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Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial

Print version ISSN 1676-2444

J. Bras. Patol. Med. Lab. vol.44 no.5 Rio de Janeiro Oct. 2008

http://dx.doi.org/10.1590/S1676-24442008000500009 

ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL ARTICLE

 

Imuno-histoquímica para o diagnóstico precoce de vitiligo

 

Immunohistochemistry for early diagnosis of vitiligo

 

 

Gisele Alborghetti NaiI; Luciane Bartoli Donida MiotII; Hélio Amante MiotIII; Mariângela Esther Alencar MarquesIV

IMédica patologista; doutoranda em Patologia pelo Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (FMB/UNESP); professora do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Presidente Prudente da Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE)
IIDoutora em Patologia; dermatologista do Departamento de Dermatologia da FMB/UNESP
IIIProfessor-assistente-doutor do Departamento de Dermatologia da FMB/UNESP
IVProfessora adjunta do Departamento de Patologia da FMB/UNESP

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

O vitiligo é uma doença de pele freqüente que acomete 1% da população e é caracterizada por máculas despigmentadas conseqüentes à perda progressiva e localizada dos melanócitos da epiderme. Na maioria dos pacientes, o diagnóstico é feito por exame clínico. A biópsia da pele é realizada quando há necessidade de diagnóstico diferencial com doenças hipocromiantes. O diagnóstico histopatológico de vitiligo é difícil nos preparados corados por hematoxilina e eosina (HE). Há poucos estudos sobre a melhoria da qualidade diagnóstica no vitiligo.
OBJETIVO: Avaliar a utilidade dos marcadores imuno-histoquímicos proteína S-100, human melanoma black-45 (HMB-45) e Melan-A para o diagnóstico precoce em casos clinicamente suspeitos ou duvidosos de vitiligo. Material e métodos: Lâminas histológicas de biópsias de pele sã e lesada de 10 pacientes com suspeita clínica de vitiligo coradas pelos métodos de HE, proteína S-100, HMB-45 e Melan-A. Utilizou-se contracoloração com Giemsa como modificação técnica para diferenciar a melanina da imunomarcação.
RESULTADOS: Seis casos, com manifestação clínica recente, apresentaram infiltrado linfocitário, do tipo dermatite de interface, na pele lesada na HE. As colorações por S-100, HMB-45 e Melan-A marcaram os melanócitos da camada basal da pele sã, e a proteína S-100 evidenciou as células de Langerhans. Na pele lesada, os melanócitos estavam ausentes ou diminuídos quando comparados com a pele normal. A proteína S-100 demonstrou maior número de células de Langerhans, o que é característico das lesões de vitiligo.
CONCLUSÃO: A imuno-histoquímica pode ser utilizada como método auxiliar no diagnóstico dos casos duvidosos de vitiligo.

Unitermos: Vitiligo, Hipomelanose cutânea, Imuno-histoquímica, Diagnóstico, Melan-A


ABSTRACT

Vitiligo is a frequent skin disease that affects 1% of the population. It presents depigmented macules resulting from a gradual loss of melanocytes in the epidermis. In most cases, the diagnosis is made by clinical examination. Skin biopsies are performed when it is necessary to compare it with other hypomelanosis. Histopathological diagnosis of vitiligo is often difficult in hematoxylin-eosin (H&E) stained sections. There are a few studies on the improvement of diagnostic quality in vitiligo.
OBJECTIVE: To evaluate the use of immunohistochemical markers, such as S-100 protein, human melanoma black-45 (HMB-45) and Melan-A, in the early diagnosis of clinically suspected or doubtful cases of vitiligo. Materials and methods: Histological sections of biopsies from healthy and affected skin areas from 10 patients clinically suspected of vitiligo. The samples were stained with H&E, S-100 protein, HMB-45 and Melan-A methods. Counterstaining with Giemsa was applied as a technical modification to differentiate melanin from immunolabelling.
RESULTS: Six cases with recent clinical manifestation showed lymphocyte infiltrates, such as interface dermatitis, in the affected skin in the H&E staining technique. S-100 protein, HMB-45 and Melan-A staining marked the basal layer melanocytes of the healthy skin and S-100 protein antigen evidenced Langerhans cells. Melanocytes were absent or less frequent in affected skin areas in comparison with normal skin. S-100 protein showed a larger number of Langerhans cells, what is a common feature of vitiligo lesions. Conclusion: Immunohistochemistry may be used as an auxiliary technique for the diagnosis of suspected vitiligo cases.

Key words: Vitiligo, Cutaneous hypomelanosis, Immunohistochemistry, Diagnosis, Melan-A


 

 

Introdução

O vitiligo é uma doença de pele relativamente freqüente que acomete 1% a 4% da população em geral, sem predileção por sexo ou raça, caracterizada por máculas hipo ou acrômicas como conseqüência da perda local de melanócitos da camada basal da epiderme.

