Associação de bioensaios e caracterização molecular para seleção de novos isolados de Bacillus thuringiensis efetivos contra Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae)

Association of bioassays and molecular characterization to select new Bacillus thuringiensis isolates effective against Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae)

BIOLOGICAL CONTROL

Associação de bioensaios e caracterização molecular para seleção de novos isolados de Bacillus thuringiensis efetivos contra Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae)

Association of bioassays and molecular characterization to select new Bacillus thuringiensis isolates effective against Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae)

Júlio C. Fatoretto^I; Janete A.D. Sena^I; Marliton R. Barreto^II,*; Manoel V.F. Lemos^I; Arlindo L. Boiça Junior^III

^IDepto. Biologia Aplicada à Agropecuária; Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP/Jaboticabal, 14.870-000. Jaboticabal, SP

^IIUniv. Federal do Mato Grosso – UFMT / Instituto Universitário do Norte Matogrossense – IUNMAT, Campus de Sinop, Av. Alexandre Ferronato, n. 1200, 78550-000, Sinop, MT; [e-mail]

^IIIDepto. Fitossanidade; Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP/Jaboticabal, 14.870-000. Jaboticabal, SP

RESUMO

A lagarta de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) é uma das principais pragas do milho e para seu controle o Bacillus thuringiensis se destaca por sua atividade entomopatogênica. Este trabalho objetivou a caracterização molecular de isolados de B. thuringiensis quanto à presença do gene cry1 e a avaliação da sua eficiência no controle de lagartas de S. frugiperda. Nas análises da PCR, foi utilizado o Gral-cry1 para confirmação da presença do gene cry1 nos 115 isolados. Uma suspensão de 3 x 10⁸ esporos/ml banhou a dieta utilizada para alimentação de 30 lagartas por isolado, com três repetições. A identificação do tipo de genes cry1 dos diferentes isolados foi realizada para cinco sub-classes de genes e análises de regressão linear foram realizadas para verificar possíveis associações entre a presença de um gene cry individual e altos níveis de toxicidade. Ttodos os DNAs amplificados com os iniciadores Gral-cry1 apresentaram produto de amplificação com tamanho esperado. Quanto aos níveis de eficiência inseticida contra a lagarta-do-cartucho, 41 isolados apresentaram 100% de mortalidade e 16 apresentaram índice entre 75% e 90%. O gene cry1Ab esteve presente em 80 isolados, cryB em 69 isolados, cry1Ac em todos os isolados, cryV e cry1E em 93 e 27 isolados, respectivamente. Os valores referentes ao efeito individual de cada gene na mortalidade de larvas foram significativos a 1% de probabilidade, para os genes cry1Ac e cry1E.

Palavras-chave: Lagarta-do-cartucho, cry1, bactéria, prospecção, gene

ABSTRACT

The fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J. E. Smith), is one of the main corn pests and Bacillus thuringiensis is important in its control because of its entomopathogenic property. The objective of this study was the molecular characterization of B. thuringiensis isolates for cry1 locus presence and the assessment of the efficiency of these isolates in controlling S. frugiperda caterpillars. Gral-cry1 was used in the PCR analyses to confirm the presence of the cry1 locus in 15 isolates. A 3 x 10⁸ spore/ml suspension bathed the diet used to feed 30 caterpillars per isolate, with three replications. The cry1 locus type genes of the different isolates were identified for five gene subclasses; linear regression analyses were carried out to ascertain possible associations between the presence of an individual cry1 locus gene and high levels of toxicity. All the DNAs amplified with Gral-cry1 presented an amplification product with the expected size. Regarding the levels of insecticide efficiency against the cob worm, 41 isolates presented 100% mortality and 16 presented an index between 70% and 90%. The cry1Ab gene was present in 80 isolates, cryb in 69 isolates, cry1Ac in all the isolates and cryv and cry1E in 93 and 27 isolates, respectively. The values regarding the individual effect of each gene on caterpillar mortality were significant at 1% probability for the cry1Ac and cry1E genes.

