Importância clínica e laboratorial do volume plaquetário médio

The clinical and laboratory importance of mean platelet volume

ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL PAPER

Importância clínica e laboratorial do volume plaquetário médio

The clinical and laboratory importance of mean platelet volume

Mariela Granero Farias^I; Suzane Dal Bó^II

^IFarmacêutica bioquímica da Unidade de Hematologia do Serviço de Patologia Clínica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)

^IIFarmacêutica bioquímica da Unidade de Hematologia do Serviço de Patologia Clínica do HCPA

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Os índices plaquetários fornecidos pelos analisadores hematológicos são provavelmente os parâmetros mais ignorados pela maioria dos laboratórios clínicos, em virtude da dificuldade de sua padronização. Desses índices, o volume plaquetário médio (VPM) vem merecendo destaque por sua grande utilidade, não só em casos de trombose e hemostasia, mas também em uma série de patologias, como diabetes, doenças da tireoide, doenças vasculares, entre outras. O VPM é um parâmetro plaquetário fornecido no hemograma que não gera custos adicionais para o laboratório. Junto com a contagem de plaquetas, ele é um sensível indicador de desordens plaquetárias in vivo, mas pode ser tecnicamente difícil de analisá-lo in vitro por causa dos interferentes pré-analíticos, como tempo de armazenamento da amostra e artefatos gerados pelos anticoagulantes. Neste artigo descrevemos as principais metodologias e seus interferentes na determinação da contagem plaquetária e do VPM, destacando a importância do laboratório de análises clínicas em validar esse parâmetro, proporcionando sua utilização no diagnóstico de desordens hematológicas e de outras patologias.

Unitermos: Plaquetas. Volume plaquetário médio. Impedância. Densidade ótica.

ABSTRACT

The platelet indices provided by the hematological analyzers are probably the parameters mostly ignored by most clinical laboratories due to standardization difficulties. Among those indices, the mean platelet volume (MPV) has stood out due to its usefulness not only in cases of thrombosis and hemostasy, but also in a series of pathologies, such as diabetes, thyroid and vascular diseases, among others. MPV is a platelet parameter provided by the hemogram, which does not represent additional costs to the laboratory. Along with platelet count, it is a sensitive indicator of platelet disorders in vivo. However, it may be technically difficult to analyze it in vitro owing to preanalytical interferences, such as sample storage time and anticoagulant artifacts. In this article we described the main methodologies and the interfering factors in determining platelet count and MPV, highlighting the importance of the clinical laboratory analyses to validate this parameter, allowing its use in the diagnosis of hematological disorders and other pathologies.

Key words: Platelets. Mean platelet volume. Impedance. Optical density.

Introdução

As plaquetas foram primeiramente descritas como corpúsculos distintos, e seu papel na coagulação e na trombose foi reconhecido pelo patologista italiano Giulio Bizzozzero, em 1882⁽⁴⁵⁾. Atualmente está bem estabelecida sua definição como fragmentos citoplasmáticos derivados dos megacariócitos da medula óssea⁽⁵⁾.

Como as plaquetas não apresentam núcleo, muitas de suas características morfológicas e biológicas são determinadas pela mensagem genética de sua célula precursora, o megacariócito da medula óssea. A trombopoetina (TPO) mostrou-se o maior agente de controle na regulação da produção plaquetária^{(16, 22 ,32)}. Esta ação é provavelmente modulada tanto por uma série de citocinas e fatores humorais estimuladores, como as interleucinas (IL) 3, 6 e 11⁽²⁸⁾, quanto por fatores estimulantes de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e, ainda, pela eritropoetina (EPO). Por outro lado, há os fatores humorais inibidores, como a β-trombomodulina e o fator plaquetário 4 (PF4), que são proteínas específicas, liberadas dos α-grânulos, marcadores da ativação plaquetária, e podem influenciar sua produção⁽³²⁾. Em situações que aceleram a hematopoese, a maturação citoplasmática megacariocítica é mais rápida que a nuclear, e as plaquetas formadas apresentam volume maior e são metabolicamente mais ativas⁽⁶⁰⁾.

