Galectina-3 em tumores de próstata: imuno-histoquímica e análise digital de imagens

Galectin-3 in prostatic tumours: immunohistochemistry and digital image analysis

Resumos

A imuno-histoquímica é uma técnica de grande ajuda no diagnóstico de doenças da próstata, incluindo os tumores. De igual importância, a análise digital de imagens vem sendo cada vez mais utilizada em estudos de alterações na próstata. O presente estudo teve como objetivo quantificar morfometricamente a expressão da galectina-3 através da imuno-histoquímica em tecidos de próstata normal (PN), hiperplasia benigna da próstata (HPB) e adenocarcinoma prostático (AP). Fragmentos cirúrgicos de tecido prostático com AP (n = 10), HPB (n = 12) e PN (n = 10) foram fixados em formalina, submetidos à rotina histológica e embebidos em parafina. Foram feitos cortes histológicos (4µm) montados em lâminas e corados com hematoxilina e eosina (HE) para confirmar o diagnóstico. As amostras teciduais selecionadas foram incubadas com anticorpo monoclonal antigalectina-3 por uma hora em temperatura ambiente (37ºC) e então incubadas com um anticorpo secundário. A revelação foi realizada após incubação com diaminobenzidina (DAB) e peróxido de hidrogênio. A análise morfométrica foi realizada mediante uma estação de análise digital de imagens, que consiste num microscópio óptico acoplado a uma câmera digital ligada a um computador equipado com o software de análise OPTIMAS®. Nas células de adenocarcinoma foi observada diminuição significativa na marcação (p < 0,001) da imuno-histoquímica para galectina-3. A partir da análise digital de imagens das áreas médias marcadas obtivemos os seguintes resultados: HPB (875,9 ± 52,1µm²), AP (120,2 ± 23,3µm²) e PN (238,4 ± 27,6µm²). Os diferentes perfis de expressão da galectina-3 diferenciaram as células neoplásicas da próstata de células normais e demonstraram significativas alterações na expressão da galectina-3 nas lesões tumorais investigadas.

Próstata; Galectina-3; Análise digital de imagens; Tumor

Immunohistochemistry helps pathologists in the diagnosis of prostatic diseases, mainly carcinomas. Equally important, digital image analysis is being increasingly used to study alterations in the prostate. The present work aims to morphometrically quantify the immunostain of galectin-3 expressed in normal prostate (NP), benign hyperplasia (BH) and prostatic adenocarcinoma (PA) in humans. Immunohistochemistry was developed using monoclonal anti-galectin-3 antibody. Surgical specimens from different patients with BH (n = 12), PA (n = 10) and NP (n = 10) were fixed in formalin, processed and embedded in paraffin. Hematoxylin and eosin staining was used to confirm the diagnosis. Tissue slices (4µm) were incubated with anti-galectin-3 antibody solution for one hour at room temperature and then incubated with a secondary anti-body conjugated to peroxidase (30 minutes). The stain pattern was visualized with diaminobenzidine (DAB) and hydrogen peroxide. Image analysis was carried out using a workstation consisting of a standard light microscope equipped with a digitalizing camera connected to a desktop personal computer. Image storage and retrieval was managed using the OPTIMAS® software system. For prostatic adenocarcinoma cells a significant decreased (p < 0.001) staining pattern for galectin-3 was observed. Computer image analysis detected stained areas of atypic prostatic cells: BH (875.9 ± 52.1µm²), PA (120.2 ± 23.3µm²) and NP (238.4 ± 27.6µm²). The different patterns of galectin-3 expression distinguished the neoplasic cells from normal prostatic ones and significant alterations in the galectin-3 expression into the studied tumor lesions.

