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Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial

Print version ISSN 1676-2444

J. Bras. Patol. Med. Lab. vol.46 no.3 Rio de Janeiro June 2010

http://dx.doi.org/10.1590/S1676-24442010000300006 

ARTIGO DE REVISÃO REVIEW ARTICLE

 

Questões atuais relativas à dosagem e à descrição da excreção urinária de albumina

 

Current issues in measurement and report of urinary albumin excretion

 

 

W. Greg MillerI; David E. BrunsII; Glen L. HortinIII, Sverre SandbergIV; Kristin M. AakreIV; Matthew J. McQueenV; Yoshihisa ItohVI; John C. LieskeVII; David W. SeccombeVIII; Graham JonesIX; David M. BunkX; Gary C. CurhanXI; Andrew S. NarvaXII; on behalf of the National Kidney Disease Education Program – IFCC Working Group on Standardization of Albumin in Urine

IDepartment of Pathology, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA
IIDepartment of Pathology, University of Virginia Medical School, Charlottesville, VA
IIIDepartment of Laboratory Medicine, Warren Magnuson Clinical Center, National Institutes of Health, Bethesda, MD
IVLaboratory of Clinical Biochemistry, Haukeland University Hospital and The Norwegian Quality Improvement of Laboratory Services in Primary Care (NOKLUS), Bergen Norway
VHamilton Regional Laboratory Medicine Program, Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada
VIDepartment of Laboratory Medicine, Asahikawa Medical College, Asahikawa, Japan
VIIMayo Clinic Renal Function Laboratory, Department of Laboratory Medicine and Pathology, Mayo Clinic Division of Nephrology and Hypertension, Department of Internal Medicine, Rochester, MN
VIIICanadian External Quality Assessment Laboratory and Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada
IXDepartment of Chemical Pathology, St Vincent's Hospital Sydney, Sydney, Australia
XAnalytical Chemistry Division, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD
XIRenal Division, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA
XIINational Kidney Disease Education Program, National Institute for Diabetes and Digestive Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

ANTECEDENTES: A excreção urinária de albumina indica lesão nos rins e é reconhecida como fator de risco para a progressão das doenças renal e cardiovascular. A dosagem da albumina urinária chama a atenção sobre a necessidade clínica de relatos de resultados precisos e claramente descritos. O National Kidney Disease Education Program e a Federação Internacional de Química Clínica e Medicina Laboratorial (IFCC) reuniram-se para avaliar o estado atual das questões pré-analíticas, analíticas e pós-analíticas que afetam as dosagens da albumina na urina e para identificar as áreas que necessitam de melhorias.
CONTEÚDO: A química da albumina na urina não é completamente compreendida. Diretrizes atuais recomendam a utilização da relação albumina/creatinina (RAC) como substituta para a coleta de amostras cronometradas de urina, frequentemente inadequadas. Os resultados da RAC são afetados pela preparação do paciente, pela hora do dia da coleta das amostras e não é padronizada. Foram relatadas consideráveis diferenças intermétodos para a dosagem tanto de albumina quanto de creatinina, mas a verdade é desconhecida, porque não existem procedimentos de referência para a dosagem de albumina e não há materiais de referência para qualquer um desses analitos na urina. Os intervalos de referência recomendados para a RAC não consideram as grandes diferenças intergrupos na excreção da creatinina (por exemplo, relacionadas com diferenças em idade, sexo e etnia), nem o aumento contínuo no risco relacionado com a excreção de albumina.
DISCUSSÃO: Necessidades clínicas foram identificadas para a padronização de (a) métodos de coleta da urina, (b) dosagens de albumina e de creatinina na urina com base em um sistema de referência completo, (c) relatórios dos resultados dos testes e (d) intervalos de referência para a RAC.


ABSTRACT

BACKGROUND: Urinary excretion of albumin indicates kidney damage and is recognized as a risk factor for progression of kidney disease and cardiovascular disease. The role of urinary albumin measurements has focused attention on the clinical need for accurate and clearly reported results. The National Kidney Disease Education Program and the IFCC convened a conference to assess the current state of preanalytical, analytical, and postanalytical issues affecting urine albumin measurements and to identify areas needing improvement.
CONTENT: The chemistry of albumin in urine is incompletely understood. Current guidelines recommend the use of the albumin/creatinine ratio (ACR) as a surrogate for the error-prone collection of timed urine samples. Although ACR results are affected by patient preparation and time of day of sample collection, neither is standardized. Considerable intermethod differences have been reported for both albumin and creatinine measurement, but trueness is unknown because there are no reference measurement procedures for albumin and no reference materials for either analyte in urine. The recommended reference intervals for the ACR do not take into account the large intergroup differences in creatinine excretion (e.g., related to differences in age, sex, and ethnicity) nor the continuous increase in risk related to albumin excretion.
DISCUSSION: Clinical needs have been identified for standardization of (a) urine collection methods, (b) urine albumin and creatinine measurements based on a complete reference system, (c) reporting of test results, and (d) reference intervals for the ACR.


 

 

Antecedentes

Dosagens de albumina na urina são amplamente utilizadas para identificar e acompanhar pacientes com lesões nos rins. Uma conferência sobre uso clínico e dosagem de albumina na urina foi organizada pelo Laboratory Working Group of the National Kidney Disease Education Program e pela Federação Internacional de Química Clínica e Medicina Laboratorial (IFCC) para analisar as práticas atuais de dosagem de albumina na urina e utilizar os dados obtidos para acompanhamento da doença renal. Os objetivos da conferência foram aumentar a compreensão das questões que devem ser abordadas para permitir a padronização das dosagens e das diretrizes da prática clínica com base na excreção urinária de albumina. Este estudo resume as observações e conclusões dessa conferência.