Algum tempo atrás, os estudos plaquetários limitavam-se, principalmente, à contagem de plaquetas e às referências morfológicas sobre macroplaquetas, satelitismo e agregação plaquetária. Com o surgimento dos analisadores hematológicos de segunda geração, na década de 1980, tornou-se possível a medição automática de vários parâmetros⁽³¹⁾. Entre os novos índices, vem merecendo destaque o volume plaquetário médio (VPM), por se tratar de uma variável biológica que determina a função e a atividade plaquetária⁽⁴⁶⁾.

São denominadas macroplaquetas aquelas que apresentam um tamanho de 4 a 7 μm de diâmetro e plaquetas gigantes as maiores que 7 μm, geralmente 10 a 20 μm⁽¹¹⁾. Embora a avaliação cuidadosa do tamanho, em uma distensão sanguínea, seja rápida e acurada, ela é subjetiva, uma vez que a morfologia é enganosa para a estimativa do tamanho plaquetário. Plaquetas grandes são mais atrativas que as pequenas; então, frequentemente, quando uma distensão é lida, mostra inadequadamente "plaquetas gigantes"⁽³⁾. O uso do VPM, determinado pelos analisadores hematológicos, melhorará a descrição de várias desordens plaquetárias (Figura 1).

O VPM apresenta relação inversamente proporcional à ploidia do megacariócito. Em face disso, o volume plaquetário não pode ser avaliado separadamente da contagem de plaquetas e uma correlação inversa entre esses parâmetros pode ser encontrada^{(7, 59)}.

Muitos laboratórios ignoram a informação do VPM, gerada em analisadores hematológicos, pois o método é de difícil padronização e, quando determinado em amostras de rotina, é afetado por numerosas variáveis, como tipo de tecnologia, populações de pacientes e as pertencentes à própria coleta (complexidade dos efeitos dos anticoagulantes e variáveis pré-analíticas, como temperatura e tempo de estocagem do material)^{(21, 53)}. Em virtude desses problemas e da dificuldade de interpretação da heterogeneidade do tamanho plaquetário sob condições normais e anormais, essas medidas são interpretadas com extrema cautela⁽³⁵⁾, sendo aconselhável que cada laboratório estabeleça seu próprio valor de referência⁽¹⁵⁾.

A avaliação do tamanho e da morfologia das plaquetas torna-se útil no diagnóstico de pacientes com várias desordens plaquetárias, por isso o VPM é de grande importância, particularmente nas trombocitopenias e trombocitoses. Anormalidades clínicas significativas também podem ser detectadas, mesmo se a contagem de plaquetas estiver nos limites normais⁽¹⁵⁾.

O objetivo deste estudo foi fazer uma revisão bibliográfica do VPM para enfatizar não só a importância deste índice, mas também sua aplicação clínica e laboratorial.

Metodologias

O primeiro método de referência para a determinação de plaquetas foi a contagem manual por microscopia de contraste de fase^{(18, 48)}. Em 2001, o International Council for Standardization in Haematology (ICSH) propôs um novo método, baseado na detecção imunológica por citometria de fluxo, que usa o isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado com o anticorpo monoclonal CD61^{(8, 18, 23, 34, 40)}.

No entanto, os princípios utilizados pela maioria dos analisadores hematológicos continuam sendo a impedância eletrônica e a análise ótica ou a associação das duas metodologias^{(4, 18, 48)}.

A contagem por impedância é baseada na análise dimensional, na qual as plaquetas são identificadas por seu tamanho. As células, incluindo as plaquetas, sequencialmente passam uma após outra através de um orifício aberto; porém, ao passar pelo orifício, alteram uma corrente elétrica que resulta em um sinal. O número de pulsos é proporcional ao de células contadas. O tamanho do pulso elétrico é diretamente proporcional ao tamanho (volume) da célula, o que permite a discriminação específica do tipo de célula com o uso de circuitos threshold⁽¹⁸⁾. O histograma plaquetário é uma curva em que cada plaqueta é classificada e distribuída de acordo com seu tamanho (Figura 2). O VPM é diretamente derivado da análise desta curva, sendo obtido pela divisão do plaquetócrito (PCT) pelo número de plaquetas⁽⁵⁾.