Prostate; Galectin-3; Digital image analysis; Tumour

ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL PAPER

Galectina-3 em tumores de próstata: imuno-histoquímica e análise digital de imagens

Galectin-3 in prostatic tumours: immunohistochemistry and digital image analysis

Jorge Luiz Silva Araújo-Filho^I,II; Mario Ribeiro de Melo-Júnior^I,III; Consuelo Antunes Barreto Lins^IV; Romero Antunes Barreto Lins^I; Marcos Cezar Feitosa de P. Machado^I; Luiz Bezerra de Carvalho-Jr^I; Nicodemos Teles de Pontes Filho^I,II

^ILaboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)

^IIMestrado em Patologia pelo Centro de Ciências da Saúde (CCS) da UFPE

^IIIAssociação Caruaruense de Ensino Superior (ASCES)

^IVChefe do Laboratório de Patologia do Hospital Oswaldo Cruz, Universidade de Pernambuco (UPE)

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

A imuno-histoquímica é uma técnica de grande ajuda no diagnóstico de doenças da próstata, incluindo os tumores. De igual importância, a análise digital de imagens vem sendo cada vez mais utilizada em estudos de alterações na próstata. O presente estudo teve como objetivo quantificar morfometricamente a expressão da galectina-3 através da imuno-histoquímica em tecidos de próstata normal (PN), hiperplasia benigna da próstata (HPB) e adenocarcinoma prostático (AP). Fragmentos cirúrgicos de tecido prostático com AP (n = 10), HPB (n = 12) e PN (n = 10) foram fixados em formalina, submetidos à rotina histológica e embebidos em parafina. Foram feitos cortes histológicos (4µm) montados em lâminas e corados com hematoxilina e eosina (HE) para confirmar o diagnóstico. As amostras teciduais selecionadas foram incubadas com anticorpo monoclonal antigalectina-3 por uma hora em temperatura ambiente (37ºC) e então incubadas com um anticorpo secundário. A revelação foi realizada após incubação com diaminobenzidina (DAB) e peróxido de hidrogênio. A análise morfométrica foi realizada mediante uma estação de análise digital de imagens, que consiste num microscópio óptico acoplado a uma câmera digital ligada a um computador equipado com o software de análise OPTIMAS^®. Nas células de adenocarcinoma foi observada diminuição significativa na marcação (p < 0,001) da imuno-histoquímica para galectina-3. A partir da análise digital de imagens das áreas médias marcadas obtivemos os seguintes resultados: HPB (875,9 ± 52,1µm²), AP (120,2 ± 23,3µm²) e PN (238,4 ± 27,6µm²). Os diferentes perfis de expressão da galectina-3 diferenciaram as células neoplásicas da próstata de células normais e demonstraram significativas alterações na expressão da galectina-3 nas lesões tumorais investigadas.

Unitermos: Próstata, Galectina-3, Análise digital de imagens, Tumor

ABSTRACT

Immunohistochemistry helps pathologists in the diagnosis of prostatic diseases, mainly carcinomas. Equally important, digital image analysis is being increasingly used to study alterations in the prostate. The present work aims to morphometrically quantify the immunostain of galectin-3 expressed in normal prostate (NP), benign hyperplasia (BH) and prostatic adenocarcinoma (PA) in humans. Immunohistochemistry was developed using monoclonal anti-galectin-3 antibody. Surgical specimens from different patients with BH (n = 12), PA (n = 10) and NP (n = 10) were fixed in formalin, processed and embedded in paraffin. Hematoxylin and eosin staining was used to confirm the diagnosis. Tissue slices (4µm) were incubated with anti-galectin-3 antibody solution for one hour at room temperature and then incubated with a secondary anti-body conjugated to peroxidase (30 minutes). The stain pattern was visualized with diaminobenzidine (DAB) and hydrogen peroxide. Image analysis was carried out using a workstation consisting of a standard light microscope equipped with a digitalizing camera connected to a desktop personal computer. Image storage and retrieval was managed using the OPTIMAS^® software system. For prostatic adenocarcinoma cells a significant decreased (p < 0.001) staining pattern for galectin-3 was observed. Computer image analysis detected stained areas of atypic prostatic cells: BH (875.9 ± 52.1µm²), PA (120.2 ± 23.3µm²) and NP (238.4 ± 27.6µm²). The different patterns of galectin-3 expression distinguished the neoplasic cells from normal prostatic ones and significant alterations in the galectin-3 expression into the studied tumor lesions.

