue, assessed through a treadmill progressive stress test. Cardiomyocytes of rats were used to determine Ca2+ intracellular transient and Ca2+ sparks evaluated using confocal microscope. To estimate NO contribution, a NO synthase inhibitor (L-NAME, 100 µM) was used. Data were analyzed through two-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test and expressed as means ± SEM.

Results:

Cardiomyocytes of HP rats exhibited higher Ca2+ transient amplitude compared to SP. However, L-NAME increased Ca2+ transient amplitude only in SP rats. No differences were found in Ca2+ transient decay time constant ( t) in cardiomyocytes of SP and HP rats. However, administration of L-NAME caused reduction of tin cardiomyocytes of both groups. Lower amplitude and frequency of Ca2+ sparks were found in cardiomyocytes of HS rats compared to SP group. Administration of L-NAME increased the amplitude of Ca2+ sparks in cardiomyocytes of the HP group.

Conclusion:

NO modulates Ca2+ transient and Ca2+ sparks in cardiomyocytes of rats with different intrinsic exercise capacities.

Keywords:
NG-Nitroarginine methyl ester; physical fitness; myocytes, cardiac; calcium

RESUMEN

Introducción:

La capacidad intrínseca para el ejercicio aeróbico está relacionada con el inotropismo cardiaco. Por otro lado, todavía se desconoce la contribución del óxido nítrico (ON) como mensajero intracelular sobre la dinámica del Ca2+ en ratones con diferentes capacidades intrínsecas para el ejercicio.

Objetivo:

Evaluar si el ON modula diferencialmente la variación transitoria intracelular de Ca2+ y las liberaciones espontaneas de Ca2+ (sparks) en cardiomiocitos de ratones con diferentes capacidades intrínsecas para el ejercicio.

Métodos:

Ratones machos Wistar fueron seleccionados como desempeño estándar (DE) y alto desempeño (AD), de acuerdo con la capacidad de ejercicio hasta la fatiga, medida a través del test de fuerza progresiva en la caminadora o cinta eléctrica. Los cardiomiocitos de los ratones fueron utilizados para determinar el tránsito intracelular y sparks de Ca2+ evaluados en microscopio confocal. Para estimar la contribución del ON fue utilizado un inhibidor de síntesis del ON (L-NAME, 100 µM). Los datos fueron analizados a través de un ANOVA two-way seguido de un post-test Tukey y presentados como promedios ± EPM.

Resultados:

Los cardiomiocitos de ratones AD mostraron aumento en la amplitud de la variación transitoria de Ca2+ en comparación con los DE. Así mismo, el L-NAME incremento la amplitud transitoria de Ca2+ solamente en ratones DE. No se encontraron diferencias en la constante del tiempo de decaimiento de la variación transitoria ( t ) de Ca2+ en cardiomiocitos de ratones DE e AD. Todavía, la administración de L-NAME mostro una reducción en el t en cardiomiocitos de ambos los grupos. Cardiomiocitos de ratones AD presentaron menor amplitud y frecuencia de sparks de Ca2+ en comparación al grupo DE. La administración de L-NAME incrementó la amplitud de sparks de Ca2+ en cardiomiocitos del grupo AD.

Conclusión:

El ON modula la variación de Ca2+ y sparks de Ca2+ en cardiomiocitos de ratones con diferentes capacidades intrínsecas para el ejercicio.

Descriptores:
NG-Nitroarginina metil éster; aptitud física; miocitos cardíacos; calcio

INTRODUÇÃO

O óxido nítrico (NO) modula a função cardíaca, em grande parte, influenciando canais para Ca²⁺ envolvidos no acoplamento excitação-contração¹. Os mecanismos propostos pelos quais o NO modula negativamente o acoplamento excitação-contração-relaxamento envolvem a redução do influxo de Ca²⁺através de canais do tipo L e inibição da cAMP-PKA^2,3. Entretanto, a literatura aponta resultados conflitantes, e ainda não é possível determinar se os efeitos do NO sobre essas vias ocorrem por mecanismos diretos ou indiretos.

