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Relação entre a atividade de esterases e a resistência de Myzus persicae (Sulz.) (Sternorrhyncha:Aphididae) a pirimicarbe

Relationship between esterases activity and the resistance of Myzus persicae (Sulz.) (Sternorrhyncha: Aphididae) to pirimicarb

Resumos

O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre a atividade total das esterases e a resistência de indivíduos de M. persicae a inseticidas em populações coletadas em plantas de batata, em Contenda e Piraí do Sul, PR e Ibicoara, BA. No bioensaio, os afídeos foram colocados em recipientes de plástico transparente com o fundo coberto por uma tela de malha fina, em cinco repetições de 10 indivíduos para cada concentração. O conjunto foi mergulhado em concentrações (%) de pirimicarbe a 0,0031; 0,0062; 0,0125; 0,025; 0,05 e 0,1%, durante 10 segundos e depois secos em papel filtro. Após uma hora em câmaras a aproximadamente 25°C, os afídeos foram examinados sob microscópio estereoscópico, anotando-se o número de insetos mortos. A atividade de carboxilesterase foi medida através de ensaio colorimétrico in vitro. De acordo com os níveis de absorbância, os afídeos foram classificados em S; S/R1 (S ou R1); R1; R1/R2 (R1 ou R2); R2 e R3 (suscetível; suscetível/ levemente resistente; levemente resistente; levemente resistente/ altamente resistente; altamente resistente e extremamente resistente, respectivamente). Foi efetuada uma correlação simples entre os resultados das CL50 obtidas no bioensaio e a freqüência desses indivíduos. Encontrou-se uma correlação positiva entre a CL50 e R2 , mas negativa entre a CL50 e S e S/R1. O bioensaio, apoiado pelo teste colorimétrico, mostrou-se como uma ferramenta capaz de estimar com precisão tanto uma população com alta freqüência de indivíduos suscetíveis quanto outra com elevada proporção de indivíduos resistentes e altamente resistentes.

CL50; resistência a pirimicarbe; pulgão


The objective of this research was to evaluate the relationship between the total activity of carboxylesterase and the resistance of M. persicae populations to pirimicarb. The aphids were collected on potato plants in Contenda and Piraí do Sul, PR and Ibicoara, BA, Brazil. For the bioassay, five replicates for each concentration were prepared with 10 aphids placed in plastic vials with a fine fabric mesh on the bottom, and dipped into pirimicarb concentrations (%) at 0.0031; 0.0062; 0.0125; 0.025; 0.05, and 0.1%, during 10 seconds, then dried on filter paper. After 1h inside a 25°C chamber, the aphids were examined under a stereomicroscope, recording the number of dead insects. The carboxylesterase activity was assessed by in vitro colorimetric technique. A simple correlation was established between the results of the LC50 bioassay and the frequency of M. persicae resistant variants. According to the absorbance level, the aphids were classified as variants S; S/R1 (S or R1); R1; R1/R2 (R1 or R2); R2 and R3, respectively susceptible; partially resistant, resistant and highly resistant. It was found a significant positive correlation between the LC50 and the frequency of R2 forms and a significant negative correlation between LC50 and the frequency of S and S/R1 forms. The colorimetric data supported the bioassay results, indicating that the bioassay was precise enough to determine either populations with high frequency of susceptible individuals or population with high proportion of resistant and highly resistant individuals.

CL50; green peach aphid; pirimicarb resistance


CROP PROTECTION

Relação entre a atividade de esterases e a resistência de Myzus persicae (Sulz.) (Sternorrhyncha:Aphididae) a pirimicarbe

Relationship between esterases activity and the resistance of Myzus persicae (Sulz.) (Sternorrhyncha: Aphididae) to pirimicarb

Rui S. FuriattiI; Sonia M.N. LazzariII

IDepto. Fitotecnia e Fitossanidade, Universidade Estadual de Ponta Grossa, C. postal 992, 84100-970, Ponta Grossa, PR

IIDepto. Zoologia, Universidade Federal do Paraná, C. postal 19020, 81531-980, Curitiba, PR

RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre a atividade total das esterases e a resistência de indivíduos de M. persicae a inseticidas em populações coletadas em plantas de batata, em Contenda e Piraí do Sul, PR e Ibicoara, BA. No bioensaio, os afídeos foram colocados em recipientes de plástico transparente com o fundo coberto por uma tela de malha fina, em cinco repetições de 10 indivíduos para cada concentração. O conjunto foi mergulhado em concentrações (%) de pirimicarbe a 0,0031; 0,0062; 0,0125; 0,025; 0,05 e 0,1%, durante 10 segundos e depois secos em papel filtro. Após uma hora em câmaras a aproximadamente 25°C, os afídeos foram examinados sob microscópio estereoscópico, anotando-se o número de insetos mortos. A atividade de carboxilesterase foi medida através de ensaio colorimétrico in vitro. De acordo com os níveis de absorbância, os afídeos foram classificados em S; S/R1 (S ou R1); R1; R1/R2 (R1 ou R2); R2 e R3 (suscetível; suscetível/ levemente resistente; levemente resistente; levemente resistente/ altamente resistente; altamente resistente e extremamente resistente, respectivamente). Foi efetuada uma correlação simples entre os resultados das CL50 obtidas no bioensaio e a freqüência desses indivíduos. Encontrou-se uma correlação positiva entre a CL50 e R2 , mas negativa entre a CL50 e S e S/R1. O bioensaio, apoiado pelo teste colorimétrico, mostrou-se como uma ferramenta capaz de estimar com precisão tanto uma população com alta freqüência de indivíduos suscetíveis quanto outra com elevada proporção de indivíduos resistentes e altamente resistentes.

Palavras-chave: CL50, resistência a pirimicarbe, pulgão

ABSTRACT

The objective of this research was to evaluate the relationship between the total activity of carboxylesterase and the resistance of M. persicae populations to pirimicarb. The aphids were collected on potato plants in Contenda and Piraí do Sul, PR and Ibicoara, BA, Brazil. For the bioassay, five replicates for each concentration were prepared with 10 aphids placed in plastic vials with a fine fabric mesh on the bottom, and dipped into pirimicarb concentrations (%) at 0.0031; 0.0062; 0.0125; 0.025; 0.05, and 0.1%, during 10 seconds, then dried on filter paper. After 1h inside a 25°C chamber, the aphids were examined under a stereomicroscope, recording the number of dead insects. The carboxylesterase activity was assessed by in vitro colorimetric technique. A simple correlation was established between the results of the LC50 bioassay and the frequency of M. persicae resistant variants. According to the absorbance level, the aphids were classified as variants S; S/R1 (S or R1); R1; R1/R2 (R1 or R2); R2 and R3, respectively susceptible; partially resistant, resistant and highly resistant. It was found a significant positive correlation between the LC50 and the frequency of R2 forms and a significant negative correlation between LC50 and the frequency of S and S/R1 forms. The colorimetric data supported the bioassay results, indicating that the bioassay was precise enough to determine either populations with high frequency of susceptible individuals or population with high proportion of resistant and highly resistant individuals.

Key words: CL50, green peach aphid, pirimicarb resistance

A resistência do afídeo Myzus persicae (Sulz.) foi registrada em 31 países, envolvendo o total de 69 inseticidas diferentes, entre piretróides e organofosforados (Georghiou 1990). Está ligada principalmente à amplificação gênica na produção da esterase 4 (E4) ou da sua isoenzima FE4, as quais detoxificam ou seqüestram a molécula do inseticida (Devonshire & Moores 1982). Outro mecanismo de resistência identificado, recentemente, em M. persicae por Graham et al. (1994), caracteriza-se pela presença de acetilcolinesterase (AChE) insensível ao pirimicarbe, com o aumento da resistência de até 15 vezes, em condições de laboratório.

A detecção da resistência pode ser feita através de bioensaios, envolvendo comparações de doses ou concentrações letais ou de inclinações das retas de respostas a doses ou concentrações de um determinado ingrediente ativo. Os testes bioquímicos também podem ser utilizados e incluem a detecção da atividade enzimática em homogeneizados do inseto, usando substratos modelos, ou antissoros específicos para isolar a atividade da enzima que confere a resistência, ou ainda, a detecção da seqüência específica do DNA (ffrench-Constant & Roush 1990).

As técnicas de bioensaios com afídeos utilizadas pelos pesquisadores para estudos da resistência são muito variadas. Devonshire & Rice (1988) realizaram uma revisão bibliográfica sobre o assunto, levantando as vantagens e desvantagens de cada uma das técnicas. Entre essas, a técnica de imersão dos indivíduos recomendada pela FAO (1979), é a mais simples, considerando o equipamento, o custo mais baixo e a rapidez para a obtenção dos resultados. Essa técnica garante o contato de todos os afídeos testados com o inseticida, e mediante esse processo, foi possível identificar 90% dos indivíduos resistentes e suscetíveis de M. persicae coletados na Inglaterra em 1976, incluindo cinco amostras que só possuíam formas suscetíveis. Esses resultados foram confirmados pela técnica de eletroforese por Sawicki et al. (1978).