Key words: Prostate, Galectin-3, Digital image analysis, Tumour

Introdução

Neoplasias são desordens do crescimento e da diferenciação celular que se manifestam como tumores formados por uma massa de células atípicas, resultantes de uma série de mudanças bioquímicas no ambiente celular⁽⁴⁾.

A fim de mapear alterações específicas que ajudem o entendimento da progressão dos tumores, diversos trabalhos têm utilizado histoquímica e imuno-histoquímica de proteínas relacionadas a certas lesões tumorais^{(14, 19, 49)}.

As galectinas vêm sendo largamente utilizadas como ferramentas imuno-histoquímicas para descrever alterações na superfície das células tumorais. Essas alterações são associadas ao crescimento de células tumorais na indução de apoptose ou metástase^{(9, 12)}.

Alterações na expressão de glicoconjugados são freqüentemente observadas em tumores, entre os diversos distúrbios celulares que resultam em neoplasias. Apesar disso, estudos acerca das alterações na glicosilação celular em determinados estágios da carcinogênese prostática são escassos⁽⁶⁾.

Nas neoplasias prostáticas, a análise histopatológica tem grande relevância clínica. Exames histológicos e sorológicos descrevem aspectos muito importantes, possibilitando o monitoramento da evolução da doença⁽⁴⁹⁾. Contudo, os métodos imuno-histoquímicos, quando analisados de forma qualitativa, têm apresentado grande disparidade e variabilidade de resultados entre diferentes observadores. Assim, a fim de prover uma escala numérica e reprodutível dos padrões de marcação dos tecidos, aumentando a sensibilidade e o controle de qualidade das análises, tem-se buscado cada vez mais refinamentos tecnológicos através de métodos morfométricos automatizados^{(30, 37)}.

A análise digital de imagens somada aos novos métodos da biologia molecular vem sendo cada vez mais utilizada no estudo das neoplasias da próstata^{(8, 15)}. A reconstrução tridimensional microscópica do adenocarcinoma prostático tem sido cogitada como nova ferramenta para auxiliar o prognóstico e o diagnóstico desse tipo de tumor⁽³⁾. A interpretação dos resultados das técnicas histoquímicas somada aos métodos computacionais de análise de imagens está sendo bastante útil, especialmente nos casos onde as suspeitas clínicas de câncer prevalecem depois de biópsias com resultados negativos pelos métodos tradicionais⁽²⁷⁾.

Apesar de todas as inter-relações feitas de imuno-histoquímica com galectinas e células tumorais, existem poucos trabalhos demonstrando a eficiência do emprego dessa técnica na marcação de lesões tumorais de próstata, benignas ou malignas. Parece haver ainda muitas aplicações reservadas para esse promissor campo de investigação.

Assim, este estudo objetiva avaliar as diferenças entre lesões benignas e malignas da próstata refletidas na sua expressão de carboidratos através da imuno-histoquímica com a galectina-3 e análise computadorizada de imagens.

Metodologia

Seleção de casos

Foram escolhidos blocos de parafina contendo fragmentos de tecido prostático anteriormente diagnosticados com adenocarcinoma prostático (n = 10) ou hiperplasia prostática benigna (HPB, n = 12), dos arquivos do setor de patologia do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), órgão suplementar da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), e de um laboratório particular do Recife. Para controle, foram utilizados fragmentos de próstata (n = 10) sem distúrbios de natureza anatômica ou funcional, recolhidos do Serviço de Verificação de Óbito (SVO) da Universidade Federal de Pernambuco. Todas as amostras foram oriundas de homens com idades entre 45 e 80 anos (média = 62,2 anos).

O protocolo experimental desenvolvido no presente trabalho foi submetido e aprovado pelo comitê de ética de pesquisas envolvendo seres humanos da Universidade Federal de Pernambuco (Centro de Ciências Biológicas [CCB/UFPE], ofício 155/2005).

Processamento histológico

Os fragmentos teciduais selecionados para controle foram fixados em formalina a 10%, submetidos à rotina histológica e incluídos em parafina; em seguida confeccionaram-se os blocos. De todos os blocos foram obtidos cortes com 4µm de espessura, montados em lâminas histológicas silanizadas, coradas por hematoxilina e eosina e analisadas por um patologista (C.A.B.L.), confirmando a hipótese clínica de acordo com os achados histopatológicos. Para discriminação dos tumores foi empregada a classificação da Organização Internacional de Classificação Histológica de Tumores (Heenan et al., 1996).