Historicamente, a albuminúria foi definida em períodos de excreção urinária de albumina por unidade de tempo, normalmente 24 horas. A dificuldade de coletar amostra de urina de 24 h levou à substituição pela dosagem de taxa de excreção de albumina (TEA). Uma substituta comumente utilizada é a relação entre as concentrações urinárias de albumina e creatinina(71). Essas duas opções de dosagens são consideradas neste estudo. Para a relação albumina/creatinina (RAC), amostras aleatórias ou isoladas de urina foram coletadas sem se considerar a hora do dia, sendo citado um intervalo de referência comum tanto para homens quanto para mulheres. A hora do dia afeta os resultados, assim como a maior excreção de creatinina em homens do que em mulheres também afeta o uso da RAC como um substituto da TEA(71). Da mesma forma, a maior excreção de creatinina em negros do que em brancos, a diminuição da excreção com a perda muscular e os efeitos da dieta sobre a excreção de creatinina.

Pesquisa de diretrizes no uso de albumina urinária

Organizações profissionais de vários países emitiram diretrizes de práticas clínicas para o uso de dosagens de albumina na urina. Essas diretrizes não são uniformes nas recomendações relativas a tipo de amostra, tempo de coleta da amostra, unidades, intervalos de referência ou pontos de corte utilizados para a interpretação, nem métodos utilizados para a dosagem de albumina e de creatinina.

A Tabela 1 enumera 10 diretrizes, recomendações e declarações emitidas por sete organizações desde 2002; cinco diretrizes estão relacionadas com diabetes e recomendam testes anuais. As 10 recomendam o uso da RAC, oito sugerem coleta da primeira urina da manhã, sete recomendam coleta de amostra aleatória ou isolada de urina e quatro identificam miligramas por grama ou miligramas por milimole como as unidades de medida para RAC (1 mg/g = 1 µg/mg = 0,113 mg/mmol). Sete mencionam, com diferentes níveis de detalhe, a necessidade de realizar testes de seguimento para confirmar os resultados. Duas declararam, expressamente, que a coleta da urina de 24 h não é necessária, mas uma diretriz lista a coleta de 24 h como o primeiro dos três métodos possíveis de coleta de urina.

Embora a dosagem da RAC seja recomendada, a ausência de métodos reconhecidamente padronizados de coleta de amostras, de dosagem da RAC e de liberação de resultados compromete a utilidade deste teste tanto para a clínica quanto para a pesquisa. Os resultados descritos podem ser em miligramas de albumina por grama (ou µg/mg) ou por milimole de creatinina, e o significado de ambos não é intuitivamente óbvio para não especialistas. Prestadores de saúde podem não compreender o significado clínico da albuminúria e ter dificuldade em interpretar os resultados de forma efetiva (por exemplo, identificar os resultados que indicam um risco aumentado de doença cardiovascular ou progressão da doença renal). Os prestadores podem se confundir com tantas opções de teste para o rim e ficar preocupados que um único ponto de corte, como o tão citado 30 mg/g (30 µg/mg, 3,4 mg/mmol, ou 3,4 g/mol), pode não ser útil para pacientes de todas as idades, sexo e etnias(70, 71). Além disso, a relação entre a excreção de albumina na urina e o aumento de risco cardiovascular ou renal é contínuo, e considerar que todos os valores da RAC abaixo de 30 mg/g são normais, provavelmente, é inadequado(71).

Variáveis pré-analíticas que afetam a taxa de excreção de albumina

A Tabela 2 relaciona importantes fatores pré-analíticos que podem influenciar a excreção de albumina na urina.

Variação biológica intraindivíduo

O conhecimento sobre a variação biológica intraindivíduo é importante para a tomada de decisões sobre quais tipos de amostras devem ser utilizados para a dosagem de albumina na urina, para interpretar um resultado de exame de confirmação após resultado inicial de aumento da concentração e para decidir se a variação na excreção de albumina é de importância clínica ou não.

A Tabela S1 (no complemento de dados que acompanha a versão on-line deste artigo em http://www.clinchem.org/content/vol55/issue1) mostra as estimativas de variabilidade biológica intraindivíduo (CVi) para excreção de albumina de 4%-103%, com o tercil central de 28%-47%. Fatores que influenciaram a diversidade nas estimativas incluem o período de coleta das amostras (dias, semanas, meses), o tipo de amostra de urina utilizada (24 h, cronometrada durante a noite, primeira da manhã, aleatória), o objetivo do estudo, a concentração de albumina na urina, o estado de saúde dos indivíduos e o manuseio e armazenamento pré-analítico das amostras de urina. A maioria dos estudos não descreve, em detalhe suficiente, o modo como a CVi foi calculada, para permitir a compreensão das diferenças.

