Análise comparativa da imunoexpressão da proteína p53 (clones DO-7 e PAb-240) em carcinomas de células escamosas intrabucais e labiais

Comparative analysis of p53 protein immunostaining (antibodies DO-7 and PAb-240) in oral cavity and lip squamous cell carcinomas

PATOLOGIA

ARTIGO ORIGINAL

Análise comparativa da imunoexpressão da proteína p53 (clones DO-7 e PAb-240) em carcinomas de células escamosas intrabucais e labiais

Comparative analysis of p53 protein immunostaining (antibodies DO-7 and PAb-240) in oral cavity and lip squamous cell carcinomas

José de Assis Silva Júnior^I; Vagner Gonçalves Bernardo^I; Karen Zavaro Balassiano^II; Flávia Dantas Soares^I; Eliene Carvalho da Fonseca^III; Licínio Esmeraldo da Silva^IV; Simone de Queiroz Chaves Lourenço^V

^IMestre em Patologia pela Universidade Federal Fluminense (UFF)

^IIDoutora em Patologia pela Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo (FOB/USP)

^IIIMestre em Biologia Celular e Molecular pelo Instituto Oswaldo Cruz (IOC); professora adjunta do Departamento de Patologia da UFF

^IVMestre em Sistema de Gestão pela UFF; professor adjunto do Departamento de Estatística da UFF

^VDoutora em Patologia pela Faculdade de Odontologia de Bauru (FOB/USP); professora adjunta do Departamento de Patologia da UFF

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

INTRODUÇÃO: A carcinogênese caracteriza-se como um processo multifatorial, e a inativação da proteína p53 é uma alteração genética comumente observada nos carcinomas de células escamosas de boca (CCEB).

OBJETIVO: Analisar e comparar a imunoexpressão da proteína p53, por meio dos clones DO-7 e PAb-240, em CCEB com localização intrabucal e em lábio inferior.

MATERIAL E MÉTODOS: Foram selecionados 40 casos de CCEB, sendo 20 de localização intrabucal e 20 em lábio inferior. Foi realizado um estudo imuno-histoquímico utilizando os anticorpos anti-p53 clone DO-7 e PAb-240. A imunoquantificação foi realizada por meio de análise digital de imagem, e os resultados, submetidos a tratamentos estatísticos.

RESULTADOS: A imunoexpressão da proteína p53 foi verificada com o anticorpo DO-7 em 13 casos (65%) de carcinoma intrabucal e em 19 (95%) de carcinoma de lábio inferior. Imunorreatividade para o anticorpo PAb-240 foi observada em 9 casos (45%) de lesões intrabucais e em 15 (75%) localizados em lábio inferior. Não foram observadas, segundo o teste de Mann-Whitney, diferenças estatisticamente significativas (p > 0,05) na expressão da proteína p53 entre as duas localizações estudadas, independentemente do anticorpo avaliado. Foram identificadas, pelo teste de Wilcoxon, diferenças estatisticamente significativas entre a expressão dos clones DO-7 e PAb-240 em cada um dos grupos analisados (valor p = 0,013 - lábio inferior; valor p = 0,016 - intrabucal).

CONCLUSÕES: A expressão da proteína p53 observada nos CCEB, com localizações intrabucais e labiais, sugere a ocorrência de mutações no gene TP53. As diferenças quantitativas obtidas entre os anticorpos estudados, independentemente da localização das lesões, refletem uma especificidade distinta entre os clones DO-7 e PAb-240. O desenvolvimento de mais estudos será fundamental para estabelecer o anticorpo mais adequado para proteína p53 em CCEB.

Unitermos: Carcinoma de células escamosas; Câncer oral; Imuno-histoquímica; Proteína supressora de tumor p53

ABSTRACT

BACKGROUND: Carcinogenesis is a multifactorial process and inactivation of p53 protein is a genetic change commonly observed in oral squamous cell carcinomas (OSCC).

OBJECTIVES: To analyze and compare the expression of p53 protein through antibodies DO-7 and PAb-240 in OSCC samples located in the oral cavity and lower lip.

