Epidemiologia, fisiopatogenia e diagnóstico laboratorial da infecção pelo HTLV-I

Epidemiology, physiopathogenesis and laboratorial diagnosis of the HTLV-I infection

ARTIGO DE REVISÃO REVIEW ARTICLE

Epidemiologia, fisiopatogenia e diagnóstico laboratorial da infecção pelo HTLV-I

Epidemiology, physiopathogenesis and laboratorial diagnosis of the HTLV-I infection

Fred Luciano Neves Santos^I; Fernanda Washington de Mendonça Lima^I,II

^IFarmacêutico-bioquímico

^IIMestre e doutora em Imunologia; professora-adjunta do Departamento de Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia da Universidade Federal da Bahia (UFBA)

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

O HTLV-I foi descoberto no início dos anos 1980 e associado a leucemia/linfoma de células T (LLTA) e paraparesia espástica tropical (PET). O HTLV pertence à família Retroviridae e tem um genoma de RNA de fita simples com uma estrutura genética similar à dos demais retrovírus, possuindo os genes gag, pol, env e pX. Este último contém os genes reguladores tax e rex. Tax e Rex são as principais proteínas reguladoras do genoma viral, sendo que Tax regula a transcrição do genoma proviral indiretamente ao interagir com diferentes proteínas regulatórias celulares, principalmente genes de citocinas e protoncogenes, e Rex atua como um regulador pós-transcricional do genoma do HTLV-I ao controlar o processamento (splicing) do RNAm viral. Essa infecção é endêmica em diversas regiões do mundo, tais como Japão, vários países da África, Caribe e América do Sul. No Brasil, Salvador é a cidade de maior prevalência, atingindo 1,7% da população geral. A maioria dos indivíduos infectados pelo HTLV-I permanece assintomática no decorrer de suas vidas, correspondendo a aproximadamente 95%. Dos indivíduos sintomáticos, alguns desenvolvem PET e outros, LLTA, sem que suas fisiopatogenias estejam perfeitamente esclarecidas. O diagnóstico rotineiro da infecção causada pelo HTLV-I baseia-se na detecção sorológica de anticorpos específicos para antígenos das diferentes porções do vírus ou através da pesquisa de seqüências genômicas provirais em células mononucleares periféricas. Ainda não existe nenhum estudo epidemiológico com bases populacionais e com metodologias adequadas sobre a infecção pelo HTLV-I que permita conhecer sua real prevalência no Brasil.

Unitermos: HTLV-I, Fisiopatogênese, Epidemiologia, Diagnóstico

ABSTRACT

Human T-cell lymphotropic virus type I (HTLV-I) has been identified as the causative agent of both adult T-cell leukemia (ATL) and HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). Similar to other retroviruses, HTLV-I has a positive strand RNA diploid genome consisting of four genes: gag, pol, env and pX. The pX region codes for the two regulatory proteins tax and rex. Tax protein is essential for efficient virus expression and plays an important role for activation of cellular genes, such as cytokine genes and protooncogenes. Rex protein induces the expression of unspliced and single spliced mRNAs and regulates a fine balance between the levels of expression of the viral proteins. HTLV-I is widely spread throughout the world. It is endemic in Japan, Africa, the Caribbean and South America. In Brazil, Salvador city shows the highest HTLV-I prevalence rate (1.7%) of the country. It has been established that a vast majority (nearly 95%) of HTLV-I-infected individuals will remain asymptomatic throughout their life. The mechanisms by which HTLV-I causes diseases are not fully elucidated. The HTLV-I diagnosis is based on serologic detection of specific antibodies against several antigens of the virus or through amplification of proviral sequences in the peripheral blood mononuclear cells. However, there is not an epidemiological study with populational bases and suitable methodology in order to estimate its real prevalence in Brazil.

Key words: HTLV-I, Physiopathogenesis, Epidemiology, Diagnosis

Introdução

O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo I (HTLV-I) foi descrito pela primeira vez em 1980 em células T de paciente com linfoma cutâneo, sendo incluído na família Retroviridae devido às suas propriedades físicoquímicas⁽⁸⁶⁾. Em 1982, Gessain et al. observaram que um indivíduo da Martinica, com anticorpos para HTLV-I, era portador da paraparesia espástica tropical (PET)⁽³²⁾. Em 1986, Osame et al. demonstraram o caráter neurotrópico do HTLV-I, associando-o a mielopatia crônica (MAH) no Japão⁽⁸³⁾. Após demonstração de anticorpos anti-HTLV-I no soro e no liquor de pacientes que apresentavam PET/MAH nas regiões de Caribe, Colômbia e Japão, Ijichi et al. (1989) concluíram que a PET e a MAH são enfermidades relacionadas entre si⁽⁴⁶⁾. A relação entre PET/MAH e HTLV-I foi mais tarde observada em muitas áreas do mundo⁽⁹⁰⁾. E, finalmente, em 1988, o vírus foi isolado por MacHann et al.⁽⁶⁴⁾.