As ações do NO sobre a contratilidade de cardiomiócitos isolados já foram demonstradas^4-6. A inibição, in vitro, das sínteses do NO em cardiomócitos ventriculares através do L-NAME aumenta a taxa de encurtamento e relaxamento celular, aprimorando a função sistólica e diastólica da célula⁵. Por outro lado, Hoydal et al.⁶ demonstraram que o NO produzido pela NOS-1 (isoforma neuronal) alterou o desempenho contrátil de cardiomiócitos, aumentando o Ca²⁺ sistólico.

As sparks de Ca²⁺ foram primeiramente descritas por Cheng et al.⁷ As sparks são liberações espontâneas de Ca²⁺através da abertura dos receptores de rianodina (RyR2) em células não estimuladas⁸. O aumento na frequência das sparks de Ca²⁺, gerado pelo aumento do [Ca²⁺] no retículo sarcoplasmático (RS), está associado ao surgimento de ondas de Ca²⁺. Desta forma, a sobrecarga de Ca²⁺ no RS e as sparks de Ca²⁺ estão associadas com doenças cardíacas, como as arritmias^7,9. Petroff et al.⁴ demonstraram que em cardiomiócitos isolados, o aumento da liberação de NO em reposta ao estiramento mecânico contribui para o aumento na frequência dassparks de Ca²⁺.

A contratilidade de miócitos ventriculares e a dinâmica de Ca²⁺intracelular estão correlacionadas à capacidade intrínseca para o exercício¹⁰. Foi demonstrado que a inibição específica da NOS-1, e, consequentemente, a redução da biodisponibilidade do NO, modularia a dinâmica de Ca²⁺ em ratos com baixa e alta capacidades aeróbicas⁶. Contudo, ainda são desconhecidos os efeitos da inibição simultânea das NOS constitutivas (NOS-1 e NOS-3) sobre a dinâmica do Ca²⁺.

Assim, o presente estudo objetivou avaliar se o NO modula a dinâmica do Ca²⁺ em cardiomiócitos ventriculares de ratos com diferentes capacidades intrínsecas para o exercício aeróbico. No presente estudo, a inibição das sintases do NO pelo L-NAME foi usada para estimar a sua contribuição na dinâmica do Ca²⁺ em cardiomiócitos.

MATERIAIS E MÉTODOS

Ratos Wistar machos, pesando 250 ± 3 g no início do período experimental, foram mantidos em gaiolas coletivas sob um ciclo claro-escuro (14:10-h) e tiveram livre acesso a água e ração. Todos os experimentos foram executados de acordo com o Comitê de Ética para utilização e cuidados de animais de laboratório da Universidade Federal de Minas Gerias, Belo Horizonte, MG, Brasil (protocolo nº. 015/08).

Para determinar o desempenho físico dos animais foi utilizado um protocolo de exercício em esteira. O protocolo foi originalmente proposto por Koch e Britton¹¹ e adaptado para medir o tempo total de exercício até a fadiga (TTF)¹². Resumidamente, uma semana antes dos testes de exercício até a fadiga, os ratos foram familiarizados em esteira motorizada (Letica Scientific Instruments, Barcelona, Espanha), durante cinco dias consecutivos (5 min/dia; 5% de inclinação) e com aumentos diários da velocidade da esteira (10, 10, 11, 13, 15 m/min). O estímulo elétrico da esteira foi ajustado para 0,28 mA. A intensidade e duração do exercício estavam abaixo dos níveis necessários para produzir adaptações ao treinamento¹³. Animais que não foram capazes de se adaptar à esteira rolante foram excluídos do estudo (menos de 10%). Após a semana de adaptação, cada animal realizou, em três dias alternados, três testes de exercício progressivo até a fadiga (velocidade inicial de 10 m/min; 5% de inclinação). Durante os testes, a velocidade da esteira foi aumentada em 1 m/min a cada 3 min. A fadiga foi definida e o teste foi interrompido, quando o rato não era capaz de manter o ritmo de velocidade da esteira¹⁴.

A estratégia de seleção dos animais usada no presente estudo foi baseada no tempo de exercício até a fadiga de cada animal, de acordo com o dia de melhor desempenho físico¹⁵. Foram formados dois grupos experimentais: desempenho padrão (DP) e alto desempenho (AD). De acordo com o critério metodológico adotado, animais com TTF entre 16,33 e 46,57 min foram incluídos no grupo DP, ou seja, que tivesse um TTF que não fosse maior e nem menor que um desvio padrão da média da população. Os animais que obtiveram um TTF > 46,57 foram incluídos no grupo AD^11,16.