MATERIAL AND METHODS: Forty cases of OSCC were selected and divided into oral cavity and lower lip groups (20 cases each). Immunohistochemical technique was performed using antibodies DO-7 and PAb-240. Quantification of the cases was performed through digital image analysis and underwent specific statistical treatments.

RESULTS: Expression of p53 protein was verified with DO-7 antibody in 13 cases (65%) of oral cavity carcinomas and in 19 cases (95%) of lower lip carcinoma. PAb-240 positivity was detected in 9 cases (45%) of oral cavity lesions and in 15 cases (75%) located in the lower lip. According to Mann-Whitney test, there were no statistically significant differences between the expressions of p53 protein in both groups, regardless of the antibody used. According to Wilcoxon test, there were statistically significant differences between the expression of DO-7 antibody and PAb-240 in each of the analyzed groups (p-value = 0.013; lower lip p-value = 0.016 - oral cavity).

CONCLUSIONS: The expression of p53 protein was observed both in the oral cavity and lip OSCC, which suggests the occurrence of mutations in TP53 gene. The quantitative differences between the antibodies studied, regardless of the site of the lesions, reflect different specificity between clones DO-7 and PAb-240. Further studies are required to establish the best antibody for p53 protein in oral squamous cell carcinomas.

Keywords: Squamous cell carcinoma; Oral cancer; Immunohistochemistry; Tumor suppressor protein p53

Introdução

O câncer de boca representa cerca de 3% de todas as neoplasias malignas nos homens e 2% nas mulheres, segundo a Sociedade Americana de Câncer (SAC)⁽³⁰⁾. No Brasil, está entre os dez tipos de câncer mais frequentes, constituindo-se em um problema de saúde pública. A estimativa de incidência desse tipo de câncer para 2008 aponta esse tumor como o sexto mais comum entre os homens (com 10.380 casos estimados) e o sétimo entre as mulheres (com 3.780 casos estimados)⁽²²⁾.

O carcinoma de células escamosas (CCE) compreende cerca de 90% de todas as neoplasias malignas da boca, sendo a língua, o lábio inferior e o assoalho bucal os sítios frequentemente afetados^{(10, 20, 30)}. O local de acometimento desses tumores deve ser considerado um importante indicador de prognóstico, uma vez que os localizados em lábio inferior exibem melhores prognósticos, quando comparado com as demais localizações intrabucais^{(2, 9)}. Tal fato pode estar associado à exposição a fatores etiológicos distintos; os localizados em lábio estão estritamente relacionados com os níveis de exposição à radiação ultravioleta, enquanto aqueles localizados em regiões intrabucais estão frequentemente associados ao tabagismo e ao etilismo^{(29, 30, 32)}.

O gene supressor de tumor TP53, descrito primeiramente em 1979^{(7, 24, 25)}, codifica a proteína p53, que age como fator de transcrição com importantes funções na regulação do ciclo celular e indução da apoptose, em decorrência a danos no DNA^{(4, 31, 46)}. Em tecidos normais, a proteína selvagem está expressa em baixas concentrações, fato que pode ser justificado pela sua meia-vida curta, sendo sua presença raramente detectada pela técnica de imuno-histoquímica^{(17, 31)}.

Mutações no gene TP53 são alterações moleculares comuns nos CCE^{(17, 31, 47)}; no entanto, estudos têm demonstrado um padrão de mutação distinto associado a fatores etiológicos específicos^{(32, 35)}. Consequentemente, a localização do câncer de boca pode determinar diferentes padrões de mutação, como o encontrado nos CCE de lábio e intrabucal⁽³²⁾. Normalmente, essas mutações estão localizadas em domínios específicos da proteína p53⁽³⁷⁾, ocorrendo com maior frequência no domínio hidrofóbico de ligação ao DNA^{(8, 43)}. Apenas 5% das mutações acometem as regiões N-terminal e C-terminal e, quando ocorrem, podem não alterar a conformação da proteína^{(8, 14)}.