O vírus

O HTLV pertence à família Retroviridae e tem um genoma de RNA de fita simples com uma estrutura genética similar à dos demais retrovírus, possuindo os genes gag, pol e env, além de uma seqüência próxima à extremidade 3' conhecida como região X, a qual contém os genes reguladores tax e rex. O HTLV-I e o vírus linfotrópico de células T humanas do tipo II (HTLV-II) diferenciam-se principalmente no gene pX, sendo, no entanto, homólogos em cerca de 60%. O HTLV-I e o HTLV-II têm propriedades biológicas similares e tropismo para linfócitos T^{(40, 41, 45)}, porém o HTLV-I infecta preferencialmente linfócitos T CD4+, enquanto o HTLV-II tem tropismo para linfócitos T CD8+, com efeito hematológico diferente do HTLV-I⁽⁷⁸⁾.

A estabilidade genética entre as cepas de HTLV-I é muito grande em comparação à seqüência env do HIV⁽⁹⁵⁾, que apresenta mais de 30% de variabilidade genética, enquanto no HTLV-I esta variabilidade é de apenas 4%⁽⁸⁸⁾. Uma análise detalhada do genoma proviral demonstra que as regiões LTR e env do HTLV-I apresentam uma larga variabilidade, enquanto as regiões gag e pol apresentam uma alta similaridade entre diferentes isolados provirais. Por essa razão, as seqüências LTR são particularmente preteridas para a caracterização genotípica dos subtipos virais⁽⁵⁸⁾. Esses isolados exibem distribuições geográficas peculiares⁽⁹⁴⁾, mas acredita-se que não estejam associados a diferentes patologias dessa infecção retroviral⁽¹⁰⁷⁾.

Como os demais retrovírus, seu ciclo de vida é dependente da enzima transcriptase reversa. Inicialmente a partícula viral necessita se ligar à superfície celular. Essa inserção ocorre entre as glicoproteínas do envelope viral e receptores específicos da superfície celular, ainda desconhecidos. Após essa interação, o vírus torna-se capaz de penetrar na célula, liberando todo o seu conteúdo no citoplasma. Neste, a fita simples de RNA viral é transcrita à DNA de fita dupla pela transcriptase reversa. A dupla fita de DNA linear migra para o núcleo e integra-se no genoma do hospedeiro pela ação de uma integrase viral⁽⁹⁶⁾. Uma vez integrado, o provírus utiliza a maquinaria celular para a transcrição primária do RNA genômico. Parte do RNA viral sintetizado é processada para gerar o RNAm que será traduzido nas proteínas virais apropriadas no citoplasma. Como último passo, o core viral é montado e o vírus é liberado da superfície celular por um processo mais ou menos simultâneo (Figura 1)⁽⁹⁾. Os dados até agora disponíveis sugerem que o HTLV-I é um vírus pouco replicativo e que a replicação viral in vivo ocorre mais devido à expansão clonal das células infectadas, via mitose, do que via transcrição reversa^{(13, 115)}.

Vias de transmissão e fatores de risco

A transmissão do HTLV-I ocorre, principalmente, por três vias: a) horizontal (contato sexual), sendo a infecção mais freqüentemente transmitida do homem para a mulher. Presume-se que a infecção adquirida através da atividade sexual seja conseqüente dos linfócitos infectados presentes no sêmen e na secreção vaginal⁽⁵⁰⁾; b) vertical (da mãe para o filho), caracterizada por transmissão transplacentária, durante o parto e pela amamentação^{(2, 102)}; e c) parenteral, ocorrendo através da transfusão de sangue contaminado e seus produtos, bem como do uso de seringas contaminadas. A transmissão do HTLV-I é menos eficiente que a do vírus da imunodeficiência humana (HIV), devido à baixa carga viral e ao fato de a infecção ser dependente do contato célula/célula⁽⁵²⁾.

