Susceptibilidad del parasitoide Phymastichus coffea LaSalle (Hymenoptera: Eulophidae) a Beauveria bassiana en condiciones de laboratorio

Susceptibility of the Parasitoid Phymastichus coffea LaSalle (Hymenoptera: Eulophidae) to Beauveria bassiana under laboratory conditions

BIOLOGICAL CONTROL

Susceptibilidad del parasitoide Phymastichus coffea LaSalle (Hymenoptera: Eulophidae) a Beauveria bassiana en condiciones de laboratorio

Susceptibility of the Parasitoid Phymastichus coffea LaSalle (Hymenoptera: Eulophidae) to Beauveria bassiana under laboratory conditions

Alfredo Castillo^I; Jaime Gómez^I; Francisco Infante^I; Fernando E Vega^II

^IEl Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR), Depto. de Entomología Tropical, Carretera Antiguo Aeropuerto km 2.5, Tapachula, 30700 Chiapas, México; [e-mail]; [e-mail]; [e-mail]

^IISustainable Perennial Crops Lab., United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Bldg. 001A, Beltsville, MD 20705-2350, USA; [e-mail]

RESUMEN

La broca del café, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae), es la plaga mas importante del cultivo de café en el mundo. Beauveria bassiana es un hongo entomopatógeno generalista ampliamente utilizado por los productores de café para controlar a H. hampei. Phymastichus coffea LaSalle es un endoparasitoide africano de adultos de la broca, recién importado a varios países de Latinoamérica y del Caribe para el control de esta plaga. En el presente estudio se realizaron bioensayos de laboratorio con el objetivo de determinar si B. bassiana es detrimental para el parasitoide P. coffea. La susceptibilidad del parasitoide fue evaluada en términos de supervivencia de adultos, concentración letal media (CL₅₀), tiempo letal medio (TL₅₀), reproducción y mortalidad de su progenie. El principal efecto del hongo resultó en la disminución de la longevidad de los adultos y en la mortalidad del 100% de los inmaduros del parasitoide. La CL₅₀ para adultos de P. coffea fue de 0.11% equivalente a 9.53 x 10⁷ conidias/ml de B. bassiana y una TL₅₀ de 29.4h, equivalente a la reducción del 22% de su longevidad normal como adulto. P. coffea fue capaz de transmitir esporas de B. bassiana a brocas no infectadas con el hongo y originar indirectamente la muerte de su progenie. Este trabajo servirá de referencia cuando se contemple el empleo de ambos organismos a nivel de campo, especialmente dentro de un plan de manejo integral de la plaga.

Palabras clave: Café, Hypothenemus hampei, hongo entomopatógeno

ABSTRACT

The coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae), is the most important coffee pest worldwide. Beauveria bassiana is a generalist entomopathogenic fungus widely used by coffee farmers to control this pest and Phymastichus coffea LaSalle (Hymenoptera: Eulophidae) is an African endoparasitoid of H. hampei adults, recently imported to several Latin American and Caribbean countries to aid in the coffee berry borer control. The objective of this study was to determine if B. bassiana is detrimental to P. coffea. The susceptibility of the parasitoid was evaluated in terms of adult survivorship, mean lethal concentration (LC₅₀), mean lethal time (LT₅₀), reproduction and immature mortality. The main effect of the fungus resulted in reduction of adult longevity and mortality of 100% for immature stages of this parasitoid. The LC₅₀ for adults was 0.11% equivalent to 9.53 x 10⁷ conidia/ml of B. bassiana and a LT₅₀ of 29.4h, equivalent to reduction of 22% of its normal longevity as an adult. P. coffea was capable of disseminating spores of B. bassiana to non-infected H. hampei adults, which could indirectly cause the death of its own progeny. These results could be valuable when considering the use of both organisms in the field, especially in an integrated pest management program.