Os bioensaios são muito efetivos para a detecção da resistência, estimando a freqüência de indivíduos resistentes, quando a ocorrência destes é relativamente alta. Entretanto, quando a proporção é baixa, em particular quando a resposta dos indivíduos resistentes e suscetíveis se sobrepõe nas curvas de concentração-resposta, a determinação de uma concentração discriminante é difícil de ser estabelecida através dos bioensaios convencionais. Em tais circunstâncias a detecção da resistência através de métodos bioquímicos é valiosa (Sawicki et al. 1977), desde que se consiga amostrar os indivíduos resistentes.

Os testes bioquímicos mais utilizados na caracterização de variantes de M. persicae resistentes a inseticidas são a eletroforese, o teste de imunidade e o teste colorimétrico que mede a atividade total das esterases. A separação das formas através da eletroforese é demorada e a interpretação das bandas das esterases E4/FE4 é subjetiva, já o teste de imunidade requer a purificação das esterases, a separação da imunoglobulina (IgG) e um controle rigoroso do teste. A avaliação colorimétrica da atividade total das carboxilesterases, embora com poder discriminatório inferior ao teste de imunidade, é um método robusto e acessível para estimar a resistência de M. persicae no campo (Devonshire et al. 1992), minimizando as dificuldades associadas à avaliação subjetiva da intensidade das bandas no gel de eletroforese (Sawicki et al. 1978).

A freqüência de indivíduos resistentes ou suscetíveis de M. persicae em uma determinada população deve estar relacionada com a estimativa da CL50. Porém, Devonshire & Needham (1975) não encontraram relação consistente entre a atividade total das carboxilesterases e os resultados do bioensaio. Esses autores sugeriram que as discrepâncias observadas resultaram da insensibilidade da técnica do bioensaio para medir as pequenas diferenças na suscetibilidade desses afídeos e à heterogeneidade da população, considerando apenas as formas suscetíveis ou resistentes.

A detecção da forma resistente que mais interfere na estimativa da CL50 das populações de campo de M. persicae é importante na determinação da concentração diagnóstica para o monitoramento da resistência desta espécie. Nesta pesquisa utilizou-se um bioensaio de imersão com o inseticida pirimicarbe, calibrado com os resultados da avaliação da atividade total das carboxilesterases, para medir a intensidade da resistência e avaliar a relação entre a freqüência de indivíduos resistentes/suscetíveis de M. persicae com a CL50 de populações de campo de batata, nos estados do Paraná e Bahia.

Material e Métodos

Foram coletadas duas populações de M. persicae em Contenda, PR uma em Piraí do Sul, PR e seis populações em Ibicoara, BA (Tabela 1), em campos comerciais de batata, no período de 1993 a 1995. Foram selecionadas 400 plantas em cada amostragem, distantes umas das outras em pelo menos 2 m para evitar colônias clonais. Os afídeos foram coletados juntamente com os folíolos de cada planta sorteada, colocados em sacos plásticos com papel absorvente para evitar excesso de umidade, etiquetados e levados ao laboratório.

Os bioensaios com inseticida foram realizados no mesmo dia da coleta; enquanto que os afídeos destinados ao teste colorimétrico foram mantidos em freezer a -15°C. O número de afídeos congelados, dependia do tamanho da população, procurando-se armazenar em torno de 200 indivíduos para cada local de coleta.

A metodologia utilizada no bioensaio foi modificada de Sawicki et al. (1978). Para cada concentração de pirimicarbe foram feitas quatro repetições de 10 afídeos adultos, colocados em recipientes de plástico transparente com o fundo coberto por uma tela de malha fina, presa por uma tira de borracha. O conjunto foi mergulhado em concentrações (g i.a./L) de pirimicarbe a 0,0031; 0,0062; 0,0125; 0,025; 0,05 e 0,1%, durante 10 segundos e depois secos em papel filtro. Após 1h em câmaras com temperatura entre 20°C e 25°C, os afídeos foram examinados sob microscópio estereoscópico. A avaliação da atividade total das esterases - teste colorimétrico - seguiu a metodologia proposta por Devonshire et al. (1992). Ambas estão descritas em Furiatti & Lázzari (2000a, b).

Os resultados obtidos através da técnica da imersão foram submetidos à análise de Probit para estimar a CL50, utilizando o programa POLO-PC (LeOra Software 1987). Foi efetuada uma correlação simples entre os resultados da CL50 e a freqüência de cada um das variantes de M. persicae caracterizadas pelo teste colorimétrico das carboxilesterases totais.

A razão de resistência (RR) foi calculada pela divisão entre a CL50 da população resistente e a CL50 da população suscetível (Contenda 1), utilizando-se o programa estatístico SANEST.