No entanto, algumas conclusões gerais podem ser extraí­das da Tabela S1. A CVi da RAC tinha o menor valor em 22 dos 30 estudos (73%), para os quais a CVi de excreção de 24 h, as taxas de excreção durante a noite ou as concentrações foram comparadas com a CVi da RAC. A CVi da RAC para a variação do dia a dia nas amostras predominantemente noturnas cronometradas e da manhã é, em geral, inferior à RAC dos intervalos semana a semana ou mês a mês. No entanto, a variação da CVi de diferentes estudos é grande e, provavelmente, devida a diferenças nos métodos utilizados (por exemplo, fatores pré-analíticos, como armazenamento de amostras antes da análise) e fatores relacionados com os cálculos da CVi (como exclusão de outliers e teste de homogeneidade das variâncias). A omissão destes dois últimos fatores tende a aumentar a CVi relatada. Curiosamente, a CVi para a RAC ou concentração de albumina não foi cuidadosamente examinada nas amostras aleatórias de urina, mas existem estudos indicando maior CVi nestes casos(122, 125) (S1 e S14 no suplemento de dados on-line). A segunda urina da manhã demonstrou ser comparável à amostra de 24 h(50), e dois estudos citados na Tabela S1 no suplemento de dados on-line, que utilizou segundas amostras da manhã, forneceram valores de CVi comparáveis aos de outros estudos que utilizaram primeiras amostras da manhã. No entanto, não foi realizada nenhuma comparação direta entre as primeiras e as segundas amostras manhã no mesmo estudo.

Variação da albumina da urina durante a coleta e o armazenamento

Em baixas concentrações de albumina na urina, a adsorção sobre a superfície dos recipientes de armazenamento pode levar a perdas significativas. A adesão de uma monocamada de albumina para uma superfície requer, aproximadamente, 0,15 µg/cm2(76). A adsorção não específica de albumina urinária foi calculada em < 1 mg/l em superfícies hidrofílicas e < 2 mg/l em superfícies não hidrofílicas(44). A adesão a superfícies também resulta em desnaturação e, tanto a adsorção quanto a desnaturação podem ser reduzidas quando uma superfície hidrofílica adequada é usada ou um detergente não iônico é adicionado(22, 82). A albumina afigura-se relativamente estável na interface ar-líquido quando é gerada espuma por mistura rápida(68).

Houve várias recomendações sobre o armazenamento de longo prazo e a estabilidade das amostras de urina para análise da albumina(13, 40, 74, 87, 111). Descobertas recentes sugerem que as amostras de urina são estáveis por longos períodos quando congeladas a -80ºC. Foram relatadas várias alterações na albumina quando armazenadas congeladas em temperaturas acima de -80ºC, em particular a -20ºC(12, 13, 29, 43, 109).

É preferível urina fresca, coletada em jato médio, para testes laboratoriais de rotina clínica. A albumina é, geralmente, estável na urina armazenada entre 2-8ºC durante sete dias(50, 87). A influência de bactérias e proteases não foi bem estudada, mas ambas podem causar alterações na albumina da urina em algumas amostras. Frequentemente, são formados precipitados na urina refrigerada ou congelada, e os seus efeitos sobre a dosagem de albumina não foram exaustivamente investigados. Os precipitados geralmente se dissolvem quando a urina é aquecida para análise. Foi relatado que o descongelamento da urina a 37ºC minimiza o precipitado(114), mas poderia aumentar a taxa de atividade de protease. Pode ser necessária centrifugação da urina turva para remover o material insolúvel antes da dosagem.

Coleta de amostras de urina e realização dos testes

Pesquisas da prática clínica têm mostrado grande variedade de coleta de amostras e de procedimentos de escolha para a dosagem e limiares de decisão utilizados. Um estudo de 2002 descreveu práticas de teste da albumina na urina em hospitais e consultórios médicos em Montana (EUA) e verificou que apenas 43% e 46%, respectivamente, utilizaram limiares recomendados pela American Diabetes Association ou pela National Kidney Foundation (EUA)(45). Em 2003, um estudo francês de clínica geral para cuidados de pacientes diabéticos relatou que apenas 36% dos pacientes tinham teste de albumina na urina e que apenas a coleta de urina de 24 h foi considerada adequada(31). Uma pesquisa da British Pediatric Diabetes Care Practices relatou, em 2005, que o teste predominante foi a dosagem de RAC em amostras da manhã (81%), enquanto coletas cronometradas noturnas e coletas de 24 h foram utilizadas por 14% e 5%, respectivamente(28).

Durante o ano de 2006, uma avaliação baseada em questionário de avaliação da albumina na urina na atenção primária de saúde foi realizada em nove países europeus, com respostas de 2.078 médicos generalistas(1). Amostras aleatórias de urina prevaleceram para o primeiro exame de albumina na urina, enquanto coletas cronometradas foram utilizadas em larga escala para o teste de repetição, especialmente quando realizado em laboratório hospitalar. Apenas 45%-77% dos médicos generalistas solicitaram teste de repetição se o primeiro teste foi positivo. A prevalência de instrumentos para análise da albumina na urina no consultório variou de 4% a 88% entre os países, com maiores números na Noruega e Suécia e mais baixos na França. Quando instrumentos do consultório foram utilizados, as dosagens quantitativas de RAC prevaleceram na Escandinávia, enquanto tiras semiquantitativas de albumina estavam em utilização generalizada nos outros países. Em todos os países, exceto na Holanda, havia quatro diferentes formas de relatar resultados de albumina na urina: concentração (mg/l), excreção por 24 h (mg/24 h), excreção por minuto (µg/min) e RAC (mg/mmol ou mg/g). Os médicos, na maioria dos países, estimaram que uma variação de 33% nos resultados da albumina na urina indicaria variação clínica significativa na condição do paciente, independente do tipo de amostra utilizado para a dosagem.