Imuno-histoquímica para galectina-3

Foi testada a imunorreatividade da antigalectina-3 conjugada a peroxidase (Sigma, USA) utilizando o protocolo desenvolvido por Hsu et al. (1981).Os tecidos foram desparafinizados em xilol e hidratados em álcool (70%-100%). As lâminas com tecidos prostáticos (4µm) foram incubadas com tampão citrato a 100ºC por 30 minutos sob vapor úmido, lavadas (por cinco minutos) com solução tampão salina de fosfato (PBS) e incubadas com soro de carneiro liofilizado (a fim de evitar reações cruzadas), em seguida incubadas com peróxido de hidrogênio por cinco minutos e lavadas normalmente com PBS, sendo incubadas com uma solução contendo anticorpo monoclonal antigalectina-3 (na diluição 1:400) por 30 minutos, em temperatura ambiente (37ºC). Em seguida, os tecidos foram incubados com anticorpo secundário biotinilado (Kit LSAB DAKO/USA). A revelação do anticorpo foi obtida através da reação da enzima peroxidase visualizada pela incubação dos tecidos em uma solução contendo diaminobenzidina (DAB + H₂O₂). Os cortes foram contracorados com hematoxilina e analisados em microscópio óptico (Olympus BH-2, Japão).

Análise computadorizada de imagens

Imagens digitais foram capturadas das lâminas histológicas com um sistema de videocâmera acoplado a um microscópio óptico (Olympus BH-2), já utilizado com sucesso em análises diagnósticas⁽³¹⁾. O sistema interativo de análise de imagens utiliza Software OPTIMAS^TM e câmera digital CCBBW 410 (Sansung), disponíveis no Departamento de Patologia da UFPE.

Os perfis de marcação da imuno-histoquímica para galectina-3 (magnificação 200x) revelados pela reação do DAB + peroxidase foram captados pelo ajuste do contraste do nível de cinza (gray value). A partir da captura das imagens dos tecidos marcados com a galectina-3 padronizou-se a margem de variação (threshold range).

O parâmetro morfométrico adotado foi a área média total (µm²) composta pelo somatório das estruturas citoplasmáticas marcadas (perfil de marcação da imuno-histoquímica para galectinas-3) por campo captado (área de 12.234µm²) na lâmina histológica. A análise quantitativa das células marcadas foi realizada por meio de sistema automático, estudando-se cinco campos em cada caso.

Para minimizar distorções nos valores das medições devido à presença de células não-marcadas, aplicou-se um fator de correção (FC) de acordo com a equação FC = s/S, onde s é o valor da área superficial marcada e S, a área total medida⁽⁴⁵⁾.

Os dados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando os testes de Tukey e t de Student para um nível de significância (p < 0,05).

Resultados

No presente estudo foi identificada uma expressão citoplasmática da galectina, principalmente nos casos de HPB (Figura 1) e tecido normal (Figura 2).

Nossos resultados demonstraram que ocorrem alterações significativas nos padrões de expressão da proteína galectina-3 nas células do epitélio prostático neoplásico maligno (adenocarcinoma) (Figura 3) indicando uma redução de 50,41% quando em comparação com o epitélio secretor normal (Tabela 1).

Quanto ao sistema computadorizado de imagens utilizado (Sistema OPTIMAS^® 6.1), pode-se observar que as diferentes etapas desde captura (Figura 4), processamento (Figura 5) e análise morfométrica das imagens (Figura 6) foram executadas no mínimo espaço de tempo (20 minutos) para cada lâmina analisada, o que demonstra que, após a calibração inicial do equipamento, o método proposto não se configura uma técnica muito laboriosa.

