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Neotropical Entomology

versão impressa ISSN 1519-566Xversão On-line ISSN 1678-8052

Neotrop. Entomol. v.34 n.4 Londrina jul./ago. 2005

https://doi.org/10.1590/S1519-566X2005000400005 

SYSTEMATICS, MORPHOLOGY AND PHYSIOLOGY

 

Dissimilaridade genética de linhagens de Trichogramma Westwood (Hymenoptera: Trichogrammatidae) através de marcadores moleculares ISSR

 

Genetic dissimilarity of lines of Trichogramma Westwood (Hymenoptera: Trichogrammatidae) through ISSR markers

 

 

Regina da S. BorbaI; Mauro S. GarciaI; Adalécio KovaleskiII; Antônio C. OliveiraIII; Paulo D. ZimmerIII; Juliana S. Castelo BrancoIII; Gaspar MaloneIII

IDepto. Fitossanidade
IIEmbrapa Uva e Vinho, C. postal 1513, 95200-000, Vacaria, RS
IIIDepto. Fitotecnia. UFPel. C. postal 354, 96010-970, Pelotas, RS

 

 


RESUMO

A demanda por processos agrícolas racionais, em detrimento da utilização de estratégias convencionais, tem contribuído para o desenvolvimento de técnicas de controle biológico, como a utilização de parasitóides de ovos do gênero Trichogramma Westwood. Um entrave para sua utilização é a dificuldade na identificação das espécies, devido ao diminuto tamanho e à similaridade morfológica. Os marcadores moleculares acessam o genoma, evitando o efeito ambiental e conseqüentemente erros de identificação. Várias técnicas estão disponíveis e a técnica ISSR vem sendo empregada para a diferenciação rápida entre indivíduos próximos, devido ao elevado grau de polimorfismo, reprodutibilidade e baixo custo. Este trabalho objetivou mensurar o nível de diferenciação genética de linhagens de Trichogramma, mediante o emprego da técnica de ISSR. Cinco linhagens foram estudadas: três da espécie T. pretiosum Riley, uma da espécie T. atopovirilia Oatman & Platner e uma da espécie T. bruni Nagaraja. A identificação morfológica dos parasitóides foi realizada na ESALQ/USP, Piracicaba, SP. Após a extração do DNA e sua padronização, realizaram-se as reações de PCR utilizando-se 26 marcadores ISSR, dos quais 11 foram selecionados por apresentarem maior polimorfismo e consistência. Os dados moleculares foram transformados em matriz binária e analisados pelo programa estatístico NTSYS v. 2.1. Os 11 marcadores utilizados geraram 172 bandas polimórficas. A similaridade genética variou de 19% a 96%, permitindo concluir que a técnica ISSR é eficiente na identificação de polimorfismo de DNA em Trichogramma. Além disso, os resultados sugerem uma variação acentuada inter e intra-específica.

Palavras-chave: Biologia molecular, microhimenóptero, identificação, controle biológico


ABSTRACT

Demands for sustainable agricultural systems have forested the development of biological control techniques, such as the use of the egg parasitoid Trichogramma Westwood. However, the arduous identification of the parasitoid at the species level, due to the tiny size and the morphological similarities is an obstacle to increasing its use. Molecular markers are useful to reach the specimen genome and avoid environmental effects that could misguide identification. Several molecular markers techniques are available and the ISSR technique has been used to differentiate close individuals, due to its high polymorphism level, reproducibility and low cost. The objective of this study was to measure the level of genetic differentiation among five lines of Trichogramma, using ISSR markers: three belonging to the species T. pretiosum Riley, one to T. atopovirilia Oatman & Platner and one to T. bruni Nagaraja. Morphological identification of the parasitoids was conducted at ESALQ/USP - Piracicaba, SP. After DNA removal and standatization, PCR reactions were performed with 26 ISSR primers; 11 of them were selected because they presented greater polymorphism and consistency. Molecular data were converted into a binary matrix and analyzed (NTSYS v. 2.1). The 11 primers produced 172 polymorphic sections. Genetic similarity ranged from 19% to 96%, showing that the ISSR technique can efficiently identify DNA polymorphism in Trichogramma. Results also indicate important inter and intra-specific variations among the parasitoid lines.