Em 2006, uma pesquisa da prática de 55 laboratórios na Austrália/Nova Zelândia mostrou grande variabilidade nos tipos de amostra e de coleta recomendados, incluindo a coleta da urina de 24 h, ou amostras cronometradas, amostras aleatórias isoladas, bem como coleta da primeira urina da manhã(62). O limiar de decisão relatado pelos laboratórios variou de 15 a 30 mg/l de albumina na urina e 1 a 3,6 mg/mmol (9-32 mg/g) para a RAC. Não houve relação entre os intervalos de referência e o instrumento/método utilizados.

Formas moleculares da albumina na urina

A quantidade e a forma molecular de albumina na urina podem diferir das do plasma devido ao diferencial de filtração ou à captação tubular de formas alteradas de albumina, à alteração da albumina por proteólise durante a passagem pelo trato urinário, à alteração química por oxidantes, radicais livres e outros ligantes concentrados na urina e a alterações durante o armazenamento da amostra.

Estrutura da albumina

Propriedades estruturais da albumina plasmática foram revistas por Peters(90). O gene para a albumina do soro humano codifica um precursor, a pré-proalbumina, que é transformado, intracelularmente, na proteína plasmática madura de 585 resíduos de aminoácidos, secretada pelos hepatócitos. Polipeptídios da albumina não sofrem alterações pós-translacionais intracelularmente. Um alto conteúdo de aminoácidos ácidos contribui para uma carga líquida de -15 a -20 em pH neutro, ponto isoelétrico próximo de 5 e de alta solubilidade hídrica. A cristalografia de raios X mostra uma proteína em forma de coração, com três domínios globulares formando um V(17, 25). A albumina é estabilizada por 17 ligações internas de dissulfeto cruzadas e um elevado teor de estrutura α-helicoidal, resultando em uma molécula relativamente resistente à desnaturação(90). A albumina, em solução, comporta-se hidrodinamicamente como um cilindro de 14 nm de comprimento. A forma alongada e o tamanho hidrodinâmico aumentado podem ser importantes para diminuir a filtração glomerular de albumina.

Alelos mutantes de albumina são expressos em < 1 em 1.000 pessoas(90), portanto deveriam afetar raramente a análise quantitativa de albumina. Algumas mutações pontuais, contudo, afetam a depuração renal de albumina(59), produzindo diferentes proporções de albumina modificada na urina e no soro.

O pH normal da urina (pH 5-8) não afeta a forma da albumina. No pH abaixo de 4 e acima de 8, a albumina sofre grandes mudanças estruturais, a maioria reversível(90). A concentração máxima de ureia na urina é de, aproximadamente, 1 mol/l e não deve causar desnaturação(90).

A albumina tem até seis sítios de ligação para ácidos graxos de cadeia longa por molécula. No plasma, normalmente há cerca de um de ácido graxo por molécula de albumina, mas essa proporção pode ser aumentada várias vezes com o estresse, o exercício ou a terapia com heparina. Quantidades variáveis de ácidos graxos ligados alteram a mobilidade eletroforética da albumina em eletroforese não desnaturante e focalização isoelétrica(38, 75).

A albumina é transportadora de numerosas moléculas orgânicas pequenas e de íons(2, 33, 34, 51, 67, 90, 107). As ligações dessas moléculas podem afetar a conformação da albumina(2, 35, 90). Outros compostos endógenos, como o cobre e a tiroxina, ligados à albumina ocupam < 1% das moléculas de albumina no plasma. A bilirrubina ocupa uma pequena porcentagem de moléculas de albumina, exceto nos estados hiperbilirrubinêmicos severos, nos quais mais de metade das moléculas de albumina podem ter bilirrubinas ligadas. Em concentrações fisiológicas no plasma, 1-2 íons cálcio e 7-8 íons cloreto estão ligados por molécula de albumina(33, 34). A ligação desses íons é dependente do pH e, portanto, variável na urina, e íons podem dissociar rapidamente ou trocar com outros íons durante a análise.

A urina é enriquecida em relação ao plasma por componentes peptídicos de baixo peso molecular e derivados aminoácidos, como ácido hipúrico e fenilacetilglutamina(52, 84, 109). Em uma base molar, a concentração desses compostos na urina geralmente é superior à de albumina, então pode haver muitas ligações vinculadas à albumina(52, 84). No plasma, a albumina também liga uma gama diversificada de peptídeos para os quais existem dados limitados em relação a afinidade e estequiometria de ligação(72, 73).

A albumina contém dois sítios (Sudlow I e II) para a ligação de várias drogas e compostos endógenos(107). Alguns desses compostos, como salicilatos, antibióticos, sulfa e penicilinas, ocorrem em concentrações elevadas na urina.

Formas covalentemente modificadas de albumina

A albumina contém uma cisteína não pareada no resíduo 34. Ela tem um pK incomumente baixo de, aproximadamente, 5, que resulta em aumento da reatividade e das taxas de formação de ligações dissulfeto e de intercâmbio com outros compostos contendo sulfidrila no plasma(32,, 53, 90). A albumina pode formar dímeros de dissulfeto, com 2 monômeros de albumina ligados pelos resíduos cisteína-34, ou a cisteína da cadeia lateral pode ser oxidada em um ácido sulfônico(77, 90). A albumina, com várias alterações de cisteína-34, tem diferentes propriedades de ligação para uma variedade de ligantes, sugerindo uma variação estrutural significativa(86, 90). Alguns dímeros de albumina, principalmente com ligações dissulfeto, são observados em amostras de urina(15, 39, 90, 108, 124, 127).