Dois dias após o teste de fadiga, os ratos foram pesados, em seguida foi realizada a eutanásia e os corações rapidamente removidos. Cardiomiócitos ventriculares dos grupos DP e AD foram enzimaticamente isolados como previamente descrito¹⁷. Resumidamente, os corações foram montados em sistema de Langendorff e perfundidos durante ~5 min com solução livre de Ca²⁺ contendo (em mM): 130 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 MgCl₂, 0,33 NaH₂PO₄, 1 lactato, 3 piruvato, 22 glicose, and 25 HEPES (pH 7,4). Após esta etapa, os corações foram perfundidos durante 10-15 min com solução contendo 1 mg/mL de colagenase tipo II (Worthington) e 0,17 mg/mL de protease tipo IX (Sigma, St. Louis, MO). Em seguida, os corações foram cortados em pequenos fragmentos e as células isoladas por agitação mecânica e então estocadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (Sigma, St. Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab, Campinas, Brasil). Somente miócitos tolerantes ao Ca²⁺, em repouso e com morfologia típica foram estudados. Os miócitos cardíacos isolados foram utilizados até 2-3 h após isolamento.

Medida para liberação de Ca ²⁺ (transiente intracelular de Ca ²⁺) e liberação espontânea de Ca ²⁺ (sparks de Ca ²⁺)

Cardiomiócitos isolados dos grupos DP e AD obtidos na condição de repouso foram carregados com 5 µM fluo-4 AM (Molecular Probes, Eugene, OR), durante 20 min em temperatura ambiente e então, lavadas com solução extracelular contendo 1,8 mM Ca²⁺ para remover o excesso da sonda¹⁸. A reação da sonda ao Ca²⁺ quando excitada em comprimento de onda de 488 nm, emite um sinal fluorescente que é capturado em 510 nm. Alterações na intensidade de fluorescência foram expressas como a razão F/F₀. Na medida de transiente de Ca²⁺, F₀representa a média de fluorescência mínima medida na fase diastólica cardíaca. Transientes de Ca²⁺ foram evocados com estimulação elétrica de campo através de um par de eletrodos de platina com pulsos retangulares. As células foram estimuladas à 1 Hz para produzir a condição de steady-state.As imagens fluorescentes (transiente e sparks de Ca²⁺⁾ foram obtidas em microscópio confocal Zeiss LSM 510 Meta (Zeiss GmbH, Jena, Alemanha) utilizando sistema Meta LSM 510 com objetiva de imersão à óleo x63 (Zeiss, Jena, Germany). Para armazenamento das imagens, os miócitos foram escaneados com feixe posicionado randomicamente ao longo da célula, evitando cruzar o núcleo. Transientes foram registrados a cada 1,54 ms e, sequencialmente armazenados para criação de imagens com duas dimensões contendo o tempo no eixo x. As sparks de Ca²⁺ foram mensuradas nas células em condições de repouso e as imagens foram analisadas por meio da interface SparkMaster, no software ImageJ¹⁹. O processamento das imagens dos transientes foi realizado em uma plataforma caseira desenvolvida no programa MatLab^(r).

Para avaliar o envolvimento do NO sobre o transiente de Ca²⁺ e assparks de Ca²⁺, os experimentos foram executados em miócitos ventriculares pré-incubados durante 20 min com 100 µM do inibidor não seletivo das enzimas sintetizadoras do NO, N^G-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, Sigma, St. Louis, MO).

Análise Estatística

Os dados estão apresentados com média ± EPM. Diferenças entre os grupos nas medidas de peso corporal, peso do coração, relação peso coração/peso corporal e TTF foram calculadas utilizando teste t deStudent não pareado. ANOVA Two-way seguido do post hoc de Tukey foi utilizada para calcular diferenças na amplitude do transiente de Ca²⁺, constante de tempo para o decaimento do transiente de Ca²⁺, frequência e amplitude dassparks de Ca²⁺. O nível de significância adotado foi de 5%.

RESULTADOS

A tabela 1 resume as características desempenho físico e as características morfométricas dos grupos DP e AD. O TTF foi significativamente maior no grupo AD quando comparado ao DP. Não formam observadas diferenças na massa corporal, massa do coração ou razão massa do coração/massa corporal.