Key words: Molecular biology, microhymenopteran, identification, biological control


 

 

Para se ter sucesso em um programa de controle biológico com Trichogramma Westwood é necessário selecionar a espécie e linhagem do parasitóide que controle mais eficientemente a praga, e que melhor se adapte à cultura e às condições climáticas da região onde será utilizado (Hassan 1997). Portanto a correta identificação das espécies de Trichogramma é imprescindível.

Devido ao tamanho diminuto e à similaridade morfológica, a identificação das espécies de Trichogramma tem sido problemática. Anteriomente, a identificação era realizada pelo estudo da morfologia externa dos adultos com a utilização de caracteres como a coloração, o comprimento e a densidade das cerdas na asa e o comprimento das cerdas na antena para a separação das espécies. Entretanto, esses caracteres variam com o tamanho do corpo e fatores ambientais. Devido à pequena confiabilidade dos caracteres morfológicos, os esforços para a identificação foram concentrados nos aspectos biológicos e reprodutivos (Parra & Zucchi 1997). Em decorrência disso, Nagarkatti & Nagaraja (1971) mostraram a importância da genitália do macho como caráter na identificação específica e um grande avanço ocorreu na identificação das espécies de Trichogramma, sendo que no momento são conhecidas aproximadamente 180 espécies (Pinto 1998).

Atualmente, o parasitóide é identificado taxonomicamente em nível de espécie através da morfologia da genitália do macho (Pinto & Stouthamer 1994). No entanto, em alguns casos, a identificação é dificultada pelo tamanho reduzido do indivíduo (0,25 mm) e/ou a presença de espécies crípticas.

A biologia molecular vem sendo bastante utilizada na identificação taxonômica de diversos grupos de insetos. Métodos simples de preservação de espécies de Dalbulus maidis (DeLong & Wolcoot) (Hemiptera: Cicadellidae) quanto à quantidade e qualidade do DNA, para análise com RAPD, foram testados após períodos sucessivos de armazenamento (Oliveira et al. 2002). O seqüenciamento da região ITS2 (espaço interno transcrito) do rDNA tem sido usado para identificar duas espécies próximas de Trichogramma: T. rojasi Nagaraja & Nagarkatti e T. lasallei Pinto (Ciociola Jr. et al. 2001). A análise da seqüência do rDNA das duas espécies difere em número e posição dos nucleotídeos, mostrando que são distintas. Os resultados mostram que análises moleculares são uma boa alternativa para identificação de espécies crípticas de Trichogramma. Desse modo, espécies particularmente de difícil identificação com o emprego das técnicas taxonômicas tradicionais podem ter suas identidades esclarecidas mediante o emprego de técnicas moleculares do seqüenciamento ou do polimorfismo do comprimento de seqüências gerado através das técnicas de marcadores moleculares.

Dentre as técnicas de marcadores moleculares com grande potencial para a identificação de espécies de insetos, a técnica de ISSR ("Inter simple sequence repeat amplification") (Zietkiewicz et al. 1994) se destaca devido ao elevado grau de polimorfismo, reprodutibilidade e baixo custo (Salimath et al. 1995).

Os dados moleculares representam valiosa fonte de caracteres alternativos para a taxonomia de Trichogramma. Tal recurso é necessário para testar os conceitos de "parentesco", que atualmente fundamentam-se bastante nos limitados dados morfológicos. As características moleculares também são potencialmente valiosas para a distinção de fêmeas, pois até agora todas as identificações são baseadas nos machos, e formas telítocas. Outra vantagem da identificação molecular é a identificação de variantes intra-específicos, os quais são geralmente indistingüíveis morfologicamente, mas potencialmente importantes para o controle biológico (Pinto 1997, 1998).

O objetivo deste trabalho foi mensurar o nível de diferenciação genética de linhagens de Trichogramma através da análise do DNA, mediante o emprego da técnica de ISSR.