A albumina tem meia-vida longa, de cerca de 20 dias, na corrente sanguínea(21, 90), o que lhe permite acumular variações químicas. Reações com aminoácidos de cadeias colaterais resultam em grupo carbonil, carboximetilisina, produtos finais de glicação avançada em uma pequena proporção de moléculas de albumina(77, 120, 123). Ligações cruzadas de ditirosina também são detectadas(86). No plasma, 1%-10% das moléculas de albumina são glicados pela reação com a glicose, com elevadas concentrações em pessoas com diabetes(19, 90). A maior proporção de albumina glicada na urina em relação ao plasma foi atribuída à menor eficiência de absorção tubular da forma glicada(19). A captação tubular de albumina é um processo mediado por receptor com grande especificidade(26, 37).

Fragmentação de albumina

Vários fragmentos albumina > 5 kDa foram detectados na urina(15, 39, 54, 66, 69, 109, 112, 115, 124, 127, 128). Observou-se que as proporções de fragmentos aumentam com doença renal(15, 39, 124, 127) e, possivelmente, com o armazenamento prolongado de amostras a -20ºC(109). As sequências de vários fragmentos grandes foram identificadas na urina e alguns foram detectados no plasma, sugerindo que certos fragmentos na urina vieram do plasma(15).

Fragmentos de albumina de 500-5.000 Da têm sido descritos no plasma e na urina(20, 46, 47, 63-65, 94, 97, 126). Alguns se acumulam no plasma de pacientes com insuficiência renal. A filtração glomerular é um processo dependente de tamanho e carga, e pequenos fragmentos positivamente carregados gerados no plasma deveriam ser rapidamente removidos pelo rim saudável(11, 83).

Várias formas truncadas de albumina foram detectadas no plasma, com deleções de um ou dois aminoácidos N-terminal(10) ou um, seis ou 13 aminoácidos C-terminal(5, 9). Albumina sem o resíduo leucina C-terminal representa 4%-15% da albumina do plasma normal(9), e esta pode vir a ser a principal forma de albumina no plasma e na urina de pacientes com doenças críticas(5, 9).

Proteases ao longo do trato urinário e na urina podem gerar fragmentos de albumina ou novas alterações de fragmentos no sistema urinário e durante o armazenamento da amostra(8, 113, 118). Algumas albuminas do interior de células tubulares podem ser parcialmente digeridas e os fragmentos podem retornar à urina(99).

Influência das formas estruturais da albumina na urina para a dosagem

O imunoensaio tem sido o principal método para a quantificação de albumina na urina. A albumina humana é altamente antigênica em muitas espécies animais(90). A resposta policlonal de coelhos é dirigida contra, pelo menos, cinco sítios antigênicos diferentes(101), sugerindo que os imunoensaios com antissoros policlonais podem reagir com muitas albuminas modificadas. A existência de vários sítios antigênicos é coerente com evidências de que um teste imunoturbidimétrico reage com a albumina clivada em três partes por brometo de cianogênio, com a albumina quimicamente modificada e com a albumina animal, que diferem na sequência de aminoácidos em mais de 20% da albumina humana(109).

Procedimentos de rotina para a dosagem de albumina na urina

Concentrações de albumina urinária < 150 mg/l estão abaixo do limite de detecção do teste colorimétrico de tiras reagentes utilizado na rotina do exame de urina. Os imunoensaios disponíveis, incluindo turbidimétrico, nefelométrico e procedimentos imunométricos de dois sítios, normalmente têm limites de detecção de 2-10 mg/l(14, 41). Os formatos incluem: reagentes líquidos com dosagens nefelométricas quantitativas ou dosagens espectrofotométricas e tiras de fluxo lateral com determinação semiquantitativa visual. Métodos clínicos de rotina usam anticorpos tanto policlonais quanto monoclonais que podem influenciar a sensibilidade para dosar formas alteradas e fragmentos de albumina.

A cromatografia líquida de exclusão por tamanho foi aplicada como método alternativo e fornece valores superiores aos do imunoensaio para a maioria das amostras. Esta observação levou a uma hipótese polêmica de que a cromatografia de exclusão por tamanho detecta uma forma de albumina que não é detectada pelo imunoensaio(14, 23, 88, 89). Esta hipótese tem sido questionada com base na reatividade apresentada dos antissoros policlonais com múltiplos sítios antigênicos na albumina(101, 108). Além disso, os resultados do método de exclusão por tamanho incluem outras moléculas com, aproximadamente, o mesmo tamanho da albumina, incluindo diversas proteínas urinárias(108).

Desempenho dos procedimentos de dosagem de albumina na urina

Não existem dados descritos sobre a uniformidade de resultados entre os métodos e entre os laboratórios que utilizam amostras recém-coletadas. Assim, nós examinamos a variação nos resultados entre laboratórios e entre métodos pelo Esquema de Avaliação Externa de Qualidade (EQAS). Em princípio, as amostras utilizadas em tais pesquisas deveriam refletir o conteúdo e a composição da albumina na urina original e ser permutáveis com a urina original. Na prática, as mostras de urina utilizadas nos EQAS são frequentemente preparadas com adição de albumina e creatinina purificadas, e podem incluir outros analitos, estabilizadores e aditivos para ajuste de pH. Essas amostras podem ter uma matriz menos complexa e com moléculas de albumina mais homogêneas do que as encontradas na urina original e fornecer resultados de EQAS mais uniformes do que os de urina original.