Key words: Coffee, Hypothenemus hampei, entomopathogenic fungus

El cultivo del café (Coffea arabica y C. canephora) tiene importancia económica, social, cultural y ambiental en todo el mundo. La broca del café destaca entre las limitantes más importantes de este cultivo y es considerada como el insecto plaga más dañino del café (LePelley 1968). Aunque se han descubierto más de veinte enemigos naturales de la broca en diferentes partes del mundo (Murphy & Moore 1990, Benassi 1995, Bustillo et al 2002), los parasitoides de origen africano han despertado mayor interés para ser usados en programas de control biológico clásico, pues se piensa que podrían tener mayor potencial para el control de la broca (Murphy & Moore 1990). Hasta ahora tres especies de parasitoides de origen africano se han importado a varios países de Latinoamérica y el Caribe: Prorops nasuta Waterston, Cephalonomia stephanoderis Betrem (Hymenoptera: Bethylidae) y P. coffea LaSalle (Hymenoptera: Eulophidae). Los primeros dos parasitoides atacan los estados inmaduros de la broca y el tercero a los adultos. En esta región se han liberado varios millones de cada una de estas especies (Damon 2000, Jaramillo et al 2005). La evaluación de estos parasitoides como agentes de control biológico de la broca esta en curso, especialmente para P. coffea que es la especie de mas reciente introducción.

B. bassiana es un entomopatógeno generalista y cosmopolita. Se han recolectado varias decenas de cepas en cafetales de diversos países (De la Rosa et al 1997a, b, Bustillo et al 2002, Rehner et al 2006). Se le considera como un agente de control biológico efectivo cuando se usa dentro de un plan de manejo integrado de la broca, y como tal, su uso ha sido ampliamente extendido (Barrera et al 1990, Bustillo & Posada 1996, De la Rosa et al 2000). La avispita P. coffea y el hongo B. bassiana coinciden espacial y temporalmente en los cafetales, ya que ambos organismos parasitan al estado adulto de la broca. Existe la necesidad de usar ambos organismos en campo debido a la severidad de los daños provocados por la broca (Infante 2002). Dado que B. bassiana es patogénico a una gran diversidad de insectos, incluyendo especies benéficas (Donegan & Lighthart 1989), su aplicación contra H. hampei representa un riesgo potencial para P. coffea. Para dilucidar sobre la magnitud de este problema, se realizaron bioensayos en el laboratorio con el objetivo de determinar si B. bassiana es detrimental para el parasitoide P. coffea, en términos de sobrevivencia de adultos, CL₅₀, TL₅₀, actividad reproductiva y mortalidad de su progenie. Se considera que este trabajo servirá de referencia para futuras evaluaciones relacionadas con el empleo de ambos organismos en el campo y su posible integración dentro de un plan de manejo de la plaga.

Material y Métodos

Insectos. Las brocas fueron obtenidas a partir de frutos recolectados en cafetales de la región del Soconusco, Chiapas. Se usaron hembras del parasitoide P. coffea recién emergidas de una cría establecida en los laboratorios de El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR), empleando la metodología descrita por Infante et al (1994). La temperatura del cuarto de cría fue de 26 ± 2ºC y humedad relativa de 70-80%. Las hembras del parasitoides usadas en los experimentos se alimentaron con miel de abeja.

Propagación y reproducción del hongo. Se usó la cepa Bb₂₅ de Beauveria bassiana de la colección de hongos del Laboratorio de Patología de Insectos de ECOSUR en Tapachula, Chiapas. Estudios previos señalan que esta cepa es una de las más virulentas para la broca del café (De la Rosa et al 1997a). Esta cepa fue originalmente aislada de adultos de H. hampei infectados de forma natural y conservada en cristales de sílica gel a 4ºC. Para los bioensayos, las conidias fueron producidas en el medio Agar Dextrosa Sabouraud (ADS). La germinación y esporulación del hongo se propició colocando el medio de cultivo a 27ºC ± 2ºC, humedad relativa de 80% ± 5 y 12:12h (luz: oscuridad). Las conidias fueron cosechadas quince días después y almacenadas a 4ºC hasta el momento de ser utilizadas en los experimentos.

Patogenicidad sobre estados inmaduros de P. coffea. El efecto de B. bassiana sobre los estados inmaduros de P. coffea, se observó aplicando el hongo a brocas recién parasitadas, usando un diseño completamente al azar con dos tratamientos (con hongo y sin hongo) y seis repeticiones. Cada repetición consistió de diez brocas adultas. La inoculación del hongo fue realizada en tubos de ensayo, aplicando 1 ml de una suspensión con 1x10⁸ conidias/ml sobre un grupo de diez brocas. Los insectos permanecieron en contacto con la suspensión del hongo durante treinta segundos y después fueron colocados sobre un papel filtro para eliminar el exceso de humedad. Las brocas inoculadas fueron colocadas individualmente en viales que contenían 2 ml de una dieta (Villacorta & Barrera 1996). Las brocas fueron disecadas 24 días después para determinar el porcentaje de infección. Los estados inmaduros de P. coffea fueron colocados dentro de una cámara húmeda para propiciar la eventual esporulación del hongo.