Diferentes anticorpos monoclonais estão disponíveis para avaliação da expressão da proteína p53 na espécie humana, representados por clones específicos que reconhecem diferentes epítopos localizados entre as quatro regiões funcionais principais da proteína p53^{(3, 16, 27, 45)}, sendo a maioria dos anticorpos direcionada a epítopos situados na região N-terminal da proteína. Para investigar sua estrutura funcional, assim como estabelecer comparações entre a proteína selvagem e a mutante⁽⁴⁸⁾, a escolha correta do anticorpo pode definir a expressão da proteína nos tecidos, assegurando a sensibilidade e reprodutibilidade dos resultados⁽⁴²⁾.

Clones como o DO-7 são capazes de se ligarem na conformação nativa e mutada da proteína, enquanto outros, como o PAb-240, reagem somente com a proteína p53 mutante. O anticorpo PAb-240 apresenta especificidade na identificação de uma sequência específica localizada na região de ligação do DNA⁽⁴⁰⁾, frequentemente alterada nas neoplasias malignas^{(8, 43)}, incluindo as que acometem a boca^{(11, 17, 47)}.

Considerando que a maioria das investigações utiliza o anticorpo clone DO-7, em que a imunopositividade pode refletir um aumento da expressão da proteína p53 nativa e/ou mutada e que outras sequências da estrutura proteica são mais associadas à presença de mutações nas neoplasias malignas (como a identificada pelo clone PAb-240), justifica-se a realização de mais estudos. Este trabalho teve como objetivo analisar e comparar a imunoexpressão da proteína p53, por meio dos clones DO-7 e PAb-240, em carcinomas de células escamosas de boca (CCEB), com localização intrabucal e em lábio inferior.

Material e métodos

Amostra

Foram selecionados 40 casos de CCEB, provenientes de biópsias incisionais, diagnosticados no arquivo do Serviço de Anatomia Patológica (SAP) do Hospital Universitário Antônio Pedro da Universidade Federal Fluminense (HUAP/UFF). A amostra foi dividida em dois grupos de acordo com a localização: intrabucal (grupo I) e em lábio inferior (grupo II). A partir dos laudos histopatológicos, foram coletados os seguintes dados clínicos: sexo, idade e localização anatômica. O critério de seleção da amostra foi de material exibindo histopatologia característica, livre de artefatos, bem preservado e com quantidade suficiente para realização de recortes. As amostras coradas pela técnica de hematoxilina e eosina (HE) foram avaliadas segundo o grau de diferenciação determinado pela Organização Mundial da Saúde (OMS)⁽¹⁾.

Técnica de imuno-histoquímica

A técnica imuno-histoquímica foi realizada no Laboratório de Imuno-histoquímica do SAP-HUAP/UFF para detecção da proteína p53, utilizando os anticorpos monoclonais obtidos de camundongo anti-p53 clone DO-7 (DAKOCytomation - EUA, classe IgG2b, 1:200, código M7001) e anti-p53 clone PAb-240 (DAKOCytomation - EUA, classe IgG1, 1:300, código M3566), por meio da técnica da estreptavidina-biotina-imunoperoxidase. Para cada bloco, foram realizados cortes histológicos seriados de 4 µm de espessura, estendidos em lâminas previamente tratadas com substância adesiva (3-aminopropil-trietoxi silano, SIGMA - USA). Os cortes obtidos foram desparafinizados em xilol e reidratados em soluções de álcool etílico.

O bloqueio da peroxidase endógena foi obtido por meio da imersão das lâminas em solução de peróxido de hidrogênio (P.A.) a 3% diluído em água destilada durante 30 minutos. Para a recuperação antigênica em banho-maria, utilizou-se a solução comercial da DAKO de pH 6 (Target antigen retrieval solution 10X concentrate, código S1699 DAKOCytomation - EUA) para o anticorpo anti-p53 clone DO-7 e solução comercial da DAKO de pH 9,9 (Target antigen retrieval solution High pH 10X concentrate, código S3307 DAKOCytomation - EUA) para o anticorpo monoclonal anti-p53 clone PAb-240. Esse protocolo foi estabelecido após inúmeros testes realizados previamente.