Em 1995, Krämer et al. observaram que 100% dos pacientes com PET/MAH na Jamaica possuíam anticorpos anti-HTLV-I, indicando que esse vírus é o principal fator de risco para a doença naquele país⁽⁵⁶⁾. Os casos de PET/MAH em pacientes do sexo feminino podem ser diretamente relacionados a uma transmissão mais alta do homem para a mulher do que da mulher para o homem⁽⁷⁷⁾. A associação de PET/MAH com uma vida sexual precoce e ativa pode ter diversas explicações possíveis. Primeiro, esse parâmetro poderia identificar um subgrupo de pacientes que adquiriu HTLV-I em idade precoce e então desenvolveu a doença após uma latência que pode variar de meses a anos. Segundo, mulheres jovens poderiam ser mais susceptíveis à infecção pelo HTLV-I devido à imaturidade do trato genital feminino, que as predispõe a uma variedade de doenças sexualmente transmissíveis⁽⁸⁾. Doenças inflamatórias sexualmente transmissíveis poderiam atrair uma alta densidade de linfócitos para o trato genital, condição necessária para que a infecção pelo HTLV-I ocorra. Entretanto, uma vida sexual precoce parece não ser um fator de risco para a LLTA. Esse fato suporta a idéia de que a PET/MAH resulta de uma infecção pelo HTLV-I ainda na adolescência, enquanto a LLTA resulta de uma infecção adquirida via transmissão vertical⁽⁷⁶⁾.

A transfusão sanguínea constitui um outro fator de risco importante para a infecção pelo o HTLV-I e conseqüente desenvolvimento de PET/MAH. Foi observado, no Japão, que em cerca de três anos uma alta porcentagem dos pacientes transfundidos com sangue contaminado pelo HTLV-I desenvolveu PET/HAM⁽⁸⁴⁾.

Origem

Quanto à origem geográfica, algumas pesquisas sugerem que o HTLV-I tenha se originado na África, por transmissão interespécies, a partir de primatas não-humanos, sendo levado ao novo mundo (Caribe, Estados Unidos e América do Sul) pelos negros africanos, durante o período de tráfico de escravos no século 16^{(29, 34, 91, 100)}. É sabido que durante o tráfico de escravos houve escala das embarcações nas ilhas do Caribe, região endêmica para o HTLV-I^{(48, 119, 120)}. Através de estudos do haplótipo da b^A globina, Alcântara et al., em 2003, observaram que de 34 pacientes infectados pelo HTLV-I em Salvador, Bahia, 29,4% foram caracterizados como pertencentes ao haplótipo Central African Republic (CAR); 45,6% como Benin (BEN) e 25% foram caracterizados como pertencentes ao grupo Senegal (SEN)⁽¹⁾. Esses resultados corroboram a hipótese de múltiplas introduções pós-colombianas de cepas de HTLV-I da África no novo mundo.

Numa outra pesquisa é defendida a hipótese da migração de paleomongolóides através do Estreito de Bering: partindo inicialmente do norte da Ásia, passando pela América do Norte, até se espalharem pela América do Sul, se estabeleceram nos Andes e nas regiões Amazônicas⁽¹²⁰⁾. Hoje em dia, as duas vertentes são igualmente aceitas⁽¹⁰⁹⁾.

Caracterização filogenética

As análises filogenéticas, baseadas no gene LTR, classificam o HTLV-I em quatro subtipos: Ia ou cosmopolita, é endêmico em diferentes regiões geográficas na Europa, sul da América do Norte e na América do Sul, incluindo o Brasil^{(70, 71)}; Ib ou da África Central, é endêmico na África Central^{(39, 110)}; Ic ou melanésico, é endêmico na Austrália e em Papua-Nova Guiné^{(4, 33)}; e Id, descrito como um novo subtipo isolado de pigmeus de Camarões e de um indivíduo do Gabão^{(12, 65)}. O subtipo cosmopolita consiste em quatro subgrupos: A – transcontinental; B – japonês, é endêmico no Japão e em áreas isoladas da América do Sul; C – oeste da África; e D – norte da África. Os subgrupos transcontinental e do Oeste Africano foram confirmados em vários países americanos^{(31, 70, 110, 114)}. Em 1998, Salemi et al., baseando-se na seqüência LTR e env do HTLV-I, descreveram mais dois novos subtipos, divergentes dos já publicados: Ie, de um pigmeu Efe-Mbuti vivendo no Congo, e If, de um indivíduo do Gabão⁽⁹²⁾.