A Tabela 3 mostra que diferentes organizadores de EQAS utilizam distintos materiais e os tratam de maneiras diferentes. As amostras que utilizam urina líquida original, com pouca ou nenhuma adição de albumina e creatinina purificadas, são mais suscetíveis de serem comparáveis. A experiência do Centro Norueguês para a Garantia de Qualidade em Atenção Primária à Saúde (NOKLUS) indica que as amostras de urina de pacientes com albuminúria se comportam de forma diferente em alguns métodos quando comparadas com a urina normal com adição de albumina humana purificada. Quanto mais sintética e mais processada a amostra, mais incerta será sua comparabilidade. As amostras que foram liofilizadas não são suscetíveis de serem comparáveis com as amostras originais. Amostras não comparáveis são limitadas para avaliar a concordância de resultados dentro de um método/instrumento de um mesmo grupo e não podem ser usadas para avaliar a concordância entre métodos diferentes.

A Tabela 4 apresenta exemplos de toda a gama de resultados observados em vários programas EQAS em diferentes países. Quando foi considerado que o material EQAS tinha uma probabilidade razoável de ser comparável, os dados de todos os participantes foram combinados para representar o desempenho agregado entre métodos e entre laboratórios. Quando o material era menos provável de ser comparável, os dados foram separados por métodos, para se obter uma estimativa de desempenho entre laboratórios, dentro do método. Todos os EQAS excluíram outliers (utilizando procedimentos diferentes) antes de calcularem as estatísticas. A variação ± 2SD foi calculada a partir dos dados disponíveis para fornecer uma estimativa de um intervalo central de 95% dos resultados relatados.

 

 

Todos os estudos demonstraram variabilidade entre os laboratórios e entre os procedimentos de dosagem (Tabela 4). A variação entre laboratórios dentro do método foi menor do que a variação combinada entre laboratórios e entre métodos, sugerindo que houve diferenças de calibração entre os métodos. É difícil avaliar se o atual desempenho analítico atende aos requisitos clínicos porque esses requisitos não foram definidos na base das evidências dos resultados. Caso uma especificação de qualidade para imprecisão da dosagem da concentração de albumina na urina seja metade da variação biológica intraindivíduo, e seja tomado um CVi típico de 40% (Tabela S1 no complemento de dados on-line), os resultados EQAS podem preencher este critério. Os desvios não podem ser avaliados porque não existe sistema de referência em vigor.

Sistema de referência para a dosagem de albumina urinária

Um sistema de referência de albumina na urina requer material de referência (MR) tanto primário quanto secundário (matriz) e um procedimento de dosagem de referência (PDR) com o qual o valor atribuído de um MR possa ser, precisamente, transferido para uma amostra de paciente por meio da dosagem hierarquizada da cadeia de rastreabilidade(56). Neste momento, o site do Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM) não relaciona uma ordem superior de MR ou PDR para albumina na urina(60).

Um MR destinado à calibração de procedimentos de dosagem de rotina deve ser comparável com urina original para todos os procedimentos. Este atributo significa que os métodos de rotina terão reatividade imunoquímica equivalente em relação à(s) molécula(s) de albumina no MR tanto quanto da albumina na urina original. A comparabilidade é mais difícil de ser definida para urina porque a matriz é altamente variável em diferentes condições patológicas e a quantificação não é bem definida. Um material de referência que usa albumina altamente purificada pode não refletir as diferentes formas moleculares presentes na urina típica. No entanto, o uso de albumina purificada em um MR pode ser a estratégia mais prática para atingir a calibração padronizada de procedimentos de dosagem de rotina.

Materiais e métodos atualmente utilizados como referência para calibração de procedimentos de dosagem de albumina na urina

Como atualmente não existem MRs de albumina na urina, a maioria dos métodos de rotina é calibrada para ser rastreável para CRM470 diluído (agora chamado ERM-DA470; Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, Bélgica), um MR de proteínas séricas de ordem superior com concentração de albumina de 39,7 g/l(6). Não foram publicados acordos para os protocolos de diluição para a preparação de concentrações de CRM470 adequadas para calibração do método para urina. A concentração de albumina no CRM470 foi, inicialmente, baseada em um MR para proteínas séricas antigo, USNRP 12-0575C(95). No entanto, ainda não foram elucidados: a estrutura da proteína, as propriedades físico-químicas e o procedimento para a atribuição de valor para USNRP 12-0575C(6). O Grupo de Trabalho IFCC tentou delinear um material de referência semelhante para proteínas urinárias incluindo albumina, mas não conseguiu(93).

Pesquisadores japoneses relataram que 5% a 10% dos calibradores utilizados com imunoensaios de rotina continham albumina polimerizada(114). O mesmo estudo revelou que alguns métodos usaram CRM470 diluído como base para a calibração do valor atribuído, enquanto outros utilizaram o coeficiente de absorção molar de albumina sérica humana.