Key words: Fall armyworm, cry1, bacteria, prospection, gene

A lagarta do cartucho, Spodoptera frugiperda (J. E. Smith), é uma das principais pragas da cultura do milho em todas as regiões do Brasil. Quanto aos hospedeiros naturais da praga, Labrador (1967) cita a preferência pelas gramíneas como milho, sorgo, arroz, cana-de-açúcar e pastagens naturais e artificiais. Seu controle é realizado basicamente com inseticidas químicos, cuja utilização abusiva tem trazido vários problemas que decorrem desde a falta de especificidade dos produtos, até o seu acúmulo no meio ambiente ocasionando sérios problemas de poluição, e originando somas vultosas que, no caso do Brasil, são destinadas à importação dos inseticidas químicos (Pfeifer & Grigeiatti 1996).

Hoje são conhecidos muitos microrganismos entomopatogênicos, especialmente fungos, vírus e bactérias, que podem ser empregados no controle biológico de insetos praga (Valadares-Inglis et al. 1998). Dentre eles, Bacillus thuringiensis destaca-se por apresentar atividade tóxica contra cerca de 130 espécies de insetos das ordens Lepidoptera, Diptera e Coleoptera, onde se incluem importantes pragas agrícolas brasileiras como S. frugiperda, Diatraea saccharalis (Fabricius) e Anticarsia gemmatalis Hübner (Lereclus et al. 1993). O que caracteriza B. thuringiensis é a produção de uma inclusão protéica de formato cristalino, que confere a essa bactéria sua característica entomopatogênica. Esse cristal, sintetizado durante a fase de esporulação, é formado por polipeptídeos denominados d-endotoxinas, ou proteínas Cry, que vão sendo acumuladas na célula bacteriana. No final da esporulação, o cristal corresponde a cerca de 20-30% do peso seco da célula esporulada (Herrnstadt et al. 1986), sendo liberado juntamente com o esporo no momento da lise celular.

A variabilidade genética existente entre diferentes isolados de B. thuringiensis foi estudada principalmente por meio da utilização de técnicas que têm como base a PCR (Reação em Cadeia da DNA Polimerase), muitas vezes evidenciando a presença de genes desconhecidos e direcionando os trabalhos de bioensaios (Bravo et al. 1998, Cerón et al. 1995, Vilas-Bôas 2002, Lima et al. 2002). Este trabalho teve por objetivo a caracterização molecular de uma coleção de isolados de B. thuringiensis quanto à presença do gene cry1 e algumas de suas subclasses e a avaliação de sua eficiência no controle de lagartas de S. frugiperda.

Material e Métodos

A criação de S. frugiperda foi realizada conforme Barreto et al. (1999) utilizando-se três populações de lagartas provenientes do: 1) Departamento de Entomologia da ESALQ/USP, Piracicaba, SP; 2) Laboratório de Controle Biológico da EMBRAPA Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG; 3) Centro de Manejo Integrado de Pragas (CEMIP) da UNESP/Jaboticabal, SP. As populações permaneceram isoladas durante todo o experimento, não havendo cruzamentos entre elas.

A metodologia utilizada baseia-se na constatação de que a existência de raças tem fundamental importância na atual concepção da entomologia econômica, pois pode haver variação no consumo de alimento e, conseqüentemente, no nível de dano econômico para cada cultura, bem como comportamento diferenciado em relação a inseticidas e ao controle biológico (Pashley et al. 1987). Busato et al. (2004) e McMichael & Pashley (1999), em estudos com populações de S. frugiperda, apontam para a existência de maior similaridade genética entre populações de uma mesma planta hospedeira. Sugerem que a seleção natural via planta hospedeira foi o processo que orientou as populações para maior nível de adaptação, fato relatado por população de lagartas, e para maior a distância genética das populações de lagarta, como no caso da cultura do milho. A recombinação genética favorecida pela migração dos insetos adultos de S. frugiperda a grandes distâncias, que de acordo com Johnson (1987), pode chegar até 250 km, pode suprir a população com novas combinações ampliando a variabilidade genética.

Neste trabalho, foram utilizados 115 isolados de B. thuringiensis pertencentes à coleção do Laboratório de Genética de Bactérias - UNESP/Jaboticabal. Esses isolados já haviam sido caracterizados anteriormente como lepidóptero-específicos pela técnica da PCR (Vilas-Bôas 2002) e apresentaram amplificação com iniciadores gerais para o gene cry1.