Posteriormente, as secções foram incubadas com anticorpo primário em overnight a 4°C. Finalizado o tempo de incubação com os anticorpos primários, os cortes foram imersos em solução tampão TBS-T (800 ml de ácido clorídrico 1N; 116 g de NaCl; 122 g de hidroxil-metil-aminometano, 10 ml de Tween 20; completando para 20 l de água destilada; 0,05M/pH 7,4) e submetidos à incubação com o complexo estreptavidina-biotina (LSAB + System, HRP, código K0690, DAKOCytomation - EUA). O anticorpo secundário biotinilado foi aplicado sobre os cortes, permanecendo por 30 minutos em câmara umidificadora à temperatura ambiente, seguido por dois banhos em solução tampão TBS-T, cada um por cinco minutos. Em sequência, aplicou-se a estreptavidina sobre os cortes, aguardando-se mais 30 minutos nas mesmas condições. Posteriormente, as lâminas foram lavadas em solução tampão TBS-T e reveladas com o substrato cromógeno diaminobenzidina (Liquid DAB + substrate, Chromogen System, código K3468, DAKOCytomation - EUA). Após essa etapa, as lâminas foram lavadas com água destilada e contracoradas com hematoxilina de Harris. Cortes de um caso de CCEB previamente positivo para os anticorpos empregados foram utilizados como controle positivo. O controle negativo foi obtido pela substituição do anticorpo primário pela mesma solução usada para diluir os anticorpos (Antibody Diluent with background Reducing components, código S3022 DAKOCytomation - EUA), conforme procedimento imuno-histoquímico usual do referido laboratório.

Análise quantitativa

A quantificação da marcação obtida pela técnica de imuno-histoquímica foi realizada por meio de análise digital de imagem, usando a mesma metodologia empregada no trabalho de Camisasca et al.⁽⁵⁾, com o auxílio do Programa Image ProPlus 4.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, EUA). De cada caso, um total de cinco campos foi capturado, selecionando-se áreas de maior imunopositividade e utilizando-se a objetiva de 20x. O índice de área foi determinado pela razão entre a área imunopositiva quantificada e a área tumoral total previamente delimitada.

Análise estatística

Os dados dos índices de área foram descritos por meio dos parâmetros média (± desvio padrão) e número de casos. Comparação entre os índices de área, tanto pelo clone DO-7 quanto pelo PAb-240 nos dois grupos avaliados, foi realizada pelo teste de Mann-Whitney, e a comparação entre os índices de área de cada marcador foi realizada pelo teste de Wilcoxon. O nível de significância das decisões estatísticas foi de 0,05 (5%) e a análise estatística foi apoiada pelo programa Statistical Package of Social Science (SPSS) versão 10.0.

Resultados

O perfil da amostra, de acordo com as variáveis gênero, idade, localização e gradação histopatológica, está descrito nas Tabelas 1 e 2.

Foi observada expressão da proteína p53 no núcleo das células epiteliais tumorais (coloração acastanhada), para os anticorpos clones DO-7 e PAb-240 (Figuras 1 e 2).

Ao analisar a amostra de acordo com a sua localização, foi observada imunopositividade em 13 casos (65%) dos carcinomas intrabucais e em 19 casos (95%) nos carcinomas de lábio inferior com o anticorpo anti-p53 clone DO-7. Para o anticorpo anti-p53 clone PAb-240 foi observada marcação positiva em 9 casos (45%) das lesões intrabucais e 15 casos (75%) localizados em lábio inferior (Tabela 3).

Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas (p > 0,05), por meio do teste de Mann-Whitney, entre a expressão da proteína p53 nos casos de localização no lábio inferior e intrabucal, tanto para o clone DO-7 (U = 173,5; valor p = 0,478), quanto para o PAb-240 (U = 144,5; valor p = 0,134).

Ao comparar a expressão da proteína p53 entre os clones DO-7 e o PAb-240, o teste de Wilcoxon evidenciou diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) tanto em lábio inferior (Z = 2,495; p = 0,013) quanto em localização intrabucal (Z = 2,411; p = 0,016), mostrando uma maior expressão do clone DO-7, tanto nos casos de CCE intrabucal quanto nos casos de CCE de lábio.

Discussão

O gene TP53 é considerado um dos principais genes associados à supressão tumoral por desempenhar importantes funções nos processos fisiológicos e patológicos^{(38, 44, 46)}. Apresenta-se comumente mutado em diversas neoplasias malignas, incluindo as que acometem a boca^{(11, 37, 47)}.