Tabela 1
TTF, peso corporal, peso do coração ou razão peso coração/peso corporal em ratos DP e AD.

Medida	DP (n=10)	AD (n=5)
TTF (min)	31,7 ± 3,8	46,1 ± 2,8*
Peso corporal (g)	314,6 ± 15,6	327,0 ± 15,9
Peso do coração (mg)	2045,4 ± 84,4	2170,5 ± 126,7
PC/PC (mg/g)	6,5 ± 0,2	6,6 ± 0,3

• DP= desempenho padrão. AD= alto desempenho. TTF= tempo total de exercício até a fadiga. PC/PC: razão peso coração/peso corporal. *P < 0,05 vs. DP.

Na Figura 1A estão apresentadas imagens representativas do transiente intracelular de Ca²⁺em cardiomiócitos de ratos DP e AD carregados com o indicador fluorescente fluo-4 AM. Como demonstrado naFigura 1B, cardiomiócitos de ratos AD exibiram maior amplitude do transiente de [Ca²⁺]_i comparado ao grupo DP (7,43 ± 0,97 vs. 5,03 ± 0,71 F/F₀; P < 0,05). De forma interessante, a inibição das sintases de NO com L-NAME em cardiomiócitos de ratos DP aumentou amplitude do transiente de Ca²⁺ (8,68 ± 0,64 F/F₀; P < 0,05), mas não alterou este parâmetro no grupo AD (8,80 ± 0,75 F/F₀; P > 0,05). Não foram encontradas diferenças no tempo da recaptação do Ca²⁺ citosólico (figura 1C) entre os grupos DP e AD, mas a administração do L-NAME diminuiu o tempo para recaptação do Ca²⁺ em ambos os grupos DP (312,93 ± 33,09 para 177,20 ± 31,35 ms; P < 0,05) e AD (352,88 ± 41,74 para 215,48 ± 35,16 ms; P < 0,05).

Figura 1
Transientes de Ca²⁺ em Cardiomiócitos. (A) Imagens representativas de cardiomiócitos carregados com o marcador para Ca²⁺ fluo 4-AM. (B) Amplitude do transiente (F/F₀) de Ca²⁺. (c) constante de tempo do decaimento do transiente. DP= desempenho padrão (n= 79 células de 10 ratos). AD= alto desempenho (n= 53 células de cinco ratos). L-NAME= células incubadas com L-NAME (20 min, 100 µM). *, diferente do grupo sem L-NAME (P < 0,05). #, diferente do grupo DP sem L-NAME (P < 0,05).

Imagens representativas das sparks de Ca²⁺ estão ilustradas na Figura 2A. Como demonstrado naFigura 2B, cardiomiócitos do grupo AD exibiram menor frequência das sparks de Ca²⁺ em comparação ao grupo DP (6,07 ± 0,77 vs. 9,49 ± 0,71 em 100 µm/s; P < 0,05), entretanto, o tratamento com L-NAME não alterou a frequência dassparks de Ca²⁺ em ambos os grupos (P > 0,05). Como apresentados na Figura 2C, cardiomiócitos de ratos AD apresentaram menor amplitude das sparks de Ca²⁺ quando comparado ao grupo DP (0,60 ± 0,03 vs.0,81 ± 0,02 ΔF/F₀; P < 0,05), mas, o tratamento com L-NAME aumentou a amplitude das sparks de Ca²⁺ somente no grupo AD (0,90 ± 0,03 ΔF/F₀; P < 0,05).

Figura 2
Sparks de Ca²⁺. (A) Imagens representativas das sparks espontâneas de Ca²⁺. (B) Frequência das sparks de Ca²⁺. (C) Amplitude das sparks de Ca²⁺. DP= desempenho padrão (n= 79 células de 10 ratos). AD= alto desempenho (n= 53 células de cinco ratos). L-NAME= células incubadas com L-NAME (20 min, 100 µM). *, diferente do grupo sem L-NAME (P < 0,05). #, diferente do grupo DP sem L-NAME (P < 0,05).

