Estrutura genética populacional de Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) utilizando marcadores microssatélites

Population genetic structure of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) utilizing microsatellite markers

Genetic variability; molecular markers; whitefly

SYSTEMATICS, MORPHOLOGY AND PHYSIOLOGY

Estrutura genética populacional de Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) utilizando marcadores microssatélites

Population genetic structure of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) utilizing microsatellite markers

GE do Valle^I; MI Zucchi^II; NS Stabellini^I; AL Lourenção^I; JB Pinheiro^III

^IInstituto Agronômico de Campinas IAC, Campinas, SP, Brasil

^IIAPTA/Centro Pólo Sul, Piracicaba, SP, Brasil

^IIIESALQ/USP, Depto de Genética, Piracicaba, SP, Brasil

^{Correspondence}

ABSTRACT

We aimed to characterize the population genetic structure within and among five Bemisia tabaci (Gennadius) populations collected from different host plants and geographic regions by using microssatelites as a molecular marker. Each population was represented by 19 specimens. The host plants and geographic origins of these populations were described as follows: Pop 1: Squash Barreiras (BA); Pop 2: Cotton Barreiras (BA); Pop 3: Soybean Campinas (SP); Pop 4: Tomato Cruz das Almas (BA); and Pop 5: Soybean Rondonópolis (MT). Six polymorphic loci were observed, which discriminated 31 different alleles in the studied populations, with a mean number of alleles per population of 3.30 (2.67 - 4.00). Using Fisher's Exact test, it was observed that at least three populations were in Hardy-Weinberg equilibrium for most of the studied loci (six). The dendrogram (UPGMA) separated populations into groups mainly related to the geographic origin of the samples. Only population 5 differed from the others at a 0.15 distance (74.5% group consistency). The most similar populations were 1 and 2, with a 0.01 distance (65.3%). This is in agreement with their geographic origins and it was not consistent with host specificity. The results suggest considerable gene flow (7.3%) among all whitefly populations and indicate that a better understanding of the gene flow in populations of B. tabaci associated with different hosts is required for the management of this insect.

Keywords: Genetic variability, molecular markers, whitefly

Introduction

Moscas-brancas são insetos que sugam a seiva do floema das plantas hospedeiras, tanto na fase imatura como na adulta, causando danos diretos e indiretos (Norman et al 1996, Berlinger 1986). Atualmente, elas são consideradas um grupo importantíssimo em âmbito mundial, veiculando mais de 110 fitovírus diferentes e sendo as únicas transmissoras de geminivírus (Jones 2003). Uma das espécies mais importantes é Bemisia tabaci (Gennadius), considerada um complexo (Brown et al 1995b, Perring 2001), com amplo espectro de hospedeiras, a qual se desenvolve em mais de 900 espécies de plantas (Perring 2001, Berry et al 2004).

A existência de raças ou biótipos de B. tabaci foi proposta por volta de 1950 para descrever populações distintas do inseto baseadas na adaptação à planta hospedeira e na capacidade em transmitir fitovírus (Mound 1963). Em meados de 1980, surgiu o biótipo B, considerado altamente polífago e quase cerca de duas vezes mais fecundo em relação às outras populações de B. tabaci anteriormente descritas (Brown et al 1995b).

O biótipo B vem sendo considerado uma séria praga na agricultura e chegou a ser descrito como nova espécie, baseado em RAPD-PCR, comportamento de acasalamento e avaliações morfológicas (Bellows Jr et al 1994). A primeira observação desse biótipo na América foi registrada na década de 80, nos EUA, provavelmente em plantas ornamentais importadas (Brown et al 1995b), atingindo culturas de interesse econômico, como feijoeiro, abobrinha, meloeiro, tomateiro e algodoeiro. No Brasil, o biótipo B foi introduzido no início da década de 90 (Lourenção & Nagai 1994), tendo se disseminado rapidamente para outras fronteiras agrícolas do país (França et al 1996, Villas Bôas et al 1997).