Discussão

Mudanças qualitativas e quantitativas nos componentes glicoprotéicos das membranas celulares são altamente significativas no desenvolvimento e na progressão de muitos processos neoplásicos⁽⁵⁰⁾. Em células neoplásicas o aumento no conteúdo e/ou na expressão de carboidratos superficiais tem sido amplamente documentado através de histoquímica e imuno-histoquímica^{(20, 44)}. As galectinas, particularmente, estão sendo testadas como ferramentas sensíveis, estáveis e de fácil utilização para distinguir células transformadas e não-transformadas^{(4, 5, 10, 48)}.

As galectinas são observadas em vários tipos de células e tecidos, e diversas funções são descritas para elas. As galectinas têm recebido cada vez mais atenção científica devido às suas diversas funções, não só na glicobioquímica, mas também na medicina, com possível ação farmacológica. A mais estudada é a galectina-3, uma proteína com diversos papéis biológicos.

No presente trabalho, a redução significativa nos padrões de expressão da galectina-3 em adenocarcinoma prostático corrobora os resultados de trabalhos recentes que relatam no câncer de próstata uma expressão reduzida da galectina-3 à medida que ocorre a progressão da doença⁽¹¹⁾. Em contrapartida, há maior expressão dessa proteína em fragmentos de tecido normal quando comparados à contraparte maligna⁽⁴⁸⁾.

Muitas galectinas ainda necessitam ser mais precisamente determinadas, o que demonstra que estudos sobre a expressão tecidual ou a localização intracelular da galectina-3 são importantes no entendimento do comportamento de alguns cânceres^{(22, 35, 43, 48)}.

Em 1986, Gabius et al. publicaram o primeiro trabalho relatando a expressão da galectina-3 no carcinoma de mama. Após essa descoberta, trabalhos preliminares comparando a expressão da galectina-3 em carcinoma de cólon com o tecido normal adjacente foram realizados^{(24, 26, 42)}.

Estudos posteriores tiveram como objetivo avaliar a expressão imuno-histoquímica da galectina-3 em lesões cancerígenas, como em melanoma^{(40, 47)}, fibrossarcoma^{(1, 39, 40)}, células do tumor pancreático⁽⁴¹⁾, adenocarcinoma⁽²³⁾, leucemia^{(7, 29)}, câncer de cólon⁽¹⁷⁾, de próstata^{(10, 33)}, e de mama^{(25, 29)}.

Várias evidências têm demonstrado a importância das interações de células cancerígenas e resíduos de carboidratos durante a progressão do câncer^{(39, 48)}, sugerindo a existência de grande número de moléculas envolvidas nesse evento biológico.

As glicoproteínas e os carboidratos da superfície celular têm papel fundamental na interação célula/célula, e mudanças nesses glicoconjugados nas células cancerosas aparentemente estão associadas à adesão celular alterada e ao desenvolvimento das propriedades invasivas do tumor⁽³²⁾.

Chan⁽⁶⁾ também demonstrou que alfa e betagalactosídeos e o ácido siálico contidos nos glicoconjugados são expressos pelas células prostáticas neoplásicas. Pode-se constatar que, em geral, quanto mais anaplásica (desdiferenciada) torna-se uma célula, mais intensa é a sua marcação imuno-histoquímica por determinadas galectinas, o que indica que a distribuição e a natureza dos glicoconjugados superficiais foram alteradas⁽⁴⁴⁾.

Está claro que a galectina-3 possui diversas funções na patogenia do câncer, na proliferação e na disseminação das metástases. Além disso, foram encontradas alterações não somente na expressão membranar da galectina-3, mas também na sua distribuição intracelular em determinados celulares^{(10, 48)}.

Nas amostras estudadas neste trabalho, foi constatado aumento médio de 367,4% quando em comparação com a expressão da galectina-3 entre tecidos com HPB e tecidos prostáticos normais, o que corrobora estudos anteriores^{(4, 5, 10, 48)}.

É interessante notar que a localização citoplasmática da galectina-3 está relacionada com eventos inibidores da progressão tumoral, visto que sua localização celular parece variar durante a carcinogênese^{(4, 5, 22, 36, 48)}. Entretanto, a transformação maligna de células da tireóide é acompanhada de uma concentração intensa de galectina-3 com perfil exclusivamente membranar⁽³⁴⁾.