Patogenicidad sobre adultos de P. coffea. La patogenicidad de B. bassiana sobre adultos de P. coffea fue evaluada usando un diseño similar al experimento anterior, usando diez repeticiones por cada tratamiento. Se aplicaron 0.5 ml de una suspensión con 1x10⁸ conidias/ml del hongo más un adherente (Triton X-100 al 0.1 %) sobre diez hembras del parasitoide. Las avispas fueron sumergidas por 30 segundos en la suspensión, el exceso de humedad eliminado con papel filtro y confinadas dentro de un tubo de vidrio. Los insectos del control fueron inoculados con agua destilada estéril más el adherente. Los parasitoides fueron alimentados diariamente con miel de abeja, registrando su mortalidad. Los cadáveres fueron separados y colocados en cámaras húmedas.

Tiempo letal medio (TL₅₀) para adultos de P. coffea. El tiempo necesario para que ocurra la muerte del 50% de las hembras adultas de P. coffea debido a B. bassiana, fue determinado aplicando directamente las conidias del hongo. Los bioensayos se llevaron a cabo con 25 grupos de insectos conformados por díez individuos cada uno. Cada grupo fue sumergido en 0.3 ml de una solución fungosa al 1% durante 30 segundos. Una vez eliminado el exceso de humedad, los insectos tratados se colocaron dentro de viales de vidrio y diariamente alimentados con miel de abeja. La mortalidad de las avispas se registró cada 6h a partir de la inoculación. Los parasitoides muertos fueron colocados dentro de cámaras húmedas para estimular el crecimiento del hongo.

Concentración letal media (CL₅₀) para adultos de P. coffea. La concentración necesaria para que ocurra la muerte del 50% de hembras de P. coffea tratadas con B. bassiana, fue determinada aplicando diferentes dosis del hongo. Se usaron concentraciones de 1.0, 0.5, 0.3, 0.1, 0.05, 0.03 y 0.01%, agregándose 0.025% de Tritón X-100 como adherente. Las conidias fueron contadas en una cámara de Neubauer, estimándose una concentración entre 1x10⁶ y 1x10⁸ conidias/ ml. Las hembras de P. coffea fueron sumergidas en 0.3 ml de cada concentración en grupos de diez individuos. Se realizaron cinco repeticiones, haciendo un total de 50 hembras para cada concentración. Los insectos del control fueron sumergidos en agua destilada estéril más el adherente. Los individuos muertos fueron colocados en cámaras húmedas.

Efecto de B. bassiana en la reproducción de P. coffea. Se realizaron aplicaciones de B. bassiana al 1% sobre cultivos de P. coffea recién elaborados. El método de cría de P. coffea estuvo basado en la descripción hecha por Infante et al (1994). La inoculación con el hongo se realizó inmediatamente después de elaborar los cultivos del parasitoide, que consistieron en cien brocas adultas y diez hembras de P. coffea. El hongo fue aplicado directamente sobre los insectos de acuerdo con los siguientes tres tratamientos: a) parasitoides inoculados y brocas no inoculadas, b) brocas inoculadas y parasitoides no inoculados, c) parasitoides y brocas no inoculadas (control). La inoculación de los insectos fue realizada de acuerdo al protocolo antes descrito, empleando un 1 ml de la suspensión. Se realizaron diez repeticiones para cada tratamiento. Los cultivos de P. coffea fueron mantenidos a 27ºC ± 2, humedad relativa de 80% ± 5 y 12:12h (luz:obscuridad). La emergencia de parasitoides se registró diariamente a partir de los 25 días. De cada repetición se tomó una muestra de treinta brocas adultas para determinar el nivel de parasitismo, la incidencia del hongo y la mortalidad de inmaduros de P. coffea. Los individuos muertos fueron colocados en una cámara húmeda.

Análisis estadístico. La patogenicidad en los adultos de P. coffea fue analizada mediante una prueba de datos pareados con distribución normal. Los datos para calcular la CL₅₀ y TL₅₀ fueron analizados empleando un análisis Probit, después de corregir la mortalidad en el testigo con la fórmula de Abbott (1925). Debido a que los datos del resto de los experimentos no cumplían con los supuestos de normalidad y homocedasticidad, fueron transformados usando la fórmula antes de aplicar un análisis de varianza y la prueba de Tukey, empleando el programa estadístico Minitab 15 (Minitab Inc. 2007).