Tem provável causa auto-imune, com presença de anticorpos-anti-Melan A (MART1) específicos(11, 14, 16, 20) e predisposição genética associada à suscetibilidade auto-imune localizada no lócus-1 (A1S1) no cromossomo 1(8). Corroborando essa hipótese está o fato de o vitiligo estar associado, em muitos casos, a uma série de doenças auto-imunes, como alopecia areata, diabetes mellitus (DM), anemia perniciosa e tireoidite de Hashimoto(6).

Na maioria dos pacientes com vitiligo, o diagnóstico é feito por exame clínico seguido de análise da área despigmentada sob a luz de Wood. Biópsias de pele para o diagnóstico de vitiligo são realizadas nos casos em que há necessidade de se excluírem outras doenças em que ocorre hipomelanose, como líquen escleroso, hanseníase, pitiríase alba, sarcoidose, lúpus eritematoso vitiligóide, entre outras(4, 6, 13).

A coloração de Fontana-Masson (nitrato de prata amoniatado) demonstra a presença de grânulos de melanina no citoplasma das células, e não a presença de melanócitos. Várias doenças hipocromiantes de pele, como líquen escleroso e pitiríase alba, apresentam diminuição de melanina nos queratinócitos da camada basal, podendo ser confundidas com vitiligo, já que estes também apresentam infiltrado linfocitário dérmico, porém não demonstram redução significativa de melanócitos(4).

O vitiligo tem grande número de opções terapêuticas, cuja resposta depende da distribuição das lesões hipopigmentadas (localizada ou generalizada), do estado de evolução da doença (ativa ou estável) e do local afetado(5). Quanto mais precoces forem o diagnóstico e o tratamento, melhor será a resposta e maiores serão as chances de impedir a evolução da doença(5, 22, 23).

O objetivo do presente estudo foi avaliar a utilidade dos marcadores imuno-histoquímicos Melan-A, human melanoma black-45 (HMB-45) e proteína S-100 para o diagnóstico precoce de vitiligo em casos clinicamente duvidosos e com achados histológicos pouco característicos dessa patologia.

 

Material e métodos

Foram incluídos no presente trabalho 10 casos de suspeita de vitiligo dos arquivos do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (FMB/UNESP) e do Laboratório de Anatomia Patológica da Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE). Seis casos apresentavam biópsias distintas de pele sã e pele lesada e quatro, biópsias da transição de pele sã para lesada.

A distribuição dos pacientes quanto a idade, sexo e local da biópsia está sumarizada na Tabela 1.

 

 

Todos os tecidos foram fixados em formalina, incluídos em parafina e corados com hematoxilina e eosina (HE) para o diagnóstico histopatológico. Secções histológicas adicionais foram realizadas para as colorações imuno-histoquímicas.

A coloração imuno-histoquímica foi feita em cortes histológicos de 4 µm de espessura dispostos em lâminas histológicas previamente tratadas com o aderente poli-D-lisina, seguindo a técnica do ABC brevemente descrita a seguir. Foi feita a desparafinização em xilol seguida de hidratação em solução aquosa de álcool etílico e lavagem com água. Após o bloqueio da peroxidase endógena com água oxigenada a 35 por 10 minutos, os cortes histológicos foram colocados em solução de ácido cítrico a 0,001 M, pH 6, e submetidos à temperatura de 121ºC em ambiente de microondas por 15 minutos para a recuperação antigênica. Após descanso de 20 minutos, incubaram-se os anticorpos primários Melan-A (clone A103, Dako Corporation SA) na titulação 1:100, HMB-45 (clone HMB-45, Dako Corporation SA) na titulação 1:40 e proteína S-100 (policlonal, Dako Corporation SA) na titulação 1:2.500, por 18 horas a 4ºC em câmara úmida. Depois da lavagem das lâminas em solução salina tamponada, foram adicionados os reagentes secundário (Biotinilado anti-mouse Ba 2000 - Vector) e terciário (ABC PK 6100 - Vector), incubando-os por 60 e 45 minutos, respectivamente. A reação foi revelada com DAB (Sigma Co., S Louis, EUA) por 5 minutos e contracorada com Giemsa(18). Como controle negativo, omitiu-se o anticorpo primário.

As lâminas coradas por HE, Melan-A, HMB-45 e proteína S-100 foram examinadas ao microscópio ótico comum por dois autores (G. A. N. e M. E. A. M.).