Material de referência candidato para albumina na urina

A Japanese Society of Clinical Chemistry e o Japanese Comittee for Clinical Laboratory Standards coordenaram o desenvolvimento de um novo MR secundário como candidato para albumina na urina com uma estrutura proteica e propriedades físico-químicas bem definidas(58). O MR foi preparado utilizando-se > 97,5% de albumina sérica humana monomérica pura em uma matriz de 0,5 mol/l de NaCl, 20 g/l de sacarose e 0,5 g/l de NaN3 em 20 mmol/l de fosfato tamponado, pH 7,3. O material liofilizado teve um intervalo de menos de 3% de diferença, e manteve-se estável por mais de um ano a 5-10ºC e 20 h após a reconstituição com água, tanto a 10ºC quanto a 25ºC.

Como não há PDR disponível para albumina na urina, o valor do MR candidato foi atribuído à rastreabilidade para CRM470 diluído pela utilização de procedimentos de imunoensaios de rotina(58). Em resumo, 13 sistemas de dosagem de rotina participantes tinham reações imunoquímicas idênticas ao MR candidato e ao CRM470 diluído. As concentrações determinadas para o MR candidato por cada valor do método de rotina transferido do CRM470 foram calculadas para atribuir uma concentração para o MR candidato de 226,1 (8,4) mg/l (média [incerteza]) após a reconstituição com 3 ml de água.

O objetivo dos investigadores japoneses foi validar a permutabilidade para o novo MR candidato e apresentá-lo ao JCTLM para aprovação. Eles também estão investigando o uso de albumina humana recombinante para desenvolver um material de referência primário baseado na tecnologia utilizada para o candidato a MR secundário.

Candidato a procedimento de referência para a dosagem de albumina na urina

Um PDR para albumina na urina deve medir especificamente a(s) molécula(s) de albumina na urina original. Devido à heterogeneidade das formas moleculares da albumina na urina, a mensuração não é clara e deve ser definida. Procedimentos imunológicos não são adequados como os PDRs, porque anticorpos em diferentes ensaios podem reagir com diferentes epítopos na molécula de albumina ou nos fragmentos moleculares, e diferentes princípios de dosagens podem dar respostas diferentes.

Pesquisadores da Clínica Mayo, em Rochester, desenvolveram recentemente um procedimento de dosagem por cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS), que mede o fragmento N-terminal com 24 aminoácidos da albumina. O método emprega fragmentação induzida destinada a sanar a necessidade de digestão de tripsina e potenciais problemas de digestão incompleta. Resultados similares foram obtidos usando-se albumina humana sérica marcada com 15N, preparada em um sistema de expressão por leveduras(104) ou, menos cara, albumina sérica bovina(4) como padrões internos. A calibração foi baseada em uma urina purificada com carvão e suplementada com albumina sérica humana comercial, cuja concentração foi quantificada pela absortividade molar [38553 l/(mol-cm)] a 280 nm(42).

Como o procedimento quantifica um fragmento específico da albumina na urina, será necessário investigar em que medida de albumina normal e patológica na urina contém fragmentos com estes 24 aminoácidos ou moléculas de albumina truncadas no N-terminal. A utilização de LC-MS para detectar outros fragmentos de albumina poderia facilitar o estudo da natureza, quantidade e relevância clínica das espécies de albumina urinária nas doenças renais e cardiovasculares. A tecnologia LC-MS não é uma técnica baseada em anticorpos que pode ser desenvolvida em um PDR candidato para albumina na urina.

Sistema de referência para dosagens de creatinina na urina

A determinação da RAC se baseia tanto em dosagens albumina quanto de creatinina na urina. A variabilidade dos valores RAC calculados refletirá os erros sistemáticos combinados e imprecisões de dosagem de ambos os analitos. É necessária a padronização das dosagens de albumina e de creatinina na urina para obter comparabilidade dos valores obtidos da RAC com diferentes métodos e em diferentes locais.

O programa de padronização iniciado pelo National Kidney Disease Education Program (NKDEP) para a creatinina sérica foi embasado na existência de procedimentos de referência de dosagem validados e no desenvolvimento de um MR secundário, comparável para a creatinina sérica. Um esforço semelhante é necessário para promover dosagens de rotina de alta qualidade de creatinina na urina. O JCTLM listou um procedimento de dosagem de referência para creatinina na urina com base na diluição isotópica-cromatografia gasosa-espectrometria de massas(103) e em um MR primariamente certificado (ou seja, substância pura) de creatinina (National Institute for Standards and Technology, EUA, SRM 914a). No entanto, atualmente, não há RMs baseados em matriz derivada disponíveis para creatinina na urina.

Devido à falta de MRs secundários certificados para creatinina na urina, a calibração dos métodos de rotina de dosagem na urina é feita à base de RMs séricos. Esta prática não é a ideal, principalmente devido às importantes diferenças entre as matrizes de urina e o soro.

 

Conclusão

Muitas questões exigem esclarecimentos para melhorar a utilização de albumina na urina para avaliação de doença renal. Os dados existentes não sustentam fortes conclusões ou recomendações práticas neste momento. Outras investigações são necessárias para obter informações e evidências objetivas para permitir a padronização da dosagem de albumina na urina e diretrizes para a prática clínica com base na dosagem da excreção de albumina urinária. O grupo NKDEP/IFCC pretende desenvolver programas experimentais para adquirir as informações adicionais.

Práticas atuais que refletem os pareceres consensuais dos participantes da conferência

1. O uso do termo "albumina na urina" é recomendado; "microalbumina" é desencorajado.

2. A primeira amostra de urina da manhã proporciona menor variabilidade do que amostras aleatórias.

3. A segunda amostra de urina da manhã também pode ser aceitável, mas não há evidências para apoiar esta prática como superior à primeira urina da manhã.