Epidemiologia

As principais áreas endêmicas no mundo para infecção pelo HTLV-I são Japão, Caribe, América Central e do Sul, África Equatorial, Oriente Médio e Melanésia^{(62, 75)}. Como conseqüência da baixa transmissão horizontal do vírus, a prevalência nessas áreas endêmicas não é uniforme. O sul do Japão (Kyushu, Shikoku e Okinawa) é a região mais endêmica do mundo^{(43, 51)}, onde a soroprevalência pode atingir até 20% da população⁽⁷⁵⁾. O HTLV-I foi também encontrado no norte desse país, em uma comunidade Ainu, descendente de aborígines japoneses⁽⁴⁸⁾. A existência de infecções pelo HTLV-I na África Equatorial^{(19, 22, 93, 113)}, juntamente com a presença do HTLV-I entre descendentes de africanos residentes no Caribe e na América Latina, sugere que a África é o reservatório primário desse vírus⁽¹¹¹⁾. Goubau et al. (1990) demonstraram que a Província Equatoriana do Congo possui a mais alta soroprevalência da África (mais de 15% da população), com a maior incidência de PET/MAH⁽³⁷⁾. Mais recentemente, infecções pelo HTLV-I foram registradas entre diferentes tribos de pigmeus que habitam em Camarões, na República da África Central e no nordeste do Congo^{(38, 65, 92)}. No Oriente Médio, o HTLV-I tem uma soroprevalência de cerca de 3% no nordeste do Irã⁽¹¹⁷⁾. Outras importantes áreas endêmicas para o HTLV-I são a Melanésia e a Austrália; cerca de 14% de soroprevalência foi encontrada em Hagahai, uma tribo isolada que vive em Papua-Nova Guiné⁽¹¹⁸⁾. Soroprevalências de 2% a 10% e de 1% a 7% foram encontradas nas Ilhas de Solomon e entre aborígines australianos, respectivamente^{(4, 119)}. No Novo Mundo, a maioria dos casos positivos ocorre em descendentes africanos, em imigrantes japoneses e em índios nativos. No Caribe a soroprevalência varia de 0% a 10% nas distintas ilhas e nos diferentes grupos étnicos, com uma alta incidência entre a população negra de descendência africana^{(6, 21)}. Os casos de HTLV-I relatados nos Estados Unidos ocorrem em áreas endêmicas isoladas ou foram encontrados entre os usuários de drogas⁽⁶¹⁾. O HTLV-I foi também isolado em índios norte-americanos⁽³⁵⁾, em aborígines do Alasca⁽¹⁶⁾ e em índios canadenses que apresentaram sintomas das doenças relacionadas ao vírus⁽¹⁸⁾. Por outro lado, o vírus é endêmico em diversos países da América Central e do Sul, incluindo Honduras⁽¹⁷⁾, Panamá⁽⁸⁹⁾, Colômbia^{(25, 66)}, Venezuela⁽⁶⁹⁾, Bolívia⁽¹⁰⁵⁾, Brasil^{(7, 26, 67, 92, 103)}, Peru^{(36, 49)}, Chile⁽¹⁰⁾ e Argentina⁽⁷⁾.

No Brasil, o HTLV-I foi primeiramente descrito em 1986, por Kitagawa et al., em uma comunidade japonesa residente em Campo Grande (MS), com soroprevalência de 13%, sendo a maioria dos indivíduos oriundos de Okinawa, sul do Japão⁽⁵⁵⁾. Cortes et al. (1989) mostraram taxas de positividade ao HTLV-I de 1% em prostitutas da zona rural e 13% em hemofílicos dos estados de Rio de Janeiro, Minas Gerais e São Paulo⁽¹⁴⁾. Estudos sobre a prevalência do HTLV-I em doadores de sangue provenientes das diferentes regiões geográficas brasileiras demonstraram que a prevalência da infecção varia nessas regiões, sendo 0,08% no norte e no sul do país (Manaus e Florianópolis); 0,33% no nordeste e no sudeste (Recife e Rio de Janeiro) e 1,35% em Salvador⁽³⁰⁾. Provavelmente essa elevada prevalência em Salvador deve-se ao fato de a população dessa cidade ter características sociodemográficas semelhantes às cidades africanas situadas abaixo do Saara⁽³⁰⁾. No Brasil o HTLV-II é endêmico em diversas populações indígenas, com prevalências de 33,3% a 57,9% na tribo Kaiapó^{(27, 47, 67)}; 12,2% na tribo Kraho⁽⁶⁷⁾; 0,42% a 15,4% na tribo Tiriyo^{(47, 97)}; 8,1% na tribo Mundukuru e 11,4% na tribo Arara do Laranjal⁽⁴⁷⁾. A baixa prevalência (0,42%) encontrada por Shindo et al.⁽⁹⁷⁾ na tribo Tiriyo deve-se ao maior número de amostras analisadas pelos mesmos em comparação com estudo realizado por Ishak et al., em 1995 (15,4%)⁽⁴⁷⁾. Por outro lado, Shindo et al. observaram uma prevalência de 0,56% de infecção pelo HTLV-I na tribo Waiampi, resultado semelhante àquele encontrado por Talarmin et al. em 1999⁽¹⁰³⁾.

Até o momento não existe nenhum estudo epidemiológico com bases populacionais e com metodologias adequadas sobre a infecção pelo HTLV-I que permita conhecer sua real prevalência em nosso país.

