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Neotropical Entomology

Print version ISSN 1519-566XOn-line version ISSN 1678-8052

Neotrop. Entomol. vol.31 no.3 Londrina July/Sept. 2002

https://doi.org/10.1590/S1519-566X2002000300008 

BIOLOGICAL CONTROL

Seleção de Isolados de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. Contra a Broca Gigante da Cana-de-Açúcar Castnia licus (Drury) (Lepidoptera: Castniidae)

 

MARIA DE F. DE S. FIGUEIRÊDO1, EDMILSON  J. MARQUES1, RICARDO O.R. DE LIMA2 E JOSÉ V. DE OLIVEIRA1 

1Depto. Agronomia - Fitossanidade, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros S/N,
Dois Irmãos, 52171-900, Recife, PE
2
Estação Experimental de Cana-de-Açúcar do Carpina. Rua Ângela Cristina C. Pessoa de Luna S/N, Bairro Novo,
55810-000, Carpina, PE

 

 

Screening of Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. and Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. Isolates Against the Giant Borer of Sugarcane Castnia licus (Drury) (Lepidoptera: Castniidae)

ABSTRACT - Isolates of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. and Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. were tested against Castnia licus (Drury) larvae, collected from Tabu Distillery sugar cane fields, in Caaporã-PB. The isolates code 645, 604, 512, 447, IPA 205, IPA 202, 610, IPA 198, IPA 214 and CG 001 of B. bassiana, as well as the isolates code 1172, 866, PL 47, IPA 204, CG 423, UOD, 860, IPA 216, E9 and CG 100 of M. anisopliae, originated from different hosts and localities, were tested. At the concentration of 108 conidia/ml, the percentage of mortality caused by isolates of B. bassiana ranged from 53.3% to 83.3%, with Lethal Time (LT50) ranging from 8.5 to 14.9 days. The isolate 645 presented the highest potential to control C. licus. For M. anisopliae isolates, the percentage of larval mortality ranged from 43.3 to 80%, with LT50 ranging from 7.3 to 18.0 days. The isolate 1172 was the most virulent. The lethal concentrations (LC50) for the isolates 645 of B. bassiana and 1172 of M. anisopliae, were 1,17 x 107 conidia/ml and 2,34 x 107 conidia/ml, respectively, thus showing that both isolates are pathogenic to larval phase of C. licus.

KEY WORDS: Entomopathogenic fungus, microbial control, LT50.

 

RESUMO - Isolados dos fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. foram testados sobre lagartas de Castnia licus (Drury), coletadas nos canaviais da Destilaria Tabu, em Caaporã-PB. Foram utilizados os isolados de código 645, 604, 512, 447, IPA 205, IPA 202, 610, IPA 198, IPA 214 e CG 001 de B. bassiana, bem como os isolados de código 1172, 866, PL 47, IPA 204, CG 423, UOD, 860, IPA 216, E9 e CG 100 de M. anisopliae, provenientes de diferentes hospedeiros e localidades. Na concentração de 108 conídios/ml, a percentagem de mortalidade provocada pelos isolados de B. bassiana variou de 53,3 a 83,3%, com Tempo Letal (TL50) compreendido entre 8,5 e 14,8 dias, sendo que o isolado 645 apresentou maior potencial para o controle de C. licus. Para os isolados de M. anisopliae, o percentual de lagartas mortas variou de 43,3 a 80%, com os valores de TL50 compreendidos entre 7,3 e 17,9 dias, sendo o isolado 1172 o mais virulento. As concentrações letais (CL50) para o isolado 645 de B. bassiana e 1172 de M. anisopliae foram de 1,17 x 107 conídios/ml e 2,34 x 107 conídios/ml, respectivamente, demonstrando que ambos isolados foram patogênicos para a fase larval de C. licus.

PALAVRAS-CHAVE: Fungo entomopatogênico, controle microbiano, TL50.