Diversas são as técnicas que estão disponíveis para o estudo de alterações na molécula p53, incluindo a análise de mutação desse gene, assim como a expressão da proteína⁽³¹⁾. Mutações no gene TP53 podem alterar a função da proteína codificada, acarretando um aumento na sua meia-vida biológica (normalmente curta), podendo assim ser identificada pela técnica da imuno-histoquímica^{(17, 31)}. Essa técnica tem grande aplicação na rotina diagnóstica e na pesquisa científica. Inúmeros estudos utilizam essa metodologia para avaliar a expressão da proteína p53 no CCEB em busca por biomarcadores prognósticos^{(2, 6, 12, 23, 33, 34)}.

A técnica da imuno-histoquímica pode fornecer dados limitados quando se deseja avaliar a expressão da proteína p53 na carcinogênese bucal, apresentando uma discordância de aproximadamente 40% quando comparada à técnica de sequenciamento do DNA^{(26, 41)}. O acúmulo dessa proteína pode ocorrer devido a outros fatores, como associação com proteínas virais, falhas na sua degradação, ou até mesmo ser identificada em sua função biológica normal, gerando resultados falso-positivos^{(13, 31)}. Sendo assim, considerações técnicas, como escolha do anticorpo, fixação do tecido e protocolo de recuperação antigênica, podem interferir no padrão da imunopositividade, influenciando os resultados obtidos⁽²⁸⁾.

O tabaco e o álcool estão bem estabelecidos como fatores etiológicos exógenos no desenvolvimento e na progressão dos carcinomas intrabucais; diferentemente, os carcinomas localizados em lábio inferior recebem bastante influência da exposição à radiação solar^{(29, 30, 32)}. Dessa forma, a amostra desse estudo foi dividida em dois grupos, de acordo com sua localização (intrabucal e lábio inferior).

No presente estudo, observou-se a expressão da proteína p53 nos carcinomas com localização em lábio inferior em 19 casos (95%) quando utilizado o clone DO-7 e em 15 casos (75%) para o PAb-240. Em um estudo conduzido por Horta et al.⁽²¹⁾, foi avaliada uma série de 21 carcinomas de lábio, obtendo-se expressão positiva da proteína p53, verificada pelo clone DO-1 em 85,7% dos casos avaliados. Em uma análise de 79 carcinomas de lábio, Garcia-Montesinos-Perea et al. ⁽¹⁶⁾ verificaram imunopositividade para a proteína p53 por meio do clone DO-7 em 70,6% dos casos. Em relação aos casos com localização intrabucal, foi observado nesse estudo expressão positiva da proteína p53 em 13 casos (65%) para o anticorpo DO-7 e em 9 casos (45%), para o PAb-240. Cruz et al.⁽¹¹⁾, em uma análise de carcinomas intrabucais, verificaram a expressão da proteína p53 em 33 casos (60% dos avaliados), utilizando o anticorpo DO-7. Estudos realizados por Schoelch et al.⁽³⁶⁾, em uma amostra de 35 casos de CCEB intrabucais, observaram imunopositividade para p53, utilizando o anticorpo DO-7 em 18 casos (51,4%). Quando comparados aos trabalhos similares descritos na literatura, os resultados imuno-histoquímicos obtidos nesse estudo mostraram percentuais de imunopositividade semelhantes, embora haja divergências no perfil da amostras, nos protocolos imuno-histoquímicos, nos anticorpos selecionados e na forma de análise dos resultados obtidos.

A expressão da proteína p53 em ambos os clones avaliados predominou nos casos de carcinomas de lábio inferior (DO-7 - 95%, PAb-240 - 75%) em relação aos intrabucais (DO-7 - 65%, PAb-240 - 45%), porém sem diferença estatisticamente significativa quando os índices de área foram comparados. Com objetivo de avaliar mutações no gene TP53 em câncer de lábio e com localização intrabucal, Ostwald et al.⁽³²⁾ verificaram que a presença e o tipo de mutações desse gene estão associados às diferenças de localização da lesão, estando a radiação solar relacionada com um tipo específico de mutação, com padrão diferente dos CCE intrabucais, em que se observou estreita relação com o tabaco. Dessa maneira, a localização dos tumores que afetam a boca deve ser considerada no estudo da molécula p53. Outro ponto que deve ser valorizado no desenho do estudo e que pode influenciar nos resultados são as condições sociocultural e geográfica da população em análise^{(35, 38)}.