Os isolados estudados foram provenientes de cinco regiões geográficas do território nacional sendo 47 isolados da Região Sul, 30 do Sudeste, 18 do Centro-Oeste, 10 do Nordeste, cinco do Norte, e cinco isolados foram provenientes de outros países. Dos 47 isolados da Região Sul, 38 foram obtidos em silos de armazenagem de grãos, os quais são considerados um ambiente excelente para isolamento de B. thuringiensis, por serem ricos em insetos (Meadows et al. 1992).

Nas análises da PCR, o DNA de cada um dos isolados foi obtido com a utilização da resina de troca iônica InstaGene Matrix (Bio-Rad). As colônias isoladas foram obtidas pela inoculação de uma alíquota da solução estoque de esporos em placas de Petri, contendo meio de cultura BHI ("Brain Heart Infusion" ou Infusão de Cérebro e Coração - Biobrás), as quais foram incubadas a 30ºC por 18h. As colônias foram coletadas, ressuspendidas em microtubos contendo 1,0 ml de água destilada esterilizada, seguindo-se de centrifugação a 15.000 x g por 2 min. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 200 µl da resina InstaGene Matrix. As suspensões contendo o DNA foram incubadas a 56ºC por 30 min. Em seguida, procedeu-se à agitação vigorosa dos tubos por 10 segundos, seguida de centrifugação a 15.000 x g por 5 min. Posteriormente, 200 µl do DNA obtido foi transferido para outro microtubo e armazenado a -20°C. O DNA das linhagens de B. thuringiensis var. kurstaki – HD-1 (lepidóptero-específicas) foi extraído e utilizado como controle positivo e o DNA da linhagem de B. thuringiensis var. tenebrionis, caracterizada como coleóptero-específica (Sekar et al. 1987), foi utilizado como controle negativo nos bioensaios e na amplificação com os iniciadores gerais Gral-cry1.

A quantificação do DNA das amostras foi realizada em espectrofotômetro (BECKMAN–DU 640), medindo-se a absorbância nos comprimentos de onda de 260 nm e 280 nm. Para estimar a concentração do DNA total utilizou-se o conceito padrão de que uma unidade de absorbância na densidade óptica de 260 nm equivale a 50 µg de DNA por ml de solução (Sambrook et al. 1989). A concentração média encontrada foi de 43,3 µg/ml de DNA.

Para confirmação da presença do gene cry1 nos isolados deste trabalho, foi utilizado o par de iniciadores gerais Gral-cry1 (Bravo et al. 1998). As reações de amplificação foram conduzidas no volume total de 20 µl contendo: 30 ng de DNA; 250 µM de uma solução de dNTPs; 2,0 mM de MgCl₂; 0,2 µM de cada um dos iniciadores; 1,0 U da enzima Taq DNA polimerase (GIBCO-BRL); solução tampão para reação de PCR (1x) e água Milli-Q (q.s.p 20 µl). As reações de amplificação foram realizadas utilizando um aparelho termociclador (PTC-100 Programmable Thermal Controller – MJ Research, inc.) com o seguinte programa: um ciclo de desnaturação de 2 min a 95ºC e 30 ciclos consistindo de um ciclo de desnaturação a 95ºC por 1 min; pareamento a 52ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 5 min.

Após as amplificações, 2 µl de tampão de amostra (loading buffer) (0,5% de azul de bromofenol em glicerol 50%) foram adicionados às amostras. Quinze microlitros de cada amostra foram aplicados em géis de agarose 1,5%, contendo brometo de etídeo (0,5 µg/ml) e submetidos à eletroforese horizontal por 2h à corrente elétrica de 80V constantes, conduzida em tampão TEB 1x (Tris 89 mM, EDTA 2,5 mM e ácido bórico 89 mM com pH 8,3), também adicionado de brometo de etídeo (0,5 µg/ml). Em todas as eletroforeses realizadas, foi utilizado como marcador o DNA Ladder (1Kb). Os géis de agarose foram visualizados sob luz UV e armazenados em fotodocumentador (GEL DOC 2000 - Bio-Rad).

Nos bioensaios, a partir de uma suspensão estoque de esporos, os isolados foram repicados em placas de Petri contendo meio de cultura (Nutriente Agar) sólido e incubados a 30ºC por 36h. Em seguida, coletou-se todo o conteúdo de esporos/cristal presentes na superfície do meio de cultura e ressuspendeu-se em 7,0 ml de água, homogeneizado e quantificado quanto ao número de esporos/ml da suspensão, por meio de leitura em câmara de Newbauwer obtendo-se na contagem a média de 3 x 10⁸ esporos/ml (Barreto et al. 1999).