A existência de biótipos distintos não é apenas uma questão taxonômica, podendo a introdução de um novo biótipo influenciar diretamente a dinâmica das interações praga- vetor-hospedeiro (Maruthi et al 2001). Atualmente, já foram caracterizados mais de 20 biótipos distintos, denominados em série de letras A a T (Bedford et al 1994, Brown et al 1995a, Banks et al 1999, Perring 2001).

Os marcadores moleculares são usados para o estudo da estrutura genética de populações de B. tabaci de diferentes biótipos, assim como a flutuação de genes entre populações derivadas de um mesmo biótipo (Simón et al 2007). Neste estudo, o uso de marcadores microssatélites foi escolhido devido às características intrínsecas como marcador estável, codominante, multialélico, altamente confiável, pela simplicidade operacional e pela rapidez de análise quando comparado a outros métodos (Simón et al 2007). O objetivo deste trabalho foi caracterizar a estrutura genética populacional da mosca-branca B. tabaci em regiões e/ou hospedeiros específicos usando marcadores microssatélites.

Material e Métodos

Coleta e manutenção das populações de B. tabaci

Adultos das populações de B. tabaci foram coletados em campo em diferentes plantas e regiões brasileiras (Tabela 1) e mantidos em frascos com etanol 70% a -4ºC para posterior análise molecular. Os insetos foram coletados durante o 1º semestre de 2008.

Extração de DNA

O procedimento para extração de DNA foi o mesmo utilizado por Queiroz da Silva (2006). O DNA foi extraído a partir de fêmeas de mosca-branca individuais, as quais foram maceradas em microtubo de 1,5 ml em 60 µl de tampão de extração (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM, Triton X-100 0,3 %, proteinase K a 60 µg.ml^-1). Os macerados foram incubados por 15 min a 65ºC e 95ºC por 10 min. Posteriormente, as amostras foram armazenadas a -20ºC. Após eletroforese, a quantificação das amostras foi estimada pela intensidade de fluorescência emitida pelo brometo de etídeo sob UV em géis de agarose a 1,4% (p/v). Essa intensidade foi comparada àquela de padrões (DNA do fago λ).

Caracterização molecular de B. tabaci utilizando marcadores microssatélites

A avaliação de polimorfismo foi feita com 19 indivíduos de cada população (Tabela 1), usando-se 27 locos microssatélites polimórficos previamente definidos para B. tabaci (Tsagkarakou & Roditakis 2003, De Barro et al 2003, Tsagkarakou et al 2007). Os locos selecionados foram utilizados para a genotipagem dos indivíduos das populações de B. tabaci visando o estudo da estrutura genética populacional.

A reação de PCR foi realizada para todos os locos microssatélites avaliados em volume final de 20 μl, contendo 3 μl de DNA (cerca de 20 ηg), 2 μl do iniciador "forward + reverse" (0,2 μM), 0,25 μl de desoxirribonucleosídeo trifosfato (dNTP) (0,15 mM), 2 μl de solução tampão 1 X (50 mM de KCl; 100 mM de Tris-HCl, pH 8,5), 1,60 μl de MgCl₂ (4,0 mM), 0,5 U de Taq DNA polimerase e 10,65 μl de água Milliq autoclavada.

As amplificações foram feitas em termociclador (Biorad My Cicler) contendo uma etapa inicial de desnaturação de 2 min a 95ºC, seguido por 45 ciclos com 1 min a 95ºC, 1 min a 48ºC e 1 min a 72ºC, finalizando com 5 min a 72ºC para extensão final, para o iniciador BEM 11. As temperaturas de anelamento utilizadas para os demais iniciadores estão descritas na Tabela 2.

Genotipagem dos iniciadores SSRs

A genotipagem dos iniciadores SSR foi feita em gel de acrilamida 7% corado com nitrato de prata. As corridas foram efetuadas em cuba vertical (Biorad Sequence Gene), por período variável de 2 h a 3,5h, dependendo do iniciador avaliado, a 70 W de potência.