Diversos trabalhos têm demonstrado comportamentos antagônicos no que se refere à expressão de galectinas em lesões prostáticas^{(4, 5, 10, 18)}. No trabalho de Ellerhorst⁽¹⁰⁾ a galectina-1 foi expressa nos fragmentos de próstata normal, neoplasia intra-epitelial prostática e adenocarcinoma. Entretanto, a galectina-3 apresentou expressão diminuída em adenocarcinoma e metástases do câncer de próstata em comparação com o tecido normal e o HPB. Esse resultado confirma os dados obtidos por este estudo quando comparamos os casos de adenocarcinoma prostático com tecido normal e lesão benigna (HPB).

De acordo com os dados encontrados neste estudo pode-se sugerir que a diminuição na expressão da galectina-3 está associada à progressão do câncer de próstata. Contudo, são necessários mais estudos principalmente devido ao fato de que o aumento na expressão da galectina-3 em alguns tecidos e sua diminuição em outros indica sua diferente função nas diferentes patologias nos tecidos, ora agindo como fator de desenvolvimento tumoral, ora protegendo contra a progressão do tumor.

Tanto na prática clínica como em trabalhos experimentais é de fundamental importância a utilização de métodos para quantificar parâmetros relevantes observados na formação de tecido tumoral. Alguns métodos morfométricos semiquantitativos têm sido utilizados, porém demandam maior tempo, são trabalhosos e os resultados não são precisos. Atualmente é possível obter determinação quantitativa através de análise digital de imagens. Esse método tem sido altamente validado devido a resultados precisos quando comparado aos métodos de score semiquantitativos e/ou descritivos⁽²⁾.

A partir dos resultados da análise morfométrica utilizando o sistema de análises OPTIMAS^TM 6.1, pode-se constatar a eficiência desse sistema para avaliar tecidos marcados com a técnica de imuno-histoquímica.

Todavia existem algumas limitações, como padronização (calibração), alto preço do equipamento e longo período de treinamento, que podem ser as causas da lenta implantação dessa metodologia nos laboratórios de patologia, tanto para uso na rotina histológica como para utilização em imuno-histoquímica de tecidos com lesões tumorais⁽²⁾.

Poucos trabalhos têm empreendido a utilização de métodos morfométricos computadorizados para o estudo de distúrbios morfológicos da próstata^{(3, 8, 15)}. Entretanto, aqueles que o fazem relatam os potenciais ganhos para o entendimento da carcinogênese prostática, principalmente como um instrumento de relevante valor prognóstico.

A quantificação morfométrica das lesões tumorais enfrenta algumas dificuldades, como a grande variedade histológica, a etiologia e a evolução natural da doença, a distribuição e a composição bioquímica bastante variável dos tumores⁽²⁾.

Dessa forma, de acordo com os dados qualitativos (imuno-histoquímica) e quantitativos (análise de imagens) obtidos, pode-se constatar que as galectinas podem servir como importantes sinalizadores das alterações bioquímicas específicas nas células, com isso auxiliando na distinção entre lesões tumorais benignas e malignas da próstata.

Conclusões

A partir dos resultados obtidos conclui-se que houve redução estatisticamente significativa na expressão tecidual de galectina-3 em células do adenocarcinoma prostático (50,41%) quando comparadas ao tecido normal.

Todas as amostras de hiperplasia prostática benigna apresentaram aumento significativo na expressão celular da galectina-3 (367,4%) quando comparadas com a contraparte maligna e o tecido normal.

O sistema de análise de imagens utilizado (OPTIMAS^TM 6.1) demonstrou ser ferramenta eficiente na quantificação da expressão citoplasmática da galectina-3 pela técnica de imuno-histoquímica.

Primeira submissão em 29/06/06

Última submissão em 15/09/06

Aceito para publicação em 24/10/06

Publicado em 20/12/06

Trabalho desenvolvido no Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA/UFPE).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  31 Jan 2007
• Data do Fascículo
  Dez 2006

Histórico

• Aceito
  20 Dez 2006
• Revisado
  24 Out 2006
• Recebido
  15 Set 2006