No método ótico, o citograma das plaquetas scatter é formado pela medida simultânea de dois diferentes ângulos de dispersão de luz. A dispersão de luz de baixos ângulos (2º a 3º) sinalizada é amplificada 30 vezes, e a de altos ângulos (5º a 15º), 12 vezes. O ângulo baixo é convertido em volume celular (tamanho) e o ângulo alto, utilizado para medição do índice de refração (densidade). O citograma mostra plaquetas com volumes de 0 a 30 fL. Aquelas que apresentam volume maior que 30 fL são contadas na área dos eritrócitos. A análise integrada é utilizada para distinguir plaquetas, macroplaquetas, eritrócitos, células fragmentadas e debris que tenham diferentes índices de refração^{(5, 19, 50)}.

A contagem de plaquetas por fluorescência ótica está sendo introduzida com os novos analisadores hematológicos, adicionada à contagem tradicional por impedância. A contagem é realizada no canal de reticulócitos. O fuorocromo polimetina marca o conteúdo de RNA/DNA das células reticuladas e os grânulos e a membrana das plaquetas e produz fluorescência quando excitado com o laser. Essa tecnologia realiza a contagem simultânea de eritrócitos, reticulócitos e plaquetas fluorescentes. A intensidade de fluorescência de cada célula é analisada, o que proporciona a separação das plaquetas dos eritrócitos e reticulócitos. A fluorescência das plaquetas permite não somente a exclusão da contagem de partículas não plaquetárias, mas também a inclusão de macroplaquetas e plaquetas gigantes⁽⁵⁾.

Atualmente já existem analisadores hematológicos que utilizam os três princípios, realizando três contagens na mesma diluição: ótica, impedância e imunológica⁽⁶¹⁾.

Problemas tecnológicos na determinação do VPM

Embora o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) seja o anticoagulante de rotina, mais utilizado para contagem de células sanguíneas, ele pode induzir alterações na forma e na ultraestrutura das plaquetas. Plaquetas coletadas com esse anticoagulante alteram-se com o tempo e a temperatura^{(6, 39)}, tornando-se esféricas. Entretanto, quando coletadas com citrato de sódio, tornam-se discoides^{(6, 26, 38)}. Essa alteração na forma causa aumento aparente de aproximadamente 20% no VPM nas duas primeiras horas em exposição ao EDTA, em relação às amostras coletadas com citrato⁽³⁸⁾.

Estudos anteriores relatam que o valor do VPM aumenta em decorrência do inchaço plaquetário. Entretanto, um estudo de Endler et al. mostra que tal aumento de tamanho é, aproximadamente, inferior a 0,5 fL, quando a análise é realizada em até duas horas após a venipuntura⁽¹⁷⁾.

A pseudossíndrome de plaquetas cinzentas é um raro fenômeno dependente do EDTA que causa a degranulação das plaquetas in vitro, gerando uma aparência cinza no sangue periférico. As plaquetas "fantasmas" resultam na diminuição da contagem plaquetária e na elevação do VPM. Valores diminuídos de VPM podem ser obtidos pelo estouro das plaquetas, também causado pelo EDTA⁽³⁶⁾.

Na metodologia de impedância, o tamanho é o principal parâmetro para separar plaquetas de eritrócitos ou de outras partículas, como, por exemplo, células vermelhas fragmentadas, micrócitos, fragmento de células leucêmicas de leucemias agudas ou crônicas^{(8, 13, 29, 30, 51)}, crioglobulinas^{(13, 14, 54)}, ou qualquer outra causa que gere a formação de debris (Figura 3 a-c). Como todas as partículas com menos de 20 fL podem ser contadas como plaquetas, a contagem fica espuriamente elevada e o VPM fica alterado, refletindo o tamanho do fragmento^{(29, 30)}. Eritrócitos infectados por trofozoítos do P. falciparum⁽¹³⁾, por fungos^{(1, 29)} ou bactérias^{(1, 30)} também podem interferir na contagem de plaquetas e na determinação do VPM.