 

 

A produtividade da cana-de-açúcar é reduzida pela broca gigante Castnia licus (Drury), um dos principais problemas entomológicos da cultura em algumas áreas das regiões Norte e Nordeste do Brasil, especialmente nos estados de Alagoas, Pernambuco, Paraíba, Rio Grande do Norte, Pará e Amapá. Situação semelhante ocorre em vários outros países da América do Sul e da América Central, entre os quais estão as Guianas, Bolívia, Colômbia, Panamá e Trinidad-Tobago (Mendonça 1996).

Nas socarias, as lagartas se alimentam do rizoma e das raízes, reduzindo bastante o poder germinativo. Em cana jovem, passam do rizoma para os rebentos, causando o secamento e posterior apodrecimento da "olhadura". Em cana adulta, a lagarta perfura os entrenós da base do colmo, justamente os locais mais ricos em sacarose (Esquivel 1980, Mendonça et al. 1996). 

O controle de C. licus é dificultado pela permanência da lagarta no interior da touceira e do colmo da cana-de-açúcar, durante quase todo o seu ciclo de desenvolvimento, que é de aproximadamente 120 dias. Em conseqüência disto, vem sendo realizado o controle mecânico com o auxílio de enxadeco especial, através da catação de lagartas e crisálidas. As mariposas são capturadas com o uso de redes entomológicas (Mendonça 1996).

Os fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. são mundialmente conhecidos e utilizados como agentes biocontroladores de inúmeras pragas agrícolas. Essas espécies apresentam potencial de controle para diversas ordens de insetos (Bridge et al. 1990, Alves 1992, Pereira et al. 1993), inclusive para lepidópteros pragas, como Plutella xylostella (L.) (Vandenberg et al. 1998), Alabama argillacea (Huebner) (César Filho 2000) e Diatraea saccharalis Fabr. (Alves et al. 1984), como também do gênero Castnia que são suscetíveis a B. bassiana e M. anisopliae, a exemplo da broca do talo do abacaxizeiro Castnia icarus (Cramer) (Silva & Veiga 1998).

Alguns trabalhos realizados com o fungo B. bassiana demonstram possibilidades de utilização desse microrganismo no controle biológico de C. licus. Vilas Boas et al. (1983) verificaram, em laboratório, a patogenicidade de B. bassiana para lagartas de C. licus, obtendo mortalidade de 60%. O comportamento do fungo sobre a praga foi testado em condições de campo por Marques et al. (1984, 1986), sendo constatadas mortalidades larvais variando de 16,7 a 33,0% após 21 dias da aplicação. Vilas Boas & Alves(1988) concluíram que isolados de B. bassiana e de Beauveria brongniartii (Sacc.) Petch. apresentam potencial para o controle microbiano de C. licus, enquanto que Marques et al. (2001) obtiveram, em condições de laboratório, uma percentagem de mortalidade de 88% para o isolado 645 de B. bassiana e TL50 de 4,5 dias para o isolado 447.

Resultados negativos, foram obtidos quandoGuagliumi (1972-73) testou M. anisopliae sobre lagartas de C. licus. No entanto, o trabalho de Marques et al. (2001) comprovou que alguns isolados de M. anisopliae apresentaram patogenicidade para C. licus, sendo de 70% a maior percentagem de mortalidade obtida, com TL50 de 7,5 dias.

Devido à necessidade de se buscar técnicas alternativas para o controle de C. licus e diante da realidade de que o controle biológico mediante fungos entomopatogênicos tem se mostrado promissor para esta praga, a presente pesquisa visou selecionar isolados dos fungos B. bassiana e M. anisopliae para o controle microbiano de C. licus.

 

Material e Métodos

O presente estudo foi desenvolvido no Laboratório de Patologia de Insetos da Área de Fitossanidade, pertencente ao Departamento da Agronomia da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), em Recife-PE.

Obtenção dos Insetos. As lagartas de C. licus utilizadas nos experimentos foram coletadas em canaviais da Destilaria Tabu, situada no município de Caaporã-PB e transportadas para o laboratório em seções de colmos de cana-de-açúcar, acomodados em caixas de papelão.