Um esquema de escore semiquantitativo foi usado para descrever a coloração imuno-histoquímica observada. Os citoplasmas das células são positivos ou negativos para Melan-A, HMB-45 e proteína S-100. A porcentagem de positividade de melanócitos corados foi quantificada e dividida em ausente, raras células e normal, e a de células de Langerhans, em normal, 1+ (uma vez mais que o normal), 2+ (duas vezes mais que o normal) e 3+ (três vezes mais que o normal).

A distribuição dos escores foi comparada pareadamente entre os grupos pelo teste de Wilcoxon, sendo considerados significativos valores de p < 0,05.

 

Resultados

Apenas os casos com evolução mais recente apresentaram infiltrado linfocitário na pele lesada, representado por dermatites de interface, perivascular e liquenóide (Figura 1). Desses, três casos apresentavam também discreto infiltrado linfocitário na derme da pele sã (Tabela 2).

 

 

Na pele sã, a marcação por HMB-45 e Melan-A evidenciou melanócitos distribuídos normalmente na camada basal, apresentando grande número de processos dendríticos (Figuras 2 e 3). Na pele lesada, em dois casos o marcador HMB-45 mostrou a presença de raros melanócitos, enquanto o Melan-A evidenciou ausência destes (casos 2 e 4). Em um caso (caso 7), o HMB-45 mostrou número semelhante de melanócitos ao da pele sã, porém o Melan-A exibiu quantidade diminuída destes, além de ausência de projeções dendríticas e volume celular diminuído (Tabela 2).

 

 

 

 

Nos demais casos, ambos os marcadores evidenciaram a ausência de melanócitos na pele lesada.

A proteína S-100 demonstrou aumento de duas vezes o normal de células dendríticas na epiderme na maioria das biópsias de pele lesada e aumento de três vezes o normal em três casos (casos 2, 6 e 10), os quais apresentavam infiltrado linfocitário mais exuberante na derme. Um caso (caso 4) apresentou aumento de células dendríticas coradas pela proteína S-100 de duas vezes o normal tanto na pele sã quanto na lesada. No restante dos casos, a pele sã não mostrou alterações no número de células imunomarcadas por esta proteína (Tabela 2 e Figura 4).

 

 

Os três marcadores demonstraram diferença estatisticamente significativa entre as amostras (p < 0,05).

 

Discussão

Doenças cutâneas hipomelanóticas são alterações pigmentares caracterizadas pela redução do conteúdo de melanina, o que resulta em clareamento da pele. O estabelecimento do diagnóstico correto para hipomelanose cutânea requer boa história, exame físico detalhado, usando técnicas especiais como a luz de Wood, e, em alguns casos, biópsia da pele lesada e sã(12). Entre os diagnósticos diferenciais das lesões hipomelanóticas cutâneas temos:

a) líquen escleroso: clinicamente se manifesta com pápulas hipopigmentadas que se coalescem e formam placas, predominantemente na região genital(2, 4); histologicamente, apresenta esclerose dérmica patognomônica associada a infiltrado liquenóide, e a leucodermia parece estar mais associada à diminuição de produção de melanina do que à perda de melanócitos, pois a imuno-histoquímica mostra que somente raros casos têm perda significativa de melanócitos como observado no vitiligo(4);

b) lúpus eritematoso vitiligóide: máculas atróficas hipocrômicas ou acrômicas podem ser observadas, especialmente nas formas discóide ou subaguda; no exame anatomopatológico observam-se hiperceratose com formação de "rolhas" córneas, atrofia da epiderme, espessamento e tortuosidade da membrana basal, infiltrado liquenóide ao longo da junção dermoepidérmica e ao redor dos folículos pilosos, extravasamento de eritrócitos e depósitos de mucina intersticial. E no estudo imuno-histoquímico é observada perda parcial de melanócitos(19);

c) pitiríase alba: apresenta-se como área hipocrômica circinada ou oval, com descamação fina superficial, predominantemente na face e em indivíduos de idade pré-escolar ou escolar; a histologia mostra melanófagos na derme em meio a infiltrado linfocitário e agressão da junção dermoepidérmica, não sendo observada perda de melanócitos à imuno-histoquímica(21);

d) hanseníase: manifesta-se como mácula hipocrômica, hipoestésica ou anestésica, caracterizada por inflamação granulomatosa da derme, com presença de bacilos álcool-ácido-resistentes detectados pela coloração de Fite-Faraco(17);

e) sarcoidose: clinicamente se manifesta como pápulas, comumente na face, que podem ser hipocrômicas; e na biópsia são observados granulomas não-caseosos(7).

A alteração mais importante do vitiligo descrita à microscopia ótica é a perda parcial ou completa de melanina como resultado da perda de melanócitos. Outras alterações também podem ser observadas, como dermatite de interface com infiltrado linfocitário na derme superficial(13). Estas alterações são mais proeminentes no vitiligo ativo do que no estável(1, 6). Nossos achados são semelhantes aos descritos na literatura, onde somente nos casos com evolução recente observou-se infiltrado inflamatório.