As bactérias podem induzir contagens falsamente elevadas de plaquetas por sua presença in vivo. Embora seja uma situação rara, em pacientes sépticos algumas bactérias podem ser observadas na distensão sanguínea, associadas a culturas positivas. O histograma do volume plaquetário é anormal e mostra um pico de partículas de pequeno tamanho (2 fL ou menos) quando há bactérias ou aglomerados bacterianos. Fungos também podem apresentar o tamanho das plaquetas e ser observados na distensão sanguínea. Recentemente foi relatada uma contagem elevada de plaquetas em um paciente trombocitopênico infectado por Candida⁽⁵⁶⁾.

Plaquetas muito grandes e agregados plaquetários apresentam maiores valores para VPM e contagens diminuídas^{(1, 8, 24, 44)}, uma vez que são registrados a partir de 20 fL (Figura 3 d-e).

Em pacientes com hiperlipidemia, em amostras coletadas após refeições ou nutrição parenteral, os lipídios podem formar pequenas gotas in vitro, que alteram a contagem de plaquetas e causam moderado aumento em analisadores que usam o método ótico. Como os lipídeos possuem alto índice refratário, eles podem gerar sinais anormais localizados próximo das plaquetas ou no mesmo local⁽⁵⁶⁾.

Aplicação clínica

O VPM é correlacionado com a função plaquetária e pode ser um índice mais sensível que o número de plaquetas, como marcador de interesse clínico, em várias desordens.

O volume plaquetário elevado pode ser encontrado em: pré-eclâmpsia⁽⁴⁶⁾, diabetes^{(25, 43, 59)}, doenças cardíacas^{(20, 27, 58)}, hipertireoidismo⁽¹⁵⁾, esplenectomia⁽³⁾, talassemias α ou β⁽³⁾, vírus da imunodeficiência humana (HIV)⁽⁴²⁾ e púrpura trombocitopênica idiopática (PTI)^{(10, 12, 37)}. Em desordens mieloproliferativas, como a leucemia mieloide crônica e a mielofibrose, as plaquetas frequentemente, mas não sempre, são grandes e anormalmente heterogêneas. Nessas doenças, realmente há plaquetas "gigantes" no sangue periférico⁽⁴⁴⁾. A trombocitemia essencial e a policetemia vera não estão associadas a plaquetas anormais e grandes. Nessas desordens, a medula óssea é hiperproliferativa, mas as células resultantes são fenotipicamente normais⁽³⁾. Plaquetas grandes são vistas também em várias causas de trombocitopenias congênitas, como a síndrome de Bernard-Soulier e a anomalia de May-Hegglin. Nesta também podem ser vistas plaquetas gigantes no sangue periférico. Na rara síndrome de plaquetas cinzentas, elas são grandes e agranuladas ou hipogranuladas, em virtude da liberação de α-grânulos^{(9, 12, 24, 33, 41, 47, 56)}.

O volume plaquetário diminuído pode ser encontrado em: sepse⁽⁵⁵⁾, quimioterapia⁽³⁾, doenças inflamatórias do intestino, como colite ulcerativa e doença de Crohn⁽³²⁾, hipotireoidismo⁽³⁾, anemia megaloblástica⁽³⁾ e síndrome de Wiskott-Aldrich⁽⁵¹⁾. Nessa rara síndrome hereditária, a trombocitopenia é acompanhada por plaquetas pequenas e hipofuncionais^{(9, 12, 37, 49, 51)}.

Discussão

Por muito tempo, os estudos referentes a plaquetas relacionavam-se somente a trombose e hemostasia. Atualmente está claro que as plaquetas exercem importante papel em diversas desordens caracterizadas por doenças vasculares, incluindo doença arterial coronariana (DAC), doenças mieloproliferativas, diabetes, pré-eclâmpsia, doença intestinal inflamatória, entre outras⁽²⁰⁾.