Resultados e Discussão

De acordo com os níveis de absorbância, os afídeos foram classificados em S; S/R1 (S ou R1); R1; R1/R2 (R1 ou R2); R2 e R3 (suscetível; suscetível/ levemente resistente; levemente resistente; levemente resistente/ altamente resistente; altamente resistente e extremamente resistente, respectivamente), modificando-se os níveis propostos por Devonshire et al. (1992), pois, considerou-se que nos resultados da avaliação das esterases totais, há formas que se sobrepõem em determinadas faixas de comprimento de onda em função do maior ou menor grau de resistência (Tabela 2).

Ffrench-Constant et al. (1988) observaram alta freqüência de indivíduos de M. persicae intermediários entre R1 e R2 em colza e entre R2 e R3 em batata, em áreas onde se usou inseticidas repetidamente, porém essas formas não receberam denominação especial. Os resultados encontrados para a colza são semelhantes aos observados neste trabalho, no qual se utilizou uma adaptação dos níveis de absorbância para os resultados do teste com as esterases, originalmente proposto por Devonshire et al. (1992), no qual, como já foi discutido anteriormente, ocorre a sobreposição de S/R1 e R1/R2.

Numa comparação entre o teste com as esterases totais e o teste de imunidade, Devonshire et al. (1992), demonstraram que todos os variantes são caracterizados perfeitamente no teste de imunidade, porém, com o teste das esterases totais, o S se sobrepõe ao R1 na faixa de 0,3 a 0,4 nm, e o R1 e R2 se sobrepõem na faixa de 0,5 a 0,8 nm.

Parte dos indivíduos R1/R2 (R1 ou R2) detectados nesta pesquisa e classificados segundo proposta adaptada de Devonshire et al. (1992), podem ser formas intermediárias entre R1 e R2, concordando com ffrench-Constant et al. (1978), os quais constataram alta freqüência de indivíduos moderadamente resistentes pelo teste de imunidade. Outro fato que reforça esta conclusão é a resposta diferenciada dos R1/R2 à seleção dos mesmos, após a aplicação do inseticida pirimicarbe.

As CL50s estimadas demonstraram grande variação na resistência das populações estudadas. Essa variação foi confirmada pela freqüência de variantes resistentes do inseto determinada pela medição da atividade total das esterases (Tabela 3). Para o cálculo da razão da resistência (RR), usou-se como referência a população suscetível Contenda 1 que foi a mais suscetível e que foi coletada no outono de 1993 em horta caseira, onde não havia aplicação de inseticidas. Pela Tabela 1, observa-se que a RR variou de 2,0 a 9,2 entre as populações.

A população Contenda 2, apesar do c2 significativo (P < 0,001), indicando que os resultados do bioensaio não se enquadram no modelo de Probit por tratar-se de população altamente heterogênea, foi a única população com alta freqüência de S e foi analisada bioquimicamente.

O coeficiente de correlação entre a CL50 e a freqüência de cada uma das variantes para a resistência são apresentados na Tabela 4, onde se observa que a correlação foi positiva com a forma R2 e negativa com a forma S e S/R1, demonstrando que R2 tem maior influência na estimativa da CL50 das populações de M. persicae.

Os afídeos caracterizados como R1/R2, que podem ser R1 ou R2 ou intermediários entre essas formas, mostraram relação não significativa com a CL50, provavelmente devido à presença das três formas caracterizadas nesta classificação.

O bioensaio de imersão foi capaz de discriminar com certa precisão, confirmada pelo teste colorimétrico, uma população com alta proporção de S e ausência de R2 e R3 (população Contenda 1) e uma população com alta proporção de R2 e R3 e ausência de S (população Ibicoara 6), conforme se observa na Tabela 1.

Devonshire & Needham (1975) não encontraram relação consistente entre a atividade total das esterases e os resultados do bioensaio com o inseticida demetom-S-metil, aplicado topicamente nos indivíduos de M. persicae. Segundo os autores, esse resultado negativo estaria ligado à insensibilidade da técnica do bioensaio utilizado para medir pequenas diferenças na suscetibilidade do afídeo e à heterogeneidade da população, na qual uma baixa proporção de indivíduos com um aumento da E4/FE4 não poderia ser revelada.

Com base nos resultados desta pesquisa conclui-se que há uma relação positiva entre a freqüência de indivíduos resistentes R2 de M. persicae e a CL50 de populações de campo em plantas de batata, e que a relação é negativa para a forma suscetível do afídeo. A detecção das formas R2 tem grande importância na estimativa da CL50 da população de M. persicae, a qual deve ser visada no monitoramento da resistência da espécie.

Literatura Citada

Received 15/07/03

Accepted 10/10/03

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    09 Mar 2004
  • Data do Fascículo
    Dez 2003

Histórico

  • Aceito
    10 Out 2003
  • Recebido
    15 Jul 2003
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