Cubos de dieta artificial foram mergulhados na suspensão de esporos/cristais de cada isolado por 30 segundos, colocados isoladamente em copos (50 ml) e deixados à temperatura ambiente por 30 min. Posteriormente, lagartas de dois a três dias de idade foram colocadas nos copos. Estes foram tampados e levados para uma sala mantida a 25ºC, com umidade relativa do ar a 70% e fotofase de 14h de luz.

Foram utilizadas 30 lagartas por isolado, com três repetições. A dieta da testemunha foi banhada somente com água, e para o controle positivo foi utilizado o isolado HD-1 e, como controle negativo, utilizou-se a linhagem de B. thuringiensis var. tenebrionis (coleóptero-específica). As avaliações foram realizadas no terceiro, sexto e oitavo dias, após a exposição da lagarta à dieta contendo a suspensão esporo/cristal. Foram considerados eficientes apenas os isolados com índice de mortalidade igual a 100%. A mortalidade das lagartas por B. thuringiensis foi comprovada pela presença de esporos, através da observação das mesmas em microscópio óptico.

A identificação do tipo de genes cry1 dos diferentes isolados estudados foi realizada para cinco subclasses de genes: cry1Ab, cryB, cry1Ac, cry1IA e cry1E (Tabela 1). Os iniciadores para esses genes foram elaborados e otimizados no laboratório de Genética de Bactérias, UNESP-Jaboticabal, para a linhagem de B. thuringiensis var. kurstaki – HD-1 exceto os iniciadores Cry1E, os quais foram elaborados a partir da seqüência do gene cry1, linhagem de B. thuringiensis var. kenyae, disponível no banco de dados Gen Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), número acesso GI:46852034.

As reações de amplificação foram conduzidas em um volume de 20 µl contendo: 30 ng de DNA; 250 µM da solução de dNTPs; 1,5 mM de MgCl₂ para os iniciadores Cry1AB, Cry1B, Cry1Ac e Cry1IA e 2,0 mM para os iniciadores Cry1E; 0,5 µM de cada um dos pares de iniciadores Cry1AB, 1B, 1Ac e IA e 0,25 µM de cada um do par de iniciador Cry1E; 1,0 U da enzima Taq DNA polimerase (GIBCO-BRL); 1x solução tampão para reação de PCR e água Milli-Q (q.s.p. 20 µl). Como controle negativo foi utilizada água Milli-Q, em substituição ao DNA.

Nas reações de amplificação para os iniciadores Cry1B, Cry1AC, Cry 1IA e Cry1E foi utilizado o seguinte programa: um segmento de desnaturação de 2 min a 94ºC e 30 ciclos consistindo de um segmento de desnaturação a 94ºC por 1 min, um de pareamento a 54 °C por 1 min, e um último de extensão a 72ºC por 1 min. Ao final dos 30 ciclos, seguiu-se um segmento extra de extensão a 72ºC por 10 min. As condições do programa de amplificação feitas com os iniciadores Cry1AB foram similares, exceto na temperatura de pareamento que foi de 56ºC.

Após as amplificações, 15 µl de cada amostra foram misturados a 2 µl de tampão da amostra e aplicados em géis de agarose 1,5%, contendo brometo de etídeo (0,5 µg/ml) e submetidas a eletroforese horizontal por 2h a 80 V constante. A eletroforese foi conduzida em tampão TEB 1x (Tris 89 mM; EDTA 2,5 mM e ácido bórico 89 mM, pH 8,3) também adicionado de brometo de etídeo (0,5 µg/ml). O marcador de peso molecular utilizado foi o DNA Ladder (1 Kb). Os fragmentos foram visualizados sob luz UV e armazenados em equipamento de fotodocumentação gel-Doc 2000 (Bio-Rad).

Modelos de regressão linear foram aplicados aos padrões de amplificação exibidos pelos isolados. Valores de "1" (presença de banda) e "zero" (ausência) foram atribuídos a cada cry e considerados como variáveis independentes, enquanto as correspondentes porcentagens de mortalidade das larvas para cada isolado foram consideradas variáveis dependentes. O nível de associação entre esses dois parâmetros foi representado por uma análise de variância para o coeficiente de regressão. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o programa Fump (SAS Institute, Cory, NC, USA).