Resultados

Patogenicidad sobre estados inmaduros de P. coffea. Se pudo determinar un claro efecto del hongo en la mortalidad de los estados inmaduros de P. coffea. Las disecciones de las brocas parasitadas e inoculadas con B. bassiana, revelaron una mortalidad del 100% de los estados inmaduros del parasitoide. Mientras que en el control (sin hongo) no hubo mortalidad.

Patogenicidad sobre adultos de P. coffea. La inoculación con B. bassiana incrementó significativamente la mortalidad en las hembras adultas de P. coffea con respecto al control (Z = 3.48; gl = 1; P < 0.01). El efecto patogénico del hongo en el segundo día después de la inoculación produjo 85% de mortalidad, contrastando con un 62% en el control. La longevidad máxima de las hembras fue de tres días, registrándose un 100% de mortalidad al cuarto día, en ambos grupos. Todos los individuos muertos en el tratamiento presentaron crecimiento del micelio de B. bassiana sobre sus cuerpos, pero no en el control.

Tiempo letal medio (TL₅₀) para adultos de P. coffea. El análisis de los resultados mostró una TL₅₀ de 29.4h (límites fiduciales: 28.5-30.3) para las hembras de P. coffea inoculadas con el hongo, mientras que en el grupo control (sin hongo), fue de 37.3h (límites fiduciales: 36.4-38.1). Considerando que los límites fiduciales del tratamiento y el control no se traslapan entre sí, los resultados sugieren que B. bassiana reduce significativamente (P < 0.05) la sobrevivencia de las hembras de P. coffea. El 50% de la mortalidad fue alcanzada en ambos grupos con un tiempo diferencial de aproximadamente ocho horas (Fig 1).

Concentración letal media (CL₅₀) para adultos de P. coffea. El porcentaje de avispas esporuladas con B. bassiana, mostró una relación directamente proporcional con la dosis inoculada (Fig 2). La virulencia de B. bassiana generó una mortalidad corregida correspondiente a un valor CL₅₀ de 0.11% (limites fiduciales: 0.067-0.167), equivalente a 9.53 x 10⁷ conidias/ml de B. bassiana; dosis requerida para matar al 50% de una población de hembras de P. coffea. No se observó esporulación del hongo en ninguno de los insectos que murieron en el grupo control (no tratados).

Efecto de B. bassiana en la reproducción de P. coffea. Las inoculaciones de B. bassiana tanto en parasitoides como en brocas adultas, afectaron notablemente la sobrevivencia y reproducción de P. coffea (Tabla 1). La incidencia del hongo sobre los hospederos (infección) no mostró diferencias entre tratamientos (parasitoides inoculados versus brocas inoculadas), pero si con respecto al control (F = 57.25; gl = 2; P < 0.01). El hongo fue capaz de esporular tanto en los parasitoides muertos como en las brocas, indicando un claro efecto patogénico hacia ambos organismos. No se observaron diferencias significativas (F = 2.84; gl = 2; P = 0.134) con respecto al porcentaje de parasitismo registrado. En cuanto a la reproducción de P. coffea, hubo una mayor producción de progenie del parasitoide en el control con respecto a los tratamientos donde fue aplicado el hongo (F = 30.24; gl = 2; P < 0.01). La población de P. coffea se multiplicó 3.8 veces en el control, mientras que en los tratamientos creció 1.1 y 0.4 veces, cuando la inoculación de B. bassiana fue sobre la broca y el parasitoide, respectivamente. Se observó la presencia de conidias de B. bassiana sobre el abdomen de las hembras de P. coffea (Fig 3) que fueron recuperadas de cultivos que recibieron inoculación del hongo. Este hecho hace suponer que la transmisión de B. bassiana de un fruto de café a otro, puede ser favorecida por este parasitoide.

Discusión

El presente estudio demuestra que Beauveria bassiana provoca alta mortalidad sobre los estados juveniles de P. coffea, cuando el hongo es aplicado a sus hospederos parasitados. En este tipo de interacciones, la capacidad de penetración del hongo a través de la cutícula del insecto está directamente relacionada con la producción de enzimas y toxinas de la cepa utilizada (Roberts 1989). Adicionalmente, la presencia de B. bassiana genera una disminución aproximada de 22% de la vida adulta de las hembras de P. coffea. Considerando que su longevidad como adultos es de apenas tres días (Feldhege 1992, Infante 1994), esta reducción resulta muy significativa. En otros sistemas ha sido reportado que la afectación de los parasitoides por entomopatógenos también puede darse reduciendo la disponibilidad de los recursos alimenticios o hacerlos inapropiados para el desarrollo de la progenie (Rosenheim et al 1995).