Os casos que apresentavam discreto infiltrado linfocitário na pele sã foram aqueles em que a biópsia foi realizada na transição da pele sã para a lesada, sugerindo um início de comprometimento da pele adjacente.

Alguns autores acreditam que melanócitos permaneçam no vitiligo, mas sem atividade melanogênica(4, 10, 15, 19), porém Montes et al.(13), por microscopia eletrônica, e Le Poole et al.(6), por imuno-histoquímica, demonstraram ausência de melanócitos nas áreas despigmentadas do vitiligo. Em nosso estudo, o caso 3 mostra na pele lesada células localizadas na camada basal da epiderme lembrando melanócitos, porém não imunomarcadas pelo HMB-45 (Figura 2B) nem pelo Melan-A; acreditamos que essas células correspondam a melanócitos, porém apoptóticos, e por isso não apresentam imunomarcação.

Bhawan(3) mostrou que o anticorpo Mel-5, usado em imuno-histoquímica, poderia ser empregado na avaliação de lesões pigmentadas da pele, bem como de biópsias de pacientes com vitiligo, alteração pigmentar pós-inflamatória e lesões melanocíticas regredidas ou em regressão, porém este anticorpo marca somente melanócitos na epiderme e também reage com o endotélio na derme(9).

O estudo de Carlson et al.(4) mostrou que o marcador imuno-histoquímico Melan-A, proteína específica dos melanócitos e relacionada com o melanossoma, apresenta desempenho superior ao HMB-45 para identificação de melanócitos, uma vez que o HMB-45, indicador da expressão de uma proteína que mostra a presença de melanossomas nos estágios I e II e melanogênese ativa, marca melanócitos com melanogênese funcionante, sendo que sua negatividade não significa ausência de melanócitos.

Em nosso estudo, o anticorpo Melan-A foi mais eficaz para determinar a ausência de melanócitos, pois nos casos em que o marcador HMB-45 identificou melanócitos, o Melan-A mostrou sua ausência ou diminuição, além de redução do volume celular e ausência de dendritos, parecendo ser mesmo um melhor marcador para o diagnóstico de vitiligo. Embora ambos os marcadores não corem todos os melanócitos presentes na amostra, raramente outras doenças hipocromiantes, como líquen escleroso ou lúpus eritematoso vitiligóide, os principais diagnósticos diferenciais histopatológicos do vitiligo, levam a uma perda tão grande de melanócitos como observado neste último.

O vitiligo não é somente uma desordem de melanócitos, mas também envolve outras células, como queratinócitos e células de Langerhans, da epiderme e do epitélio folicular(15).

Montes et al.(13) demonstraram aumento de células de Langerhans nas áreas despigmentados do vitiligo, e Le Poole et al.(9) identificaram que mesmo as células coradas pela proteína S-100 na camada basal destas áreas tratavam-se de células de Langerhans.

No presente trabalho observamos aumento significativo das células de Langerhans nas áreas despigmentadas em relação à pele normal, com exceção de um caso que apresentava aumento semelhante destas células nas duas áreas, corroborando os dados de literatura. Três casos com infiltrado linfocitário dérmico mais intenso foram os que apresentaram maior concentração de células de Langerhans (3+) na pele lesada, talvez por maior estímulo imunológico na área.

 

Conclusão

Não somente pelo aspecto estético, mas também pela chance de estar associado a outras doenças auto-imunes, que necessitem ser investigadas, o diagnóstico correto de vitiligo é importante, e a imuno-histoquímica pode ser ferramenta auxiliar nos casos duvidosos em que há necessidade de se afastarem outros diagnósticos diferenciais.

A correta avaliação das alterações inflamatórias e da imunomarcação dos melanócitos só é possível comparando-se a pele sã com a lesada. Assim, a biópsia de pele sã é fundamental para o diagnóstico de vitiligo, principalmente em seus estágios iniciais.

Novos estudos com casuística maior são necessários para que possamos definir de forma inequívoca a aplicação da imuno-histoquímica no diagnóstico diferencial precoce do vitiligo. Maior número de casos permitirá também verificar se há relação entre o local da lesão e as alterações imuno-histoquímicas, podendo ajudar a elucidar a causa da diferença da resposta terapêutica dependendo do local afetado.

 

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Endereço para correspondência
Gisele Alborghetti Nai
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e-mail: patologia@unoeste.br

Primeira submissão em 07/07/08
Última submissão em 20/10/08
Aceito para publicação em 20/10/08
Publicado em 20/10/08

 

 

Trabalho apresentado no XXVI Congresso Brasileiro de Patologia, realizado na cidade de Bento Gonçalves (RS) em novembro de 2007.