Patologias associadas ao HTLV-I

O HTLV-I é o agente etiológico da leucemia/linfoma de células T do adulto (LLTA)⁽¹⁰⁶⁾ e da paraparesia espástica tropical ou mielopatia associada ao HTLV-I (PET/MAH)^{(32, 83)}. Está associado também a outras condições clínicas, como artropatias⁽⁸⁰⁾, polimiosites⁽⁷³⁾, uveítes⁽⁷²⁾, dermatite infectiva⁽⁵⁹⁾, síndrome de Sjögren⁽⁶⁸⁾, entre outras. As diversas manifestações clínicas podem depender de tipo e magnitude da resposta imune do hospedeiro para os antígenos do HTLV-I e do local ou órgão no qual a reação inflamatória acontece. Contudo, o elemento-chave em determinar a expansão policlonal das células T (doenças não-malignas) versus expansão monoclonal dessas células (neoplásicas) ainda não está bem esclarecido⁽¹¹⁶⁾. A LLTA ou a PET/MAH desenvolve-se em uma pequena proporção nas pessoas infectadas. Cerca de 98% dos portadores permanecem assintomáticos^{(65, 82)}. Alguns estudos demonstraram que uma grande parte da população japonesa é portadora do vírus, porém o risco estimado para desenvolver LLTA nos portadores é de 2% a 4%, enquanto o risco para desenvolvimento de mielopatia é de 0,25%^{(54, 104)}. Não há dados no Brasil indicando a porcentagem de indivíduos portadores, nem a quantidade destes que evoluem para alguma forma clínica associada ao vírus.

Já que os vírus isolados de pacientes com LLTA e PET/MAH foram idênticos, fatores próprios do hospedeiro, incluindo o sistema HLA, devem ser importantes para determinar as manifestações da infecção. Em contraste com o baixo nível de resposta imune para o HTLV-I nos pacientes com LLTA, indivíduos com PET/MAH apresentam vigorosa resposta aos antígenos do HTLV-I. Essa resposta é demonstrada pela concentração elevada de anticorpos contra o vírus no soro e no fluido cerebrospinal e está associada ao haplótipo HLA-A2⁽¹⁰¹⁾. Contudo, pode ser que atividades transativadoras específicas de proteínas virais, em combinação com eventos genéticos secundários e específicos, em diferentes tipos de células, determinem se a infecção pelo HTLV-I se manifestará como leucemia, doença neurológica ou permanecerá assintomática.

Proteínas regulatórias virais

Tax e Rex são as principais proteínas com função reguladora do genoma viral, sendo ambas codificadas na região pX do HTLV-I. Tax é uma fosfoproteína nuclear que regula a transcrição do genoma proviral indiretamente ao interagir com diferentes proteínas regulatórias celulares. Tax também pode induzir indiretamente a expressão de genes celulares^{(20, 23)}. Isso pode ter um papel importante na transformação da célula infectada pelo HTLV e, portanto, na patogênese caracterizada por esta infecção viral. A proteína Tax é essencial para a eficiência da expressão viral⁽⁹⁹⁾ e desenvolve um importante papel na ativação de genes celulares, tais como genes de citocinas^{(74, 98)} e protoncogenes⁽²⁴⁾. Além disso, a proteína Tax é um alvo antigênico de linfócitos T citotóxicos (CTL) na resposta ao HTLV-I^{(53, 85)}. Diferenças no gene pX podem influenciar na carga viral em virtude de diferenças na habilidade de transativação da proteína Tax ou pela diferença no reconhecimento dos CTL⁽⁷⁹⁾. Diferenças na atividade de transativação no gene da citocina pela proteína Tax também podem influenciar no desenvolvimento da infecção. Diversos estudos mostraram que Tax induziu o aumento da expressão de diferentes genes relacionados com o crescimento celular, como os protoncogenes c-fos, c-myc e erg, fatores de crescimento ou seus receptores, como interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, cadeia a do receptor para IL-2 (IL-2Ra), c-sis (PDGF, fator de crescimento derivado de plaqueta), fator estimulante de colônias de macrófagogranulócito (GM-CSF), fator de crescimento tumoral b (TGF-b), proteína relacionada ao hormônio da paratireóide (PTHrP), vimetina (proteína do citoesqueleto), complexo principal de histocompatibilidade de classe I (MHC-I), fator nuclear kB (NF-kB) e fator de necrose tumoral b (TNF-b). Oúnico gene até então descrito como tendo a sua transcrição inibida pela Tax é o gene que codifica para a polimerase b, uma enzima envolvida no reparo do DNA (Figura 2)^{(20, 23)}. Rex também é uma fosfoproteína nuclear e atua como um regulador pós-transcricional do genoma do HTLV-I ao controlar o processamento (splicing) do mRNA viral. A proteína Rex favorece o acúmulo de proteínas estruturais em detrimento das proteínas regulatórias, e um fino balanço entre a expressão e atividade de Tax e Rex pode ditar o estado de replicação viral nas células infectadas. Tax e Rex não apenas regulam a expressão viral, mas também podem interferir nas funções da célula hospedeira em diferentes níveis, afetando a transcrição e a tradução de vários genes celulares. Esses efeitos de Tax e Rex certamente são relevantes na patogênese das doenças associadas ao HTLV-I^{(20, 23)}.

Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos desenvolvem doença. Também não está claro ainda porque alguns indivíduos desenvolvem PET/MAH e outros LLTA. Há poucas investigações que têm determinado correlações genotípicas entre a patogenicidade e os vários subtipos de HTLV-I. Estudos das propriedades moleculares e biológicas do HTLV-I em indivíduos infectados fornecerão informações importantes sobre a patogenicidade do vírus. Komurian et al., em 1991, tentaram relacionar o desenvolvimento de PET/MAH e LLTA com variações específicas nos genes LTR, env e pX estudando um número pequeno de indivíduos (quatro japoneses, dois habitantes da Costa do Marfim e dois caribenhos), porém concluíram que as duas distintas patologias não estavam relacionadas às mutações específicas nas seqüências analisadas⁽⁵⁷⁾. Em 1999, Beby-Defaux et al. analisaram a seqüência das regiões LTR e pX de 15 indivíduos com diferentes patologias associadas ao HTLV-I (quatro com PET/MAH e síndrome de Sicca, dois com síndrome de Sicca, um com PET/MAH, quatro com LLTA e quatro indivíduos assintomáticos), porém não relacionaram nenhuma mutação com o desenvolvimento dessas patologias⁽⁵⁾. Recentemente, Furukawa et al. (2000), através da análise da seqüência do gene tax do HTLV-I de 61 pacientes com PET/MAH, 55 com LLTA e 62 assintomáticos, classificaram as mutações observadas no gene tax em dois subgrupos: taxA (seqüências que apresentavam quatro mutações específicas) e taxB (seqüências que não apresentavam tais mutações). Comparando a análise filogenética do gene LTR com a análise filogenética do gene tax, observaram que o subgrupo taxA era relacionado ao subtipo cosmopolita transcontinental, e o subgrupo taxB era relacionado ao subtipo cosmopolita japonês. Analisando todos os isolados dos subgrupos taxA e taxB, confirmaram que o taxA é mais freqüente em pacientes com PET/MAH do que em pacientes assintomáticos. Além disso, foi feita a comparação do resultado da carga proviral com as mutações taxA e taxB, porém não foi encontrada uma diferença significativa⁽²⁸⁾.

Diagnóstico sorológico e molecular

O diagnóstico rotineiro da infecção causada pelo HTLV-I baseia-se na detecção sorológica de anticorpos específicos para componentes antigênicos das diferentes porções do vírus (core e envelope). Uma vez que os métodos de triagem sorológica para HTLV, os ensaios imunoenzimáticos, apresentam freqüentes reações falso-positivas^{(11, 87, 121)}, o imunodiagnóstico dessa retrovirose depende de confirmação da soro-reatividade, através de Western blot ou da reação em cadeia da polimerase (PCR). O algoritmo empregado para detecção sorológica inicial preconiza a utilização de testes imunoenzimáticos com amostras de soro em duplicata. Essa técnica possui a vantagem de ser simples, apresentar alta sensibilidade e ainda poder ser automatizada para testagem simultânea de grande número de soros. Sua sensibilidade pode, no entanto, variar dependendo da base antigênica empregada na reação⁽¹⁵⁾. Tem-se dado preferência a reações imunoenzimáticas, que utilizam como substrato antigênico lisados virais de HTLV-I acrescidos de antígenos de HTLV-II, já que os lisados virais de HTLV-I isoladamente apresentam menor sensibilidade para identificação de portadores de HTLV-II⁽⁴⁴⁾. As amostras que apresentam resultados repetidamente reagentes aos testes imunoenzimáticos necessitam sempre ser submetidas a testes confirmatórios, como o Western blot. Os testes de Western blot utilizados no algoritmo de investigação sorológica utilizam como antígeno o lisado viral total, acrescido de epítopos imunodominantes recombinantes, correspondentes à porção N-terminal da proteína transmembrana (gp21) do HTLV-I/II (peptídeos r21-e e GD21-I). Esses testes apresentam alta sensibilidade para detectar anticorpos contra o epítopo recombinante. O emprego do peptídeo recombinante GD21-I produz uma freqüência menor de reações inespecíficas, reduzindo a possibilidade de resultados falso-positivos⁽¹¹²⁾ e constituindo, assim, o método de escolha para o diagnóstico confirmatório de infecção por HTLV-I/II. Dessa forma, indivíduos soropositivos são aqueles em que se detectam anticorpos contra antígenos do core (anti-p24), juntamente com anticorpos contra glicoproteínas do envelope (r21-e, gp46 ou gp61/68) nos testes confirmatórios. Os indivíduos indeterminados são aqueles que apresentam anticorpos séricos que reagem com antígenos de HTLV-I/II, porém com padrão de reatividade diferente do acima descrito para soropositivos. Os negativos são aqueles cujos soros não reagem com antígenos de HTLV.