Obtenção dos Isolados. Foram utilizados nos experimentos dez isolados de B. bassiana e dez de M. anisopliae, existentes na micoteca do laboratório e obtidos a partir de diversos hospedeiros e localidades (Tabela 1). Os isolados, conservados a 6±2ºC e em tubos de vidro com meio de cultura Batata-Dextrose-Ágar mais o antibiótico sulfato de streptomicina (BDA+A) e óleo Nujol® esterilizado, foram repicados para placas de Petri contendo BDA + A. Após dez dias foram novamente repicados para placas contendo meio de cultura completo (MC), constituído de KH2 PO4, 0,36 g; Na2 HPO4 7H2O, 1,05 g; MgSO4 7H2O, 0,60 g; KCl, 1,0 g; glucose, 10,0 g; NaNO3, 1,58 g; extrato de levedura, 5,0; ágar, 20,0 g e água q.s.p. 1000 ml (Alves et al. 1998). Os isolados foram uniformemente espalhados por toda a extensão das placas, com o auxílio de alça de Drigalsky. Decorridos oito dias, foram revigorados em lagartas de terceiro instar de D. saccharalis, oriundas da criação existente no Laboratório de Biologia de Insetos da Área de Fitossanidade da UFRPE. Transcorrido o período de dez dias, os isolados foram repicados das lagartas para BDA + A e, após oito dias procedeu-se a purificação dos isolados, mediante nova repicagem para placas com BDA + A. Passados mais oito dias, o material fúngico revigorado e purificado foi transferido para tubos de vidro, sendo conservado segundo metodologia descrita anteriormente. Para a germinação e crescimento dos isolados, durante todo esse processo, as placas foram mantidas em estufa incubadora B.O.D a 26±1ºC, com fotofase de 12h. Por ocasião dos experimentos, os isolados foram multiplicados em placas com MC, obtendo-se, portanto, o material fúngico necessário para os testes.

 

 

Sintomatologia Apresentada Pelas Lagartas. As avaliações dos experimentos envolveram observações dos sintomas apresentados pelas lagartas. Para este fim, os insetos mortos foram acomodados em placas de Petri com papel de filtro umedecido com água destilada, objetivando-se acompanhar diariamente o desenvolvimento sintomatológico para confirmação do agente causal.

Seleção dos Isolados. Para o experimento 1 foram utilizados os isolados 645, 604, 512, 447, IPA 205, IPA 202, 610, IPA 198, IPA 214 e CG 001 de B. bassiana, e para o experimento 2 os isolados 1172, 866, PL 47, IPA 204, CG 423, UOD, 860, IPA 216, E9 e CG 100 de M. anisopliae.Cada experimento foi conduzido em delineamento experimental inteiramente casualizado, com onze tratamentos e três repetições, sendo cada parcela constituída por dez lagartas. As condições ambientais registradas durante o experimento 1 foram 26±2ºC de temperatura, 60±5% de umidade relativa do ar (UR) e fotofase de 12h. Para o experimento 2 registrou-se 27±2ºC de temperatura, UR de 60±5% e fotofase de 12h.

Para a realização dos experimentos, as suspensões fúngicas foram preparadas adicionando-se 40 ml de água destilada esterilizada mais espalhante adesivo Tween 80 a 0,01% (ADE + E) nas placas contendo os isolados multiplicados em MC, sendo removidos os conídios dos fungos, com o auxílio de uma pequena escova. As suspensões foram filtradas em gaze esterilizada, sendo suas concentrações ajustadas para 108 conídios/ml, mediante o uso da câmara de Neubauer. A pulverização foi efetuada com um minipulverizador manual DeVilbiss nº 15, sendo utilizados 3 ml de suspensão por repetição, ou seja, para cada placa de Petri com 14,5 cm de diâmetro, contendo 10 lagartas com tamanho variável entre 30 e 50 mm de comprimento. Para a testemunha, utilizou-se apenas ADE + E. As lagartas foram individualizadas em caixas plásticas medindo 39 x 27,3 x 9,5 cm, com divisórias de eucatex, apresentando cada compartimento uma porção de colmo de cana-de-açúcar com aproximadamente 10 cm de comprimento, perfurado em uma das extremidades, para penetração da lagarta. Em seguida, as caixas foram colocadas sobrepostas, com folha de cartolina sobre a última.