 

Material e Métodos

O trabalho foi realizado no Centro de Genômica e Fitomelhoramento do Departamento de Fitotecnia e no Laboratório de Biologia de Insetos do Departamento de Fitossanidade da Faculdade de Agronomia "Eliseu Maciel" (FAEM) da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), no ano de 2002.

Coleção de Trichogramma. Foram estudadas cinco linhagens: três da espécie T. pretiosum Riley, uma da espécie T. atopovirilia Oatman & Platner, e uma da espécie T. bruni Nagaraja. As linhagens de T. pretiosum foram coletadas em pomares de macieira nos municípios de Vacaria, RS e Bento Gonçalves, RS; a espécie T. atopovirilia foi fornecida pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), Petrolina, PE; e a espécie T. bruni foi coletada em ovos de Heliconius phyllis (Fabricius) em Piracicaba, SP.

As linhagens estudadas foram identificadas através de caracteres morfológicos, na ESALQ, Piracicaba, SP, e passaram a fazer parte da criação do Laboratório de Biologia de Insetos, DFs, FAEM, UFPel, RS.

Extração de DNA. Para a extração do DNA genômico foi utilizado o protocolo descrito por Olerup & Zetterquist (1994), com algumas modificações. Para cada uma das cinco linhagens foram realizadas duas extrações independentes. Utilizou-se em torno de 100 indivíduos (machos e fêmeas) de cada linhagem por extração. Ao invés de as amostras serem maceradas em nitrogênio líquido, estas foram maceradas diretamente em 500 µl de tampão de extração (Tris HCl 10 mM pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 10 mM pH 8,0; SDS 0,5%) adicionado de proteinase K (20 µg ml). Posteriormente as amostras foram incubadas por 2h a 37ºC e centrifugadas por seis min. a 14000 g, a temperatura ambiente. Em seguida adicionou-se 260 µl de TE, 240 µl de NaCl 5M; procedeu-se nova centrifugação por 15 min. a 14000 g e transferiu-se o sobrenadante para novo tubo, adicionando em torno de 1000 µl de etanol absoluto, o que equivale a duas vezes a quantidade de sobrenadante, seguido de nova centrifugação por 15 min. a 14000 g, lavagem com 200 µl de etanol 70% gelado e centrifugado por cinco min. a 14000 g. O DNA foi ressuspendido em 50 µl de TE pH 8,0.

A quantificação do DNA total foi realizada por eletroforese com gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo (Sambrook et al. 1989), através da comparação com bandas de concentração conhecida.

Análise de ISSR. Foram testados 26 marcadores de um set de 100 marcadores obtidos da University of British Columbia, dos quais, 11 apresentaram bandas consistentes (UBC 815, 825, 835, 840, 841, 842, 845, 850, 855, 860 e 880).

As reações foram realizadas conforme protocolo descrito a seguir: 625 µM de cada dNTP; 2,5 µM marcadores; 0,5 unidade de Taq polimerase; 1,5 mM MgCl2; 50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl pH 9,0; 0,1 µlml-1 de gelatina e 0,1 µlml-1 de Triton X-100, no volume final de 20 µl. As reações de amplificação foram realizadas em um aparelho de PCR PTC – 100, com uma fase inicial de desnaturação a 94ºC por 90 segundos, seguida de 40 ciclos a 94ºC por 30 segundos, 45ºC por 45 segundos e 72ºC por 90 segundos. O último passo constituiu uma fase de extensão final a 72ºC por cinco min. Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em poliacrilamida 7%, em cuba de seqüenciamento manual Modelo Hoesche, por tempo aproximado de 2h, e à potência elétrica constante de 60W. O gel foi corado com nitrato de prata a 0,2%, conforme protocolo de revelação de Briard et al. (2000).

Análise Estatística. Através da avaliação do perfil de bandas, obteve-se a matriz binária atribuindo-se 1 para presença e 0 para ausência da banda. A análise dos dados foi realizada através do Programa NTSYS pc 2.1 (Rohlf 2000), que utiliza o método UPGMA (Unweighted Pairwise Group Method using Arithmetic Average). Com isso obteve-se a matriz de similaridade e o coeficiente da distância genética média (Nei & Li 1979), possibilitando a construção do cladograma.