4. A albumina deve ser dosada na urina que não tenha sido congelada. A albumina na urina é suficientemente estável quando armazenada a 2-8ºC, durante sete dias antes da dosagem. Qualquer turbidez devido a precipitação ou componentes celulares deve ser removida por centrifugação antes do armazenamento refrigerado.

5. Urina refrigerada deve ser aquecida à temperatura ambiente antes de dosagem para dissolver precipitados que tenham se formado e adsorvido a albumina. A urina deve ser examinada visualmente em busca de precipitados e centrifugada, se necessário, para remover precipitado residual.

6. Se a urina for congelada antes da dosagem, deverá ser congelada a -70ºC ou menos. Qualquer turbidez devido a precipitação ou componentes celulares deve ser removida por centrifugação antes do armazenamento. Amostras descongeladas devem ser aquecidas à temperatura ambiente e cuidadosamente misturadas antes da dosagem. O efeito do congelamento e descongelamento sobre as formas moleculares da albumina não está completamente compreendido.

7. A relação albumina/creatinina deve ser referida em todas as dosagens de albumina na urina.

8. A confusão surge a partir dos relatórios nos quais os resultados são expressos em diferentes unidades: "mg albumina/mmol de creatinina", "g albumina/mol creatinina", "mg albumina/g creatinina" ou "microgramas albumina/mg de creatinina". Essa situação reflete preferências nacionais ou regionais e parece que não será resolvida. De forma ideal, deveria ser adotado o Sistema Internacional de Unidades. Por outro lado, diretrizes uniformes devem ser sugeridas dentro de um país ou uma região.

9. As concentrações de albumina relatadas em miligramas por litro são difíceis de interpretar e concentrações nestas unidades não devem ser os únicos valores reportados.

Questões que exigem pesquisa mais aprofundada para padronização da dosagem e do relato de albumina na urina

1. Esclarecimento dos requisitos pré-analíticos.

  • Influência do tipo de recipiente.
  • Influência do horário da coleta (primeira da manhã, segunda do dia, aleatoriamente, 24 h) relacionado com a variabilidade biológica.
  • Influência de sangue (sangramento menstrual ou urinário), fluido seminal e outros contaminantes fisiológicos da urina.

    2. Esclarecimento das formas moleculares de albumina na urina recente, bem como a definição da medida.

    3. Esclarecimento do grau de degradação da albumina na urina sob várias condições de armazenamento.

    4. Esclarecimento quanto à variação na composição da matriz urinária sobre a qual o procedimento de dosagem de albumina na urina se deve operar.

    5. Esclarecimento dos requisitos clínicos para erro total na dosagem de albumina na urina.

    6. Desenvolvimento de um procedimento de dosagem de referência.

    7. Desenvolvimento de um material de referência secundário para albumina na urina, incluindo a sua validação de permutabilidade e credenciamento pelo JCTLM.

    8. Desenvolvimento de um material de referência secundário para creatinina na urina, incluindo a validação de permutabilidade e o credenciamento pelo JCTLM.

    9. Identificação de materiais EQAS adequados que permitam que o desempenho de métodos de rotina seja comparado.

    10. Padronização dos resultados das dosagens para permitir que os estudos clínicos determinem os melhores limiares de decisão dos TEA e RAC.

    11. Diferentes limites de decisão podem ser necessários para tempo de coleta aleatório vs. primeira da manhã ou outros padronizados, devido ao aumento da variabilidade das amostras coletadas aleatoriamente.

    12. A RAC varia com idade, sexo e etnia. A decisão limiar adequada para estes subgrupos necessita de uma investigação mais aprofundada. Um único limiar de decisão não pode ser suficientemente sensível para cada subgrupo.

    13. Risco de doença renal crônica e doenças cardiovasculares são funções contínuas de concentração de albumina na urina. Os limiares adequados para determinadas populações de risco (por exemplo, população geral ou grupos de alto risco, como diabetes, hipertensão ou doença cardiovascular) devem ser determinados.

    14. Uma pesquisa da utilidade de equações específicas para idade e sexo para converter a RAC para um valor TEA estimado no qual uma única referência limite seja apropriada.

 

Agradecimentos

Os autores agradecem a contribuição dos participantes da conferência de março de 2007 sobre dosagem e relatório da albumina na urina; seus nomes estão listados no Suplemento de Dados, on-line. Agradecemos também a Elisa Gladstone e Nancy Accetta pelo excelente suporte administrativo.

Este artigo foi traduzido com permissão da American Association for Clinical Chemistry (AACC). A AACC não é responsável pela exatidão da tradução. As ideias apresentadas são aquelas dos autores, e não necessariamente aquelas de AACC ou do Jornal. Reeditado de Clin Chem, v. 55, p. 24-38, 2009, com permissão de editor. Copyright© original 2009 American Association for Clinical Chemistry, Inc. Quando citar este artigo, por favor, refira a fonte original de publicação no jornal, Clinical Chemistry.

Tradução para o português: Aline Ribeiro Andriolo, CD.

 

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Endereço para correspondência
W. Greg Miller
Richmond, VA
PO Box 980286
e-mail: gmiller@vcu.ed

Primeira submissão em 02/04/09
Última submissão em 19/03/10
Aceito para publicação em 07/04/10
Publicado em 20/06/10

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