A viabilidade dos conídios foi avaliada 24h após o plaqueamento em BDA + A. Para este fim, utilizaram-se duas placas de Petri com BDA + A para cada isolado, sendo pulverizados sobre estas 10 microlitros da suspensão correspondente. As placas foram mantidas por 24h em estufa incubadora B.O.D., nas condições de temperatura e fotofase descritas anteriormente.

As avaliações foram feitas através da observação diária da mortalidade de lagartas, durante 15 dias, efetuando-se a troca de alimento, quando necessário. Os insetos mortos foram colocados em placas de Petri com papel de filtro umedecido com água destilada, para a confirmação do agente causal.

A eficiência dos isolados foi avaliada mediante a percentagem de mortalidade de lagartas e o tempo letal (TL50). Para o cálculo de TL50, os valores das mortalidades acumuladas foram submetidos à análise de Probit, com o auxílio do programa computacional Mobae (Haddad et al. 1995). Empregando-se o programa Sanest (versão 3.0), os dados referentes à mortalidade de lagartas foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste Tukey (P£0,05).

Produção dos Isolados Selecionados. Em vista da necessidade de maior produção de conídios para utilização nos testes da Concentração Letal (CL50), optou-se pela produção dos isolados 645 de B. bassiana e 1172 de M. anisopliae, selecionados como os mais eficientes, em meio de arroz cozido e esterilizado, conforme metodologia adaptada de Marques et al. (1981) e Vilas Boas (1988). A partir de lagartas de C. licus parasitadas, obtidas nos experimentos 1 e 2, os referidos isolados foram reisolados em placas de Petri contendo BDA + A. Decorridos oito dias, foram purificados em BDA + A, sendo após mais oito dias produzidos em placas cheias, contendo MC. Posteriormente, foram inoculados em garrafas de vidro com capacidade para 500 ml, contendo 140 gramas de arroz parboilizado e 90 ml de água destilada. Antes da inoculação, as garrafas foram fechadas com papel alumínio preso com cordão e autoclavadas a 120ºC, durante 30 min., para esterilização e cozimento do arroz. Após o resfriamento, o arroz foi inoculado com 15 ml de suspensão de cada isolado, na concentração de 107 conídios/ml. Durante todas as etapas, os isolados foram mantidos em estufa incubadora B.O.D., nas mesmas condições de temperatura e fotofase da etapa anterior.

Concentração Letal (CL50). Os isolados 645 de B. bassiana e 1172 de M. anisopliae foram utilizados no experimento 3 para a determinação da concentração letal. Para tanto, prepararam-se as suspensões fúngicas nas concentrações de 105, 106, 107, 108 e 109 conídios/ml. O experimento foi conduzido em delineamento experimental inteiramente casualizado, com 11 tratamentos e três repetições, inclusive a testemunha. Os tratamentos corresponderam a 30 lagartas tratadas com as diferentes concentrações dos isolados, sendo cada repetição constituída por 10 lagartas de C. licus. Na preparação e aplicação das suspensões, determinação da viabilidade de conídios, acomodação das lagartas e avaliações, utilizou-se a mesma metodologia empregada nos experimentos 1 e 2. Durante este experimento registrou-se a temperatura de 27±2ºC, UR de 60±5% e fotofase de 12h.

A eficiência dos isolados foi avaliada através da percentagem de mortalidade de lagartas e CL50. A determinação da CL50 foi efetuada mediante a utilização do programa computacional Micro Probit (versão 3.0). Os dados referentes à mortalidade de lagartas foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste Tukey (P£ 0,05) empregando-se o programa Sanest (versão 3.0).

 

Resultados e Discussão

Sintomatologia. Os sintomas de infecção começaram a ser observados nas lagartas quando ocorreu a supressão da alimentação e o retardamento dos seus movimentos. Sintomas característicos atribuídos ao fungo foram observados em lagartas de C. licus mortas por B. bassiana, que apresentaram inicialmente coloração rósea e consistência endurecida, enquanto que as lagartas mortas por M. anisopliae mostraram-se inicialmente pálidas e também endurecidas. Após a colonização do corpo dos insetos pela massa micelial, ocorreu a produção de conídios, de coloração branca para B. bassiana e verde para M. anisopliae. Algumas lagartas apresentaram manchas escuras distribuídas pelo corpo, ocorrendo rompimento do tegumento em alguns casos, não evoluindo, portanto, para a conidiogênese, o que pode ser caracterizado como efeito do fungo, conforme referido por Alves (1998).