Com a finalidade de verificar possíveis associações entre a presença de um gene cry individual e altos níveis de toxicidade foram realizadas análises de regressão linear, e a significância dos coeficientes de regressão foi avaliada por análise de variância, empregando o programa SAS. Todos os isolados foram submetidos à análise para maior confiabilidade dos resultados.

Resultados e Discussão

Todos os DNAs amplificados com os iniciadores Gral-cry1 apresentaram um produto de amplificação com tamanho esperado em torno de 558 pb, o qual também foi obtido para a linhagem B. thuringiensis HD1, utilizada como controle positivo. Como controle negativo da amplificação, constatou-se a ausência de produto na linhagem B. thuringiensis var. tenebrionis, caracterizada como coleóptera-específica e portadora do gene cry3.

A alta freqüência dos genes cry1 pode ser explicada pelo mecanismo de seleção de linhagens, que é baseado na análise da presença do cristal protéico. Como isolados produzindo cristais bipiramidais (freqüentemente compostos de proteínas Cry1) são mais freqüentes e distinguíveis que os demais formatos, é possível que a alta proporção de genes cry1, presentes na maior parte das coleções de linhagens de B. thuringiensis, tenha sido causada pelo procedimento usado para a identificação dos isolados (Bravo et al. 1998). Apesar disso, não se descarta a possibilidade de que linhagens que contenham genes cry1 sejam mais abundantes que as demais linhagens, uma vez que as toxinas codificadas por esses genes são específicas para lepidópteros com grande variedade de representantes na natureza (Vilas-Bôas 2002).

Os níveis de eficiência inseticida contra a lagarta-do-cartucho foram obtidos por bioensaios envolvendo os 115 isolados. Na Tabela 2, 41 isolados (cerca de 35,0%) promoveram 100% de mortalidade nas larvas. Esses índices são considerados elevados quando comparados aos relatados por Loguercio et al. (2001), que obtiveram baixa porcentagem de isolados, cerca de 3,3%, considerando ainda o mínimo de 75% de mortalidade das larvas como índice para alta toxicidade. No entanto, outros 16 isolados (13,7%) apresentaram índice de mortalidade entre 75% e 90%, e as outras classes ocasionaram mortalidade de 60% a 75% (10 isolados ou 8,6%, sete isolados (6,0%) com 40% a 60%, nove isolados (7,7%) com 20% a 40% e 33 isolados (28,2%) com mortalidade de 0% a 20%).

Os isolados provenientes das regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste foram os que apresentaram os maiores índices de mortalidade. Doze isolados da Região Sul, oito do Sudeste e cinco do Centro-Oeste apresentaram 100% de mortalidade. Resultado semelhante foi obtido com a linhagem HD-1. No entanto, a elevada freqüência obtida pode ser justificada pelo fato de já se ter partido de uma coleção previamente caracterizada como lepidóptero-específica, o que certamente aumenta a probabilidade de se encontrar maior número de isolados com atividade inseticida.

Dentre os isolados selecionados, encontram-se alguns provenientes de silos de armazenagem de grãos. Segundo Meadows et al. (1992), tais silos são ambientes propícios para obtenção de novas linhagens de B. thuringiensis por apresentarem situação ecológica particular (temperatura, umidade relativa e luminosidade controladas) e alta diversidade biológica de insetos. Nesse ambiente, existe elevada estabilidade nas condições climatológicas e ausência de luz solar (irradiação UV), a qual danifica as proteínas Cry, podendo facilitar a reciclagem de B. thuringiensis, por propiciar tempo suficiente e condições adequadas para a proliferação e reciclagem bacterianas (Lambert et al. 1992). O estudo da distribuição de genes cry dentro de uma coleção de linhagens pode ajudar no entendimento do papel de B. thuringiensis no ambiente. Linhagens da bactéria foram estudadas e a correlação com algumas espécies tem sido discutida. Bernhard et al. (1997) encontraram correlação entre origem das amostras utilizadas no isolamento de B. thuringiensis e atividade bioinseticida. Os autores demonstraram que a presença de Heliothis virescens Fabricius pode atuar como fator de seleção positiva para linhagens de B. thuringiensis com atividade tóxica frente a esse inseto. Sugere-se no presente trabalho que o fato de os isolados que apresentaram maior efetividade tóxica contra S. frugiperda serem oriundos do Sul, Sudeste e Centro-Oeste, possa estar relacionado com os níveis elevados das populações de S. frugiperda nessas regiões. Nesse caso, o controle natural desse inseto por B. thuringiensis levaria a uma reciclagem do mesmo, onde o inseto morto seria o ambiente ideal para que esporos fossem reciclados originando células vegetativas de B. thuringiensis altamente efetivas no controle de S. frugiperda (Lambert et al. 1992).