Em pacientes com diabetes têm sido relatadas alterações na morfologia e na função plaquetária. A hiperatividade plaquetária é acompanhada por aumento na síntese de tromboxano e/ou por diminuição na produção de prostaciclina⁽²⁵⁾. Plaquetas grandes são mais reativas e agregáveis, porque contêm grânulos mais densos que secretam mais serotonina, β-trombomodulina e produzem mais tromboxano A2. Isso sugere uma relação entre a função plaquetária e as complicações diabéticas. Alguns estudos têm mostrado uma vida curta e rápida de plaquetas em diabéticos⁽²⁵⁾.

Plaquetas grandes, na circulação, refletidas pela elevação do VPM, levam à maior agregação e facilitam a formação do trombo^{(20, 57, 58, 62)}, o que mostra ser um fator de risco independente para o infarto do miocárdio (IM)⁽²⁾ e para o aparecimento da obstrução arterial coronariana na angina instável^{(20, 27, 32, 56)}. Um aumento do VPM seis meses após o IM é associado a maior risco de futuro infarto^{(27, 56)}. Pacientes que tiveram IM, ou em risco, necessitam de VPMs seriados, bem como de enzimas e outros marcadores⁽¹⁵⁾.

O VPM apresenta relação inversamente proporcional à ploidia do megacariócito; assim, o volume plaquetário não pode ser avaliado separadamente da contagem de plaquetas e uma correlação inversa entre eles pode ser encontrada^{(7, 62)}. Entre as citocinas mais relevantes, a IL-3, a TPO e a IL-6 têm maior influência na ploidia do megacariócito, o que leva à produção de plaquetas grandes e mais reativas⁽¹⁷⁾.

Uma das razões mais importantes para as contagens automatizadas é o baixo erro estatístico devido ao grande número de células examinadas. Entretanto, essas tecnologias apresentam limitações que podem afetar uma contagem verdadeira de plaquetas. Tais limitações são causadas pela inabilidade em diferenciá-las de partículas interferentes⁽¹⁸⁾. A interferência do anticoagulante deve ser controlada pelo uso de um anticoagulante alternativo ou pela padronização entre o tempo da coleta e a análise da amostra⁽⁵⁾.

Aumento espúrio da contagem de plaquetas também é relatado em várias situações, incluindo células vermelhas fragmentadas, crioglobulinas, bactérias ou fungos e lipídios. Alarmes (flags) são gerados e alertam o operador quanto a possíveis achados anormais, podendo-se, assim, identificar o problema. O operador deve estar ciente das características do seu analisador hematológico e apto a reconhecer e corrigir resultados anômalos.

O histograma do volume de distribuição plaquetária é de particular importância. Quando ele for de forma log-normal, a contagem de plaquetas e o VPM refletirão valores reais. Em contraste, quando a distribuição for log-anormal, tanto a contagem quanto o VPM estarão representando interferentes. A avaliação microscópica da lâmina, embora menos precisa, também é de grande utilidade para a identificação de alterações^{(1, 13, 29, 30)}.

A confirmação, usando outro método de contagem, como o de referência - a citometria de fluxo -, deve ser realizada ao menos nas seguintes circunstâncias: falha na curva de plaquetas, na base de 20 fL, população de micrócitos presentes no histograma e VPM exageradamente alto⁽⁵⁶⁾.

O VPM é gerado a partir de analisadores hematológicos, como parte integrante do hemograma, por isso não implica custos adicionais para o laboratório. Tal índice, quando associado à contagem de plaquetas, permite duas vezes mais a detecção de anormalidades plaquetárias, sendo particularmente importante no diagnóstico e no controle de desordens hematológicas e em uma série de outras patologias.

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Primeira submissão em 04/06/07

Última submissão em 05/05/10

Aceito para publicação em 07/05/10

Publicado em 20/08/10

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Set 2010
• Data do Fascículo
  Ago 2010

Histórico

• Aceito
  07 Maio 2010
• Revisado
  05 Maio 2010
• Recebido
  04 Jun 2007