Seleção de Isolados. Embora seja usual realizar testes sobre insetos com um maior número de isolados de fungos, face às dificuldades existentes para criação de C. licus em laboratório ou obtenção das lagartas em tamanho uniforme no campo, utilizaram-se apenas 20 isolados, sendo 10 de cada fungo. Os isolados de B. bassiana apresentaram viabilidade superior a 95%, o que demonstra a alta capacidade germinativa destes. A Tabela 2 expressa os valores referentes às percentagens de mortalidade de lagartas e TL50, obtidos a partir dos isolados de B. bassiana, utilizados no experimento 1. A patogenicidade dos isolados foi determinada pela percentagem de mortalidade, que variou de 53,3 a 83,3%, decorridos 15 dias da inoculação. Os valores de TL50 variaram de 8,5 a 14,8 dias. Os tratamentos com os isolados não causaram mortalidades significativamente diferentes entre eles, mas apenas diferiram da testemunha, indicando que todos os isolados na concentração de 108 conídios/ml são patogênicos para lagartas de C. licus. Entretanto, os valores referentes às percentagens de mortalidade e TL50 são significativos do ponto de vista biológico. Levando-se em consideração este aspecto, verifica-se que o isolado 645 provocou a maior percentagem de mortalidade de lagartas, 83,3%, enquanto que a menor TL50 de 8,5 dias foi obtida para o isolado 604. Visto que os valores de TL50 para os isolados 645 e 604 foram praticamente iguais, optou-se pela seleção do isolado 645, haja vista sua maior percentagem de mortalidade.

 

 

A viabilidade dos diferentes isolados de M. anisopliae também foi superior a 95%. Para o experimento 2, após 15 dias da inoculação, as percentagens de mortalidade obtidas para os isolados de M. anisopliae variaram de 43,3 a 80% e os valores de TL50 de 7,3 a 17,9 dias (Tabela 3). Todos os isolados foram patogênicos a C. licus, uma vez que não apresentaram diferenças significativas entre si, mas apenas diferiram da testemunha. Considerando-se os valores da percentagem de mortalidade e TL50, o isolado 1172 foi mais eficiente, visto que provocou 80% de mortalidade para as lagartas com TL50 de 7,3 dias. Esses números absolutos são valores altamente representativos para o controle biológico em laboratório e indicativo de seu grande potencial para o controle em campo.

 

 

 

As percentagens de mortalidade de lagartas de C. licus por isolados de B. bassiana, que variaram de 53,3 a 83,3% (Tabela 2) foram comparáveis aos obtidos por Vilas Boas et al. (1983), que registraram 60% de mortalidade de lagartas de C. licus por B. bassiana, na concentração de 1,64 x 109 conídios/ml, sendo porém mais significativos os resultados da atual pesquisa, uma vez que se utilizou a concentração de 108 conídios/ml. Trabalhando com os isolados 196 e 252 de B. bassiana na concentração de 108 conídios/ml, Vilas Boas & Alves (1988) obtiveram, respectivamente, mortalidades de 100 e 98% para C. licus, quando trataram os insetos por imersão. Essas mortalidades, superiores às verificadas na atual pesquisa, provavelmente ocorreram devido ao uso de diferentes isolados, como também ao modo de inoculação do fungo.