O diagnóstico molecular de infecção por HTLV-I ou HTLVII é indicado para o esclarecimento de casos inconclusivos aos testes sorológicos, quer seja por apresentarem resultados indeterminados ao teste de Western blot, ou mesmo quando a reação de Western blot, embora positiva, seja incapaz de distinguir a infecção causada por HTLV-I daquela causada por HTLV-II. Além disso, esse diagnóstico pode facilitar a identificação de lactentes infectados por transmissão vertical, a partir de mães soropositivas, uma vez que as provas sorológicas nessa situação não permitem descartar a presença de anticorpos maternos, transferidos passivamente por via transplacentária ao sangue das crianças^{(2, 81)}.

Os testes moleculares baseiam-se na pesquisa de seqüências genômicas provirais em células mononucleares periféricas lisadas enzimaticamente pela proteinase K^{(3, 42, 108)}. Empregam-se técnicas de amplificação de segmentos genômicos, por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). Na PCR podem-se utilizar iniciadores (primers) consensuais, que têm como objetivo o diagnóstico diferencial da infecção causada pelo HTLV-I daquela causada pelo HTLV-II, ou utilizar primers específicos capazes de permitir a amplificação exclusiva de HTLV-I ou HTLV-II. Em seguida, procede-se à eletroforese dos produtos genômicos amplificados em gel de agarose. Os fragmentos de DNA amplificados podem ser visualizados diretamente no gel de agarose, corados com brometo de etídio (fluorocromo capaz de se ligar aos ácidos nucléicos e emitir fluorescência quando irradiado por luz ultravioleta). Segundo Ureta-Vidal et al. (1994), os diferentes subtipos do HTLV-I não estão relacionados a diferentes manifestações clínicas. Porém, estudos de subtipagem molecular do vírus constituem uma importante ferramenta para fins epidemiológicos⁽¹⁰⁷⁾. Os subtipos podem ser estimados pela construção de árvores filogenéticas utilizando seqüências LTR e env, amplificadas através da técnica da PCR⁽¹⁾, ou através de uma técnica denominada restrict fragment length polymorphism (RFLP), a qual utiliza enzimas de restrição que agem em pontos específicos dos fragmentos seqüenciados pela PCR, clivando- os e gerando um padrão de fragmentos menores que irão caracterizar cada subtipo viral^{(58, 95)}.

Vários métodos foram descritos para detectar e quantificar os produtos da PCR visando minimizar a manipulação das amostras. Em 1992, foi introduzida a idéia de quantificar em tempo real o produto da PCR medindo o aumento de intensidade da fluorescência emitida pelo brometo de etídio durante a amplificação, utilizando câmara charge couple device (CCD) para detecção; no entanto, intercalantes de DNA, além de identificar o produto amplificado, também se intercalam em produtos inespecíficos, tais como dímeros de primers, dificultando a obtenção de dados precisos. Novas tecnologias foram desenvolvidas possibilitando a utilização do sistema TaqMan, que é altamente específico, através de equipamentos modernos capazes de detectar fluorescência em tempo real. Estes possuem laser de argônio que excita os elétrons dos fluoróforos, gerando sinal luminoso que é captado por fibras ópticas e depois separado nos diferentes comprimentos de ondas que o compõem em um espectrógrafo. Finalmente, esses sinais são detectados por uma câmara CCD que transmite o sinal coletado para um computador onde os dados serão analisados por softwares específicos.

Dessa forma, o sangue dos indivíduos portadores de HTLV pode ser analisado por essa metodologia. Técnicas convencionais de diagnóstico sorológico para detecção dessa infecção não têm mostrado resultado satisfatório, já que falham na detecção de uma infecção recente, quando a resposta imune ainda está se desenvolvendo e anticorpos específicos nem sempre estão presentes nos indivíduos. Por outro lado, nos testes baseados na detecção de ácido nucléico não ocorre esse tipo de problema, pois o DNA encontra- se presente em muitas células infectadas. No entanto, é necessário usar uma técnica suficientemente sensível, para poder detectar baixos níveis de infecção, e específica, para evitar resultados falso-positivos. É através da PCR em tempo real que está começando a ser feita a carga viral tanto nos casos de infecção causados pelo HTLV quanto nos causados por HIV, HBV e HCV, entre outros agentes.