 

Resultados e Discussão

Dos 11 marcadores utilizados no trabalho (815, 825, 835, 840, 841, 842, 845, 850, 855, 860 e 880), foi gerado o total de 172 bandas. Os números mínimo e máximo de bandas observadas foram 8 (marcador 815, 850 e 880) e 31 (marcador 835), respectivamente, com uma média de 16 bandas por marcador. Esse resultado caracteriza elevada capacidade na detecção de polimorfismo através dessa técnica. O mesmo ocorreu em outros trabalhos: com sorgo (Yang et al. 1996, Oliveira et al. 1996) e Eleusine (Salimath et al. 1995).

O grau de consistência da técnica foi medido através da análise de duas amostras independentes de cada linhagem. Todos os locos analisados estavam presentes nas duas extrações independentes (Fig. 1), caracterizando o elevado grau de consistência da técnica de ISSR no estudo do polimorfismo de DNA em gêneros Trichogramma. Resultados semelhantes foram obtidos por Yang et al. (1996) em sorgo.

 

 

Dentre as cinco linhagens de Trichogramma analisadas, aproximadamente 96% das bandas foram polimórficas, caracterizando elevado grau de polimorfismo na população estudada e sugerindo que as dificuldades enfrentadas na identificação das espécies baseada em critérios morfológicos decorrem da alta diversidade genética das populações.

Através da Matriz de Similaridade Genética (Fig. 2), construiu-se o cladograma, mostrando que as linhagens 2 e 3 de T. pretiosum são as mais próximas geneticamente, com 96% de similaridade; a espécie T. atopovirilia (número 4) apresentou, aproximadamente, 93% de similaridade em relação às duas anteriores. A linhagem 1 de T. pretiosum demonstrou ter 50% de similaridade genética em relação às linhagens 2, 3 e 4. A espécie mais distante geneticamente, dentre todas analisadas, foi T. bruni (número 5), com apenas 19% de similaridade genética em relação às outras linhagens (Fig. 3).

 

 

A distância genética média (67,57%) foi utilizada como ponto de corte para a formação dos grupos. Três grupos foram formados, um deles incluindo os genótipos 2, 3 e 4, e outros dois contendo os genótipos 1 e 5, respectivamente.

Os resultados encontrados conflitam com o esperado pois posicionam uma das linhagens de T. pretiosum mais distante das outras duas. Uma possível explicação é que a linhagem 1 é mais variável geneticamente, sendo detectada maior variação dentro da espécie T. pretiosum do que entre T. pretiosum e T. atopovirilia. Essa hipótese deve ser testada com maior número de amostras das linhagens estudadas. Entretanto, a ocorrência de erro na identificação das espécies e/ou contaminação em laboratório, não podem ser descartadas, por haver espécies e/ou linhagens muito agressivas, ou por estas se adaptarem mais facilmente ao hospedeiro Anagasta kuehniella (Zeller), podem vir a invadir os tubos de criação de outra espécie durante o manuseio, misturando-se a esta e "dominando" a população existente no laboratório (Botelho 1997, Zucchi & Monteiro 1997).

A espécie T. bruni foi a mais distante das demais estudadas sugerindo que a pressão de seleção ou hábito de parasitismo esteja diferindo nesta espécie. Estudos caracterizando o comportamento de parasitismo da espécie e comparando com as demais, sugerem que T. bruni não é tão eficiente em parasitar a lagarta enroladeira da maçã, Bonagota cranaodes (Meyrick), quando comparada com as outras quatro linhagens (dados não publicados). A diferença no comportamento de parasitismo desse hospedeiro específico é consistente com as diferenças encontradas em nível molecular.

Pode-se concluir que a técnica ISSR é eficiente na identificação de polimorfismo de DNA em indivíduos do gênero Trichogramma, permitindo minimizar o tempo gasto com sua identificação, bem como facilitar o processo, o que vai contribuir, em muito, na utilização desse importante parasitóide de ovos em programas de controle biológico de pragas.

 

Literatura Citada

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Received 22/XI/04. Accepted 01/III/05.

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