Estudios previos han demostrado que B. bassiana genera también altas mortalidades en otros parasitoides de la broca como son: C. stephanoderis y P. nasuta (Bustillo et al 1998, De la Rosa et al 1997b, 2000). Este hecho ha generado preocupación pues estas especies junto con P. coffea han sido reconocidas como las únicas que poseen potencial para ser utilizas en programas de control biológico clásico contra la broca del café en América Latina (Murphy & Moore 1990). A la luz de las evidencias aquí presentadas sobre la susceptibilidad de P. coffea a este hongo, se puede concluir que el control biológico de H. hampei mediante parasitoides no es compatible con uso de B. bassiana. Este hecho había sido previamente discutido por otros autores como una hipótesis, planteándose al mismo tiempo algunas propuestas para evitar que los parasitoides fueran dañados por el hongo al ser liberados en un cafetal (Infante 2002).

Las aplicaciones de B. bassiana pueden afectar el 3% de los artrópodos que no son objeto del control (Bruce et al 1997) e interactúan antagónicamente con los enemigos naturales de varias plagas (Feng et al 1994, Danfa & Van der Valk 1999). El agroecosistema cafetalero alberga una gran biodiversidad de parasitoides y depredadores (Ibarra-Nuñez 1990) y no se conoce el efecto que las aspersiones de B. bassiana pudieran tener sobre esas comunidades. Considerando que este entomopatógeno ha sido ampliamente utilizado contra la broca del café en Latinoamérica (Barrera 2005), resulta indispensable conocer en que grado esos enemigos naturales están siendo afectados por el hongo. En este sentido, el presente trabajo se considera como una contribución útil para inferir lo que podría estar ocurriendo con este hongo en el campo.

Nuestros resultados sugieren que una hembra de P. coffea puede transmitir la infección de B. bassiana a su hospedero al transportar las conidias en su cuerpo. En un cafetal, la diseminación de la enfermedad por una hembra de P. coffea debe ser un evento circunstancial, pues de lo contrario sus poblaciones se extinguirían debido a la susceptibilidad del parasitoide. En otras especies de insectos, la capacidad para transmitir y dispersar conidias de B. bassiana ha sido aprovechada para crear estrategias de control de plagas (Toledo et al 2007), pero los estudios que han evaluado la transmisión de hongos entomopatógenos por parasitoides son escasos (Roy & Pell 2000). Consecuentemente, se requiere de estudios específicos para valorar el papel de P. coffea como transmisor de B. bassiana en condiciones de campo, ya que su aportación al control de la broca sería mínima, considerando que menos del 4% de las broca atacadas por P. coffea logran sobrevivir (Castillo et al 2004).

Es probable que el impacto exhibido por B. bassiana sobre P. coffea, así como su aparente transmisión por el parasitoide, hayan sido influenciadas por las condiciones de confinamiento utilizadas en el presente trabajo, al favorecer el desarrollo del hongo. Aun así, la actividad parasítica de P. coffea no parece no ser afectada, ya que su progenie no se extinguió con la presencia del hongo. De cualquier manera, es conveniente realizar experimentos para validar estos resultados en el campo. Las evaluaciones en laboratorio no siempre reflejan los niveles de infección que ocurren en condiciones naturales (Goettel et al 1990), debido a que la actividad de los enemigos naturales es afectada por la complejidad del medio (James et al 1995, Fuentes-Contreras et al 1998). Sin duda, los hallazgos reportados en el presente estudio serán importantes para futuros trabajos relacionados con la broca del café en América Latina.

Agradecimientos

A Guadalupe Nieto por su ayuda en el procesamiento y análisis de imágenes tomadas al microscopio electrónico de barrido.

Received 1/IV/08.

Accepted 31/I/09.

Edited by Fernando L Cônsoli - ESALQ/USP

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Fechas de Publicación

• Publicación en esta colección
  17 Nov 2009
• Fecha del número
  Oct 2009

Histórico

• Recibido
  01 Abr 2008
• Acepto
  31 Ene 2009