Quanto à identificação de subclasses do gene cry1, os iniciadores utilizados revelaram padrões distintos de amplificação entre os isolados de B. thuringiensis (Fig. 1). Paralelamente a análise de amplificação para todos os genes cry1 permitiu verificar a distribuição dos mesmos em diferentes classes de toxicidade contra larvas de S. frugiperda, assim como as combinações específicas dos genes cry detectadas por PCR (Tabela 2).

Todos os genes foram distribuídos por todas as classes de mortalidade, exceto o cry1E na classe de 40-60%. O gene cry1Ab mostrou-se presente em 80 isolados, o cry1B em 69 isolados, o cry1Ac em todos os 115 isolados, o cryV e o cry1E em 93 e 27 isolados, respectivamente. Observa-se na Tabela 2, que tanto para a menor faixa de mortalidade (0-20%) quanto para a maior faixa (90-100%), na qual encontra-se a maior parte dos isolados, houve também maior número de isolados para cada um dos genes analisados. Contudo o gene cry1E foi encontrado em somente dois isolados na classe de toxicidade de 90% a 100% e 15 isolados na classe de 0-20% de mortalidade (Tabela 2).

Combinações de genes foram registradas em todas as classes de mortalidade, exceto a combinação dos cinco genes que não esteve presente na classe de 75-90% e 40-60%, apresentando-se em um número reduzido de isolados nas demais, também na classe de 90-100%. Entretanto, na classe de 0-20% de mortalidade, essa combinação ocorreu em 10 dos 33 isolados. As demais combinações apresentaram-se em cerca de 50% dos isolados para cada classe de toxicidade, exceto para as classes de 40-60% e de 75-90%. A combinação Ab + B + Ac esteve presente no maior número de isolados e a combinação AB + B + Ac + V + E, no menor número de isolados.

Na Tabela 3 têm-se os valores dos parâmetros estimados, os valores de R² e o valor de F, que permitem estimar a significância de cada gene e de suas associações. Os valores referentes ao efeito individual de cada gene na mortalidade de larvas foram significativos a 1% de probabilidade, para os genes cry1Ac e cry1E, sendo mais evidente a atuação do gene cry1E, por apresentar um efeito de 31,5% na mortalidade média das larvas e explicar 11,4% da variação fenotípica para o traço. Resultados não significativos foram apresentados pelo efeito dos genes cry1Ab, cry1B e cry1IA, sugerindo que a mortalidade das larvas independe dessas subclasses. De acordo com Cerón et al. (1995), os genes cryID e cryIC são os mais tóxicos para lagartas de S. frugiperda. Entretanto, Bohorova et al. (1997) obtiveram os genes cryID, cryIE e cryIF como mais eficientes no controle dessa praga. Praça et al. (2004), trabalhando com isolados de B. thuringiensis para controle de S. frugiperda, relataram que, provavelmente, a mortalidade das lagartas decorre da presença do gene cryIB. Valicente et al. (2000) analisaram, via PCR, aproximadamente 20 isolados de B. thuringiensis eficientes no controle de S. frugiperda e relataram que todos os isolados apresentaram os genes cryIAb, cryIB, cryID e cryIE, mas não foram encontrados os genes cryIC e cryIF. Rie et al. (1990) afirmaram que espécies de Spodoptera são tolerantes às proteínas CryIAa e CryIAb.

Resultados envolvendo o gene cry1Ac e o cry1E foram significativos, com a maior contribuição na mortalidade, dada pelo gene cry1Ac . Combinações envolvendo o gene cry1E com ausência de cry1Ac foram significativas mostrando o maior efeito deste gene na mortalidade. Loguercio et al. (2001) também relataram altos níveis de toxicidade de isolados brasileiros, portadores do gene cry1E, às lagartas de S. frugiperda. Segundo os autores, um método de seleção baseado somente na presença de produto amplificado cry1E parece ser suficientemente efetivo na detecção de cepas com alta atividade inseticida contra S. frugiperda. Nesse mesmo trabalho, os autores utilizaram iniciadores para os genes cry1C-, 1D-, 1E- e 1F- e verificaram que não houve influência clara sobre o potencial inseticida das cepas testadas.