Análise estatística

A partir da leitura dos dados nos géis de acrilamida foram obtidas as frequências gênicas (alélicas) e genotípicas em cada loco. Essas frequências foram submetidas a um teste de aderência (teste exato de Fisher), às proporções de equilíbrio de Hardy-Weinberg, conforme definido por Weir (1996), utilizando o programa TFPGA (Miller 1997). O teste exato de Fisher foi feito por meio do método convencional de Monte Carlo utilizando dez batches com 1000 permutações por batch.

A diversidade genética e as estatísticas F foram estimadas sob modelo aleatório de acordo com Weir (1996), em que as populações amostradas são consideradas como representativas da espécie e com uma história evolutiva comum. As freqüências alélicas, o número de alelos por loco (A), a heterozigosidade observada (H_o) e esperada (H_e) e as estatísticas F de Wright (F_IS,F_ST e F_IT), foram estimadas utilizando o programa GDA (Lewis & Zaykin 2000) .

Em locos de microssatélites, o processo mutacional não está de acordo com o que se admite no modelo de alelos infinitos com baixas taxas de mutação. Por essa razão, foi utilizada, além da estatística de F_ST, uma análoga a ela, denominada de R_ST (Slatkin 1995), desenvolvida especificamente para dados de microssatélites. Parâmetros como o R_ST e o fluxo gênico (N_m) foram estimados com o auxílio do programa R_ST Calc (Goodman 1997). A estruturação da variabilidade foi visualizada em dendrogramas construídos pela matriz de distâncias genéticas de Nei e pelo critério de agrupamento UPGMA, utilizando-se o programa NTSYS (Rohlf 1989). A estabilidade dos agrupamentos também foi testada pelo cálculo da correlação cofenética empregando-se o procedimento de reamostragem por 10000 bootstrap, utilizando o programa TFPGA (Miller 1997).

Para análise da estruturação da diversidade sem hierarquização a priori, foi empregada a abordagem bayesiana realizada no programa STRUCTURE. Foram testados os valores de K variando de 1 a 5 e o número real de K escolhido a partir do método de predição baseado nos valores de K (Evanno et al 2005).

Resultados e Discussão

Foram genotipadas cinco populações (nomeadas 1, 2, 5, 3 e 7 - Tabela 1) de B. tabaci utilizando seis iniciadores polimórficos, a saber: BT b 69, BEM 12 ii, BEM 25, BEM 37, BT b 103 e BT e 49. Estes locos discriminaram 31 diferentes alelos nas populações estudadas.

Variação genética

O número médio de alelos por população foi de 3,30, variando de 2,67 alelos (população 5) até o máximo de 4,00 alelos (população 1) (Tabela 3). A população 5 apresentou a maior heterozigosidade observada (0,613) e a população 2 a menor (0,499). A maior heterozigosidade esperada foi verificada na população 1 (0,550) e a menor (0,394) na 5.

Para BT b 69, todas as populações mostraram significância no teste exato de Fisher; portanto, para esse loco estudado, há equilíbrio de Hardy-Weinberg (Tabela 4). Para os locos Bem 12, Bem 25 e BT b 103, nenhuma das populações mostraram significância no teste exato de Fisher, não estando, portanto, em equilíbrio de Hardy-Weinberg. É importante ressaltar que os desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg, nesse caso, podem estar relacionados com o tamanho amostral (N).

A frequência de alelos exclusivos em determinadas populações foram três na população 1, dois na população 2, e um alelo nas populações 3, 5 e 7 (Tabela 5). Essa pequena quantidade de alelos privados ou exclusivos significa que existe fluxo gênico entre essas populações. Em média, ocorreram 3,174 migrantes por geração (Tabela 6), sendo que as populações mais próximas provavelmente apresentam fluxo gênico mais intenso em relação às populações mais distantes.