DISCUSSÃO

Avaliamos no presente estudo os efeitos do NO sobre o transiente intracelular de Ca²⁺ e as sparks de Ca²⁺ em cardiomiócitos de ratos com desempenho padrão e alto desempenho para o exercício. Confirmando nossa hipótese, ratos dos grupos DP e AD apresentaram diferenças intrínsecas no transiente de Ca²⁺ intracelular e nassparks de Ca²⁺. Foi observado que a capacidade intrínseca para desempenho físico modulou a dinâmica de Ca²⁺ por mecanismos que envolvem a síntese do NO. Juntos, esses resultados ajudam a explicar algumas diferenças intrínsecas observadas na capacidade para exercício aeróbico entre ratos DP e AD.

Os resultados do presente trabalho mostraram que cardiomiócitos ventriculares de ratos AD apresentaram maior amplitude do transiente intracelular de Ca²⁺em comparação aos ratos DP. Esta reposta pode estar diretamente relacionada à maior liberação do conteúdo de Ca²⁺ pelo RS através dos RyR2, sendo esta estrutura a responsável pelo controle da liberação deste íon nos cardiomiócitos^20,21. Estudos anteriores do nosso grupo demonstraram níveis aumentados de expressão da RyR2 em corações de ratos AD¹⁰.

Além disso, cardiomiócitos de ratos AD apresentaram menor amplitude e frequência dassparks de Ca²⁺. Já foi demonstrado que animais AD exibem expressão aumentada da bomba de Ca²⁺ ATPase do RS (SERCA2a)¹⁰, assim, estes cardiomiócitos podem apresentar maior capacidade para a recaptação do Ca²⁺ para o RS e, consequentemente, uma sobrecarga de Ca²⁺ no RS. Essa situação poderia explicar aumentos na frequência e na amplitude das sparks de Ca²⁺. Entretanto, os dados deste trabalho não apoiam esta hipótese e para tentar explicar o fato, sugerimos então que ratos AD possuem funcionamento aprimorado do complexo RyR2/FKBP12.6. A proteína FKBP12.6 está ancorada à quatro monómeros de RyR2, estabilizando o canal. A deficiência nesta proteína está relacionada ao vazamento de Ca²⁺ a partir da RyR2, sendo este, um mecanismo fundamental para o surgimento das arritmias cardíacas^7,9,22. Deste modo, é sugestivo propor que animais com alta capacidade intrínseca para o exercício poderiam apresentar maior proteção miocárdica contra eventos arrítmicos.

Tem sido demonstrado que o NO inibe o influxo de Ca²⁺ através dos canais do tipo L^3,23, deste modo, a inibição da síntese do NO causaria aumento do influxo de Ca²⁺ para o sarcoplasma. Os resultados mostraram aumento na amplitude do transiente de Ca²⁺ no grupo DP com a inibição das sintases de NO o que poderia causar um efeito inotrópico positivo em cardiomiócitos, como já demonstrado pelo nosso grupo⁵. Neste estudo prévio, a inibição da síntese do NO com L-NAME aumentou a taxa de encurtamento máximo dos cardiomiócitos⁵. Lunz et al.⁵ também demonstraram que a redução da biodisponibilidade do NO aumentou a taxa máxima para o relaxamento. No presente trabalho, a administração de L-NAME aumentou a Tau, o que pode ser atribuído à um aumento da expressão e/ou função da SERCA2. Isso sugere que o aumento na velocidade de recaptação de Ca²⁺para o RS foi o responsável pelo aumento na taxa máxima de relaxamento encontrado por Lunz et al.⁵. Em nossos resultados, a inibição das sistases de NO provocou mudanças na amplitude das sparks de Ca²⁺ apenas no grupo AD. Animais transgênicos com ausência das NOS-1 e NOS-3 apresentam comportamento alterado da RyR2, com redução de S-nitrosilação e aumento da oxidação desse canal, com consequentemente vazamento de Ca²⁺ diastólico, causando um impacto negativo na estabilidade elétrica e contrátil cardíaca²⁴.

CONCLUSÃO

O presente trabalho demonstrou que o NO modula o transiente de Ca²⁺ e assparks de Ca²⁺ em cardiomiócitos de ratos com diferentes capacidades intrínsecas para o exercício.

AGRADECIMENTOS

Este estudo recebeu suporte financeiro do Fundo de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jan-Feb 2016

Histórico

• Recebido
  12 Dez 2014
• Aceito
  21 Out 2015