A combinação dos genes cry1Ac + cry1IA + cry1E foi a que apresentou maior efeito na mortalidade de larvas, enquanto a combinação dos genes cry1Ab + cry1B apresentou o menor efeito. A caracterização dos isolados com perfis únicos de produto de PCR com iniciadores específicos constatou que o gene cry1Ac foi o mais abundante, e o menos freqüente foi o gene cry1E. Esses resultados corroboram os encontrados por Bravo et al. (1998), na análise de distribuição de genes cry1 numa coleção mexicana de isolados de B. thuringiensis.

A análise conjunta do padrão de distribuição de genes nas diferentes classes de mortalidade, e dos resultados a partir das análises de regressão, fornece significativa evidência do envolvimento dos genes cry1Ac e cry1E nos elevados níveis de toxicidade encontrados nos isolados de B. thuringiensis. Como mostrado na Tabela 3, o coeficiente de regressão e o coeficiente de determinação (R²) podem ser interpretados biologicamente como o efeito de cada cry na mortalidade média das larvas e a proporção da variação fenotípica explicada pelo gene, respectivamente. Na presente análise, dentre os estudados (cry1Ab, cry1B, cry1Ac, cry1IA e cry1E), o gene cry1Ab não influenciou a eficiência de mortalidade das larvas de S. frugiperda. Aranda et al. (1996), em estudos de interações de proteínas cristal com células epiteliais do intestino de S. frugiperda relataram que proteínas altamente tóxicas (Cry1C e Cry1D) promovem interação saturada e específica com as microvilosidades das células epiteliais da larva, e que, proteínas não tóxicas (semelhantes a Cry1Ab) interagem inespecificamente com as microvilosidades, sendo assim, somente as interações específicas correlacionam-se com a toxicidade. As proteínas Cry1Ac e Cry1B são semelhantes a Cry1Ab, ligam-se às microvilosidades apicais no intestino do inseto, no entanto não há estreita correlação entre ligação e toxicidade.

Nos resultados de regressão obtidos no presente trabalho, a proteína Cry1Ac parece apresentar efeito sobre a mortalidade das larvas, contradizendo resultados encontrado por Aranda et al. (1996). No entanto, coincidem com aqueles obtidos por Luo et al. (1999), nos quais Cry1Ac ligou-se irreversivelmente às células epiteliais de S. frugiperda. Esses resultados sugerem que alguns componentes de membrana são necessários para induzir a formação de poros (Schwab & Culver 1990, Schwartz et al. 1991).

Finalmente, para uma análise mais detalhada, novas amplificações deverão ser realizadas, utilizando-se iniciadores para os genes cry1D e cry1C que, segundo Cerón et al. (1995), são os mais tóxicos para larvas de S. frugiperda, e ainda para cry1F, também eficiente para o controle dessas lagartas (Bohorova et al. 1997).

Agradecimentos

Os autores agradecem aos responsáveis pelos Laboratórios de Genética de Bactérias e de Resistência de Plantas a Insetos, ambos da UNESP-Jaboticabal, SP, ao Núcleo de Biologia Aplicada da Embrapa Milho e Sorgo em Sete Lagoas, MG, pelo apoio técnico a ao programa PIBIC/CNPq pelo apoio financeiro.

Received 13/VII/05. Accepted 04/IV/07.

• Aranda, E., J. Sanchez, M. Peferoen, L. Güereca & A. Bravo. 1996. Interactions of Bacillus thuringiensis crystal proteins with the midgut epithelial cells of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). J. Invertebr. Pathol. 68: 203-212.
• Barreto, M.R., L.L. Loguercio, F.H. Valicente & E. Paiva. 1999. Insecticidal activity of culture supernatants from Bacillus thuringiensis Berliner strains against Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) larvae. An. Soc. Entomol. Brasil 28: 675-685.
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autor p/ correspondência

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  29 Nov 2007
• Data do Fascículo
  Out 2007

Histórico

• Recebido
  13 Jul 2005
• Aceito
  04 Abr 2007