Há uma elevada concordância dos resultados obtidos através da técnica de Western blot discriminatório e da PCR. Sendo assim, observa-se que a infecção por HTLV-I ou HTLV-II é persistente e os indivíduos soropositivos devem ser considerados potenciais transmissores desses retrovírus. A maioria dos indivíduos soro-indeterminados não se mostra infectada após a investigação por diagnóstico molecular^{(60, 63)}. Porém aqueles indivíduos que se mostram soro-indeterminados à reação de Western blot, e que se mostraram infectados por HTLV-I ou HTLV-II através do diagnóstico molecular, na verdade revelam-se positivos em investigação sorológica complementar conduzida posteriormente, pois a soroconversão de indivíduos infectados pelo HTLV pode ocorrer anos após a infecção, sendo que alguns pacientes produzem anticorpos anti-HTLV em baixa concentração, os quais são dificilmente detectados pelos testes sorológicos convencionais.

Discussão e conclusões

Após a descoberta da associação do HTLV-I com a paraparesia espástica tropical, no Caribe e no Japão, ocorreu um grande avanço na pesquisa desse retrovírus, permitindo a adoção de medidas profiláticas. Em Kagoshima (Japão), por exemplo, após essa descoberta, cientistas observaram que pacientes portadores de PET/MAH possuíam história prévia de recepção sanguínea⁽⁸⁴⁾. Esse fato levou o governo japonês a adotar a prática de triagem (screening) em todos os seus doadores. Com o objetivo de impedir a transmissão transfusional do HTLV-I/II em procedimentos hemoterápicos que empregam componentes celulares, a triagem sorológica para infecção por esses agentes virais em candidatos à doação de sangue tornou-se compulsória no Brasil desde dezembro de 1993. Na rotina emprega-se como teste de eleição para triagem de doadores o ELISA, para identificar portadores assintomáticos desses retrovírus, sendo os indivíduos com resultados repetidamente positivos submetidos a testes confirmatórios, Western blot e/ou PCR. Esses indivíduos devem receber informações adequadas sobre as vias de transmissão do vírus e sobre o fato de que ele não provoca AIDS, sendo esta causada por um vírus diferente, chamado HIV. Devem, ainda, ser informados de que o HTLV-I/II provoca uma infecção prolongada e de que, no caso do HTLV-I, somente uma pequena porcentagem dos portadores desenvolvem alguma doença associada ao vírus. Uma vez infectado pelo HTLV-II, o indivíduo deve ser informado de que esse vírus não foi ainda conclusivamente associado a nenhuma doença específica.

Os portadores de HTLV-I/II devem ser instruídos a: compartilhar essa informação com os profissionais de saúde aos quais pedem auxílio; não doar sangue, órgãos ou tecidos; não compartilhar seringas ou similares; utilizar preservativos de látex e não amamentar, embora o risco de transmissão do HTLV-II por esta última via seja incerto. Entretanto, como há um risco teórico de transmissão e de desenvolvimento de doenças, como para o HTLV-I, é prudente que mães portadoras do HTLV-II não amamentem seus filhos, buscando alternativas nutricionais.

Uma avaliação médica periódica dos indivíduos infectados pelo HTLV-I/II é recomendada. Nessa avaliação deverão ser incluídos exame físico, neurológico e avaliação hematológica. Avaliações médicas para indivíduos portadores de HTLV-II devem ser consideradas normais. Os indivíduos que desenvolverem alguma doença devem ser encaminhados para médicos especializados para receberem tratamentos individualizados.

O diagnóstico laboratorial molecular ainda é realizado somente em grandes centros de pesquisa, pois exige infraestrutura peculiar, pessoal treinado, os equipamentos e reagente são caros. Talvez esse seja o principal problema que a epidemiologia molecular enfrente no Brasil, pois ainda não é bem esclarecida a diversidade filogenética de isolados de HTLV nas diversas regiões do país. Com o desenvolvimento de metodologias capazes de realizar a carga viral, como o PCR em tempo real, o acompanhamento aos indivíduos infectados pelo HTLV torna-se mais preciso. Entretanto, essa metodologia é bem mais cara que a PCR. Melhorando-se a capacidade diagnóstica para esse vírus e conscientizando-se a população sobre sua importância, o Brasil poderá se tornar um país de referência no combate a esse retrovírus, como acontece com a infecção causada pelo HIV.

Agradecimentos

A Gabriel de Mendonça Lima, pelas ilustrações gráficas.

Primeira submissão em 25/11/03

Última submissão em 27/01/05

Aceito para publicação em 09/04/05

Publicado em 20/04/05

Trabalho realizado no Laboratório de Imunobiológicos, Faculdade de Farmácia da UFBA.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Jul 2005
• Data do Fascículo
  Abr 2005

Histórico

• Aceito
  09 Abr 2005
• Recebido
  25 Nov 2003