Em função de poucas referências sobre o uso de Beauveria spp. e Metarhizim spp. para o controle de C. licus, optou-se por considerar também o efeito desses entomopatógenos sobre outras espécies da ordem Lepidoptera. No presente estudo, na concentração de 108 o isolado 447 de B. bassiana, proporcionou 73,3% de mortalidade de larvas de C. licus, com TL50 de 9,15 dias, enquanto que Silva & Veiga (1998) constataram que o mesmo isolado provocou 54% de mortalidade para C. icarus, com TL50 de 11,6 dias, sendo portanto mais virulento para C. licus. Com relação a M. anisopliae, a mortalidade de C. licus obtida com os isolados 866 e PL47, respectivamente 70,0 e 66,6%, são comparáveis aos constatados pelos referidos autores, trabalhando com C. icarus, quando inocularam o isolado 196E de M. anisopliae,e constataram68% de mortalidade para lagartas, com TL50 de 5,84 dias.

Os isolados 645, 604, 610 e IPA 198 de B. bassiana e 1172, 866, PL 47 e IPA 204 de M. anisopliae, na concentração de 108 conídios/ml, utilizados na presente pesquisa, proporcionaram mortalidade de 63,3 a 83,3% sobre C. licus.Esses isolados foram também virulentos para lagartas de terceiro instar de A. argillacea, com percentagens de mortalidade superiores a 53,3%, sendo de 5,7 dias o menor valor para TL50 (César Filho 2000).

Resultados significativos com a utilização de B. bassiana também foram obtidos por Lecuona et al. (1996), quando observaram que a mortalidade de lagartas de D. saccharalis variou de 50 a 90%, com valores de TL50 compreendidos entre 2,1 e 8,4 dias.

Concentração Letal (CL50). Os resultados obtidos no experimento 3 (Tabela 4) referem-se às percentagens de mortalidade de lagartas ocasionadas pelos isolados 645 de B. bassiana e 1172 de M. anisopliae, bem como valores de CL50.

 

 

Com base nas informações estatísticas, as percentagens de mortalidade de lagartas de C. licus ocasionadas pelo isolado 645 nas concentrações de 105 e 106 conídios/ml não diferem entre si e da testemunha. As demais concentrações causaram mortalidades mais elevadas que a testemunha, sendo mais eficientes as ocasionadas pelas concentrações 108 e 109 conídios/ml, que não diferiram entre si, com percentagens de mortalidade acima de 86,6% e até 93,3%.

Nas concentrações de 105, 106 e 107 conídios/ml, as percentagens de mortalidade para o isolado 1172 não diferiram entre si e quando comparadas com a testemunha. Porém, foram diferentes das concentrações de 108 e 109 conídios/ml que, com comportamento análogo ao das concentrações de igual valor utilizadas para o isolado 645, apresentaram percentagens de mortalidade de 80 e 90% respectivamente.

A determinação da CL50 é importante quando se deseja determinar qual o produto que apresenta a dose mais econômica, objetivando-se utilizá-lo no campo. A CL50 para o isolado 645 de B. bassiana foi de 1,17 x 107 conídios/ml, variando de 5,77 x 106 a 2,27 x 107 conídios/ml, e para o isolado 1172 de M. anisopliae, a CL50 foi de 2,34 x 107 conídios/ml, variando de 1,19 x 107 a 4,61 x 107 conídios/ml. Observa-se, pois, que o isolado 645 apresentou CL50 duas vezes menor em relação àquela obtida para o isolado 1172, o que sugere a utilização do isolado 645, para controle de C. licus, pois além de ter se mostrado o mais eficiente, considerando-se o valor da CL50, foi também o mais virulento dos isolados testados de B. bassiana e M. anisopliae.

Esta pesquisa confirmou a importância de isolados de B. bassiana para utilização no controle microbiano de C. licus, em função dos elevados valores de mortalidade obtidos, os quais se enquadram nos níveis esperados para resultados de experimentos em laboratório. Paralelamente, os resultados obtidos com M. anisopliae indicaram que esse fungo, embora em níveis menos elevados, também apresentou potencial para o controle da praga.

 

Agradecimentos

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de estudo de mestrado concedida ao primeiro autor, bem como ao Engenheiro Agrônomo Sílvio Lemos Antunes da Destilaria Tabu, em Caapora, Paraiba, pela coleta e concessão de material biológico, e aos dois revisores anônimos pelas valiosas críticas e sugestões.

 

Literatura Citada

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Received 29/08/01. Accepted 10/07/02.

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