Os resultados da análise de agrupamento Baysiana executada no programa Structure indicaram o valor ótimo de K = 3 (Fig 1). O valor 3 foi o menor desvio padrão e log (ln K) mais próximo de zero, indicando que 3 é o valor mais provável para o grupo. Os agrupamentos podem ser observados na Fig 2.

Os dados foram posteriormente submetidos ao teste de atribuição considerando K = 3 (Fig 1). Do total de 95 indivíduos de mosca-branca analisados nas populações 1, 2, 3, 5 e 7, cerca de 30% foram dispostos em três grupos (azul, verde e vermelho), com Q > 0,2 para o grupo azul, Q entre 0,4 e 0,8 para o grupo verde e Q > 0,8 para o grupo vermelho. A população oriunda de Cruz das Almas BA (população 5) foi a única que apresentou padrão diferente das demais, com Q > 0,3 (grupo vermelho) (Fig 3).

Estrutura genética

O índice de fixação da espécie F_IS, estimado com seis locos de SSR, foi menor que zero, sendo este uma medida da endogamia. A endogamia intrapopulacional das populações analisadas pode ser considerada nula, visto que o IC a 95% das estimativas não foi significativo, isto é, inclui o zero. Provavelmente existe grande troca gênica nessas populações e as mesmas estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg.

A variação interpopulacional foi considerada baixa. O valor de R_ST estimado foi de 0,041 e o de F_ST igual a 0,073. De outro modo, pode-se dizer que existem 4,1 % de variação entre as populações estimada pelo valor do R_ST e 7,3% de variação calculada pelo valor do F_ST. Essas estimativas foram relativamente congruentes e significativamente diferentes de zero, como pode se observar na Tabela 6. O parâmetro N_m, estimado com base na estimativa de F_ST, resultou no valor de 3,174 indivíduos, indicando uma taxa de migrantes entre as populações de grandeza intermediária. Esse valor pode ser um indício de que as populações ainda possuem uma estrutura metapopulacional, ou seja, existe fluxo gênico entre elas.

As distâncias genéticas de Nei calculadas entre as populações variaram de -0,006 a 0,173 (Tabela 7). A estruturação da variabilidade genética dessas populações pode ser visualizada no dendrograma apresentado na Fig 3. O dendrograma obtido a partir das medidas de similaridade pode ser verificado pelo agrupamento pelo método UPGMA (Fig 3). A correlação cofenética dentre as distâncias genéticas de Nei e as obtidas no dendrograma foi alta e igual a 0,97, mostrando que os dados de distâncias são bem explicados pelo dendrograma apresentado. Forma-se um grupo com apenas a população 5 diferenciando-se das demais a 0,15 de distância (74,5 %). As populações mais similares são 1 e 2, com 0,01 de distância (65,3 %). Isso corrobora a hipótese de agrupamento em função da localização geográfica, visto que as populações 1 e 2 são provenientes de Barreiras - BA; contudo, não foi coerente com a especificidade ao hospedeiro.

As oito populações de B. tabaci avaliadas para os iniciadores BEM 11, BT b 159, BEM 22, BEM 23, BEM 6, BT d 26, BT 83, BEM 31, BT t 19, BEM 40, BT b 55, BEM 20, BT b 53, BT - 4, BT b34, BEM 14, BEM 15, BEM 18, BEM 39, BEM 21, BT b 155 não apresentaram variação genética. Esses dados diferem daqueles observados por De Barro et al (2003), Tsagkarakou & Roditakis (2003) e Tsagkarakou et al (2007). Porém, esses autores verificaram polimorfismo analisando diferentes biótipos e numa extensão geográfica em maior escala que a estudada neste estudo. No caso das cinco populações (nomeadas 1, 2, 3, 5 e 7 - Tabela 1) de B. tabaci avaliadas com os iniciadores BT b 69, BEM 12 ii, BEM 25, BEM 37, BT b 103 e BT e 49, houve variação genética, conforme relatado por outros (Tsagkarakou & Roditakis 2003, De Barro et al 2003, Tsagkarakou et al 2007).