Embora existam diversos trabalhos na literatura que correlacionam a expressão da proteína p53 nos CCEB, a maioria utiliza o anticorpo monoclonal anti-p53 DO-7, que reconhece a proteína em sua conformação selvagem e mutada, identificando um epítopo localizado entre os aminoácidos 21 a 25⁽³⁹⁾. Neste estudo, foram incluídos os clones DO-7 e PAb-240 por reconhecerem domínios específicos e distintos da proteína p53, com a finalidade de avaliar e comparar suas expressões em CCEB. O anticorpo monoclonal PAb-240 reconhece um epítopo altamente conservado entre as espécies, localizado em humanos, entre os aminoácidos 213 a 217⁽⁴⁰⁾ com especificidade somente para a conformação mutada da proteína p53⁽¹⁵⁾.

Ao comparar a expressão da proteína utilizando-se dois marcadores direcionados a diferentes epítopos da proteína p53, foram verificadas diferenças quantitativas de marcação nos anticorpos estudados. A marcação foi mais evidente com o anticorpo DO-7 quando comparado ao PAb-240 (p > 0,05) independentemente do grupo de lesão, o que vai de encontro aos trabalhos de Gonzalez-Moles et al.,⁽¹⁸⁾ e Harlozinska et al.,⁽¹⁹⁾ em estudos desenvolvidos em líquen plano oral e carcinomas de ovário, respectivamente. Jayasurya et al.⁽²³⁾ investigaram a expressão da proteína p53 (clones DO-7 e PAb-240) em 348 tumores malignos da cavidade bucal, verificando que o anticorpo DO-7 mostrou-se mais expresso em intensidade e quantidade quando comparado ao PAb-240. Os resultados do presente estudo em associação aos estudos supracitados confirmam a identificação de sequências diferentes da proteína p53 por esses biomarcadores (clone DO-7 e PAb-240), e esse fato deve ser considerado na análise dos resultados imuno-histoquímicos. Sendo assim, a utilização de anticorpos que identificam a proteína nativa e/ou selvagem pode justificar em parte os resultados conflitantes na análise da imunoexpressão da proteína p53 nos CCEB, comumente observados nos estudos investigados.

Os avanços das técnicas de biologia molecular e a possibilidade de identificação de mutações no gene TP53 impulsionaram estudos com o objetivo de melhor compreender a participação desse gene no desenvolvimento e na progressão dos CCEB. Contudo, como a maioria das mutações encontrada no gene TP53 são mutações do tipo missense⁽³⁷⁾, que ocasionam acúmulo da proteína alterada no núcleo das células, acredita-se que a expressão observada pela imuno-histoquímica seja reflexo das alterações nesse gene. Nesse sentido, o estudo de técnicas de análise de mutação no gene TP53 é necessário para confirmação de resultados obtidos com a técnica imuno-histoquímica, podendo assim determinar os melhores anticorpos a serem empregados e estimar o papel desse biomarcador no CCEB.

Conclusões

A partir dos resultados obtidos no presente estudo, foi possível observar que a expressão da proteína p53 é um evento comumente observado nos CCEB, tanto em localização intrabucal quanto labial, sugerindo a ocorrência de mutações no gene TP53. As diferenças quantitativas obtidas entre os anticorpos estudados, independentemente da localização das lesões, refletem uma especificidade distinta entre os clones DO-7 e PAb-240 em CCEB. O desenvolvimento de mais estudos será fundamental para estabelecer o anticorpo mais adequado para avaliação da proteína p53 em CCEB.

Primeira submissão em 25/04/09

Última submissão em 26/05/09

Aceito para publicação em 10/08/09

Publicado em 20/08/09

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Nov 2009
• Data do Fascículo
  Ago 2009

Histórico

• Aceito
  10 Ago 2009
• Recebido
  25 Abr 2009