Quanto à variação genética, o polimorfismo foi relativamente baixo; porém, foram encontrados 31 alelos nos seis locos polimórficos. O número médio de alelos por loco foi de 3,30 e a heterozigozidade média esperada média foi de 0,482, sendo maior que a encontrada por Delatte et al (2006) em estudo similar.

O valor médio encontrado de F_IS pode ser considerado nulo nas populações de B. tabaci, sugerindo que a espécie aproxima-se da panmixia, e indica que as frequências alélicas dessas populações podem se encontrar nas proporções de equilíbrio de Hardy-Weinberg, para a geração. Esse resultado é semelhante ao observado por Delatte et al (2006), onde a estimativa foi de 0,18, indicando um pouco de endogamia intrapopulacional. Porém, vale ressaltar que foram utilizados diferentes locos microssatélites.

Govindaraju (1989) distinguiu três níveis de fluxo gênico: alto (N_m > 1), intermediário (0,25 < N_m < 0,99) e baixo (N_m < 0,25). De acordo com esses níveis, o fluxo gênico encontrado neste estudo foi alto (3,17). Sendo a estimativa de fluxo gênico calculada através do parâmetro F_ST, o fluxo estimado neste trabalho não deve ser considerado contemporâneo, mas baseado na história genética destas populações. Dessa forma, deve-se atentar para esse fato em outros estudos que utilizam essa estimativa.

Quanto à medida da diversidade entre populações, as estimativas de R_ST e F_ST foram muito semelhantes. A diferença entre as estimativas deve-se ao processo de evolução dessas populações. Ou seja, o quanto elas estão divergindo no tempo, isto devido ao modelo evolutivo das mesmas. Esses valores foram idênticos aos encontrados por Delatte et al (2006) com outros microssatélites, onde a estimativa de F_ST foi também de 0,07, indicando que existe 7% de variação interpopulacional, sugerindo serem os microssátelites muito sensíveis para mensurar a diferenciação entre populações.

O fluxo gênico foi considerado intermediário e o número de alelos privados foi 8, indicando que algumas populações trocam menos alelos que outras, como é o caso da população 1, que possui fluxo gênico mais restrito.

Os valores encontrados na correlação entre as matrizes de distâncias geográficas e genéticas estão apresentados no dendrograma, sugerindo um padrão da variabilidade genética existente entre as populações, sendo que as populações 1 e 2 estão muito próximas genética e geograficamente, apesar de possuírem hospedeiros diferentes. É provável que a estrutura apresente pouco fluxo gênico a pequenas distâncias (isolamento pela distância) e que decresça com o aumento da distância.

As populações parecem mais específicas às regiões do que aos hospedeiros e não são muito diferentes, acreditando-se que todas pertençam ao mesmo biótipo de mosca-branca.

Com base nas comparações das populações examinadas por meio de SSRs, supõe-se que apenas o biótipo B esteja presente nessas regiões do país onde foram feitas as coletas, uma vez que adultos de B. tabaci da população 3 (soja Campinas) já foram caracterizados como pertencentes ao biótipo B (Fontes et al 2010).

De acordo com os resultados obtidos, infere-se que os marcadores moleculares são adequados para a caracterização de populações e, portanto, podem fornecer marcadores específicos para o complexo B. tabaci.

Agradecimentos

À Fundação de Apoio a Pesquisa no Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de pós-doutoramento concedida à primeira autora e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa de produtividade em pesquisa concedida ao quarto autor.

Received 11 June 2009 and accepted 11 October 2010

Edited by Denise Navia EMBRAPA

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Maio 2011
• Data do Fascículo
  Abr 2011

Histórico

• Aceito
  11 Out 2010
• Recebido
  11 Jun 2009