Diagnóstico de imunofenótipos de síndromes linfoproliferativas crônicas por citometria de fluxo na Fundação HEMOPA

Diagnosis of immunophenotyping of chronic lymphoproliferative syndromes by flow cytometry at HEMOPA blood center

ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL PAPER

Diagnóstico de imunofenótipos de síndromes linfoproliferativas crônicas por citometria de fluxo na Fundação HEMOPA

Diagnosis of immunophenotyping of chronic lymphoproliferative syndromes by flow cytometry at HEMOPA blood center

Lacy Cardoso de Brito Junior^I; Danielle Cristinne Azevedo Feio^II; Suane Reis Barbosa^III; Alessandra Quinto Bentes^IV; Larissa Tatiane Martins Francês^V

^IDoutor em Ciências Médicas com ênfase em Patologia Experimental pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/Universidade de São Paulo (USP); professor adjunto IV da Universidade Federal do Pará (UFPA)

^IIMestranda do Programa de Pós-Graduação em Neurociências e Biologia Celular do Instituto de Ciências Biológicas da UFPA

^IIIBiomédica

^IVEspecialista em Hematologia; diretora de Ensino e Pesquisa da Fundação Hospital das Clínicas Gaspar Viana

^VEspecialista em Hematologia; gerente do Laboratório de Hematologia da Fundação HEMOPA

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

INTRODUÇÃO: As síndromes linfoproliferativas formam um grupo heterogêneo de neoplasias malignas com diferentes comportamentos clínicos, fatores patológicos e características epidemiológicas e podem ter seu diagnóstico geral com base na morfologia das células linfoides observadas no sangue periférico.

OBJETIVO: Testar a factibilidade diagnóstica do método de imunofenotipagem por citometria de fluxo para síndromes linfoproliferativas a partir da definição de um painel mínimo de anticorpos.

MATERIAL E MÉTODOS: Participaram 47 pacientes para diagnóstico diferencial dos subtipos de síndromes linfoproliferativas por citometria de fluxo, no período de julho de 2008 a julho de 2010, atendidos na Fundação HEMOPA.

RESULTADOS: A mediana de idade dos pacientes foi de 68 anos, não houve diferença estatística entre os sexos e o subtipo de síndromes linfoproliferativas mais frequente foi a leucemia linfoide crônica/linfoma linfocítico de pequenas células B.

CONCLUSÃO: O método de imunofenotipagem por citometria de fluxo, ao lado da morfologia, de amostras de sangue periférico mostrou-se uma metodologia auxiliar, segura, rápida, factível e não invasiva para o diagnóstico de síndromes linfoproliferativas crônicas a partir do painel de anticorpos sugerido.

Unitermos: Citometria de fluxo, Imunofenotipagem, Neoplasias hematológicas, Diagnóstico, Linfomas

ABSTRACT

INTRODUCTION: Lymphoproliferative syndromes comprise a heterogeneous group of malignant neoplasias with different clinical behaviors, pathological factors and epidemiological characteristics, whose diagnosis may be based on lymphoid cell morphology observed in peripheral blood.

OBJECTIVE: To test the diagnostic feasibility of immunophenotyping by flow cytometry for lymphoproliferative syndromes through the definition of minimal antibody panel.

MATERIAL AND METHODS: During the period of July 2008 to July 2010, 47 patients from HEMOPA blood center participated in this study for differential diagnosis of lymphoproliferative syndromes subtypes by flow cytometry.

RESULTS: The mean age was 68 years old. There was no statistical difference between genders, and the most frequent subtype of lymphoproliferative syndromes was chronic lymphoid leukemia/small B-cell lymphocytic lymphoma.

CONCLUSION: Based on the antibody panel recommended in this investigation, the immunophenotyping method by flow cytometry associated with morphological characterization of peripheral blood samples is a reliable, rapid, feasible, and non-invasive procedure for the diagnosis of chronic lymphoproliferative syndromes.

key words: Flow cytometry, Immunophenotyping, Hematological neoplasias, Diagnosis, Lymphomas

Introdução

As síndromes linfoproliferativas formam um grupo heterogêneo de neoplasias malignas com diferentes comportamentos clínicos, fatores patológicos e características epidemiológicas^{(8, 12, 15)} e podem ter seu diagnóstico geral com base na morfologia das células linfoides, observadas no sangue periférico. No entanto, em função da similaridade da morfologia muitas vezes observada nesse material, sua classificação e, consequentemente, a escolha do tratamento são bastante dificultados, exigindo a confirmação diagnóstica por meio da biópsia de outros órgãos, como baço e linfonodos^{(1, 10, 14)}.

A biópsia de medula óssea (MO) ou mesmo de outros órgãos linfoides para o diagnóstico de síndromes linfoproliferativas crônicas, todavia, além de demoradas, invasivas, que necessitam de técnicas complementares de diagnóstico, como a imuno-histoquímica, exigem a presença de profissionais treinados e altamente qualificados para a diferenciação dessas neoplasias^{(4, 14)}. Diversos autores têm sugerido a utilização da imunofenotipagem por citometria de fluxo aliada à citologia convencional como método rápido e não invasivo de diagnóstico alternativo para síndromes linfoproliferativas^{(2-7, 9, 11, 14, 15)}.

Assim, o objetivo deste estudo foi testar a factibilidade diagnóstica do método de imunofenotipagem por citometria de fluxo para síndromes linfoproliferativas, a partir da definição de um painel mínimo de anticorpos, por meio de material obtido de sangue periférico dos pacientes.

Material e métodos

Foram coletadas amostras de sangue periférico de 47 pacientes provenientes dos programas de diagnóstico e tratamento de leucemias e linfomas da Fundação HEMOPA, no período de junho de 2008 a julho de 2010.

Todos esses indivíduos foram informados de sua participação neste projeto de pesquisa mediante o termo de consentimento livre e esclarecido.

As amostras de sangue periférico foram coletadas em tubos de hemólise com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e encaminhadas, a temperatura ambiente, para o Laboratório de Citometria de Fluxo da Fundação HEMOPA, acompanhadas de história clínica, impressão diagnóstica e ficha com os dados clínicos.

Diagnóstico por imunofenotipagem

Todas as amostras foram analisadas em até 24 horas após a coleta, minimizando, assim, as possibilidades de perda de expressão de antígenos, com a utilização de alíquotas de 100 µl de sangue por tubo à lise das hemácias, sem lavagem das amostras para evitar a seleção ou a perda arbitrária de populações celulares específicas.

Foi adicionado 0,01 ml de diferentes anticorpos monoclonais específicos marcados com fluorocromos FITC, PE ou Percyp, em tríades de anticorpos por tubo, os quais, posteriormente, foram incubados no escuro, a temperatura ambiente, para posterior aquisição média de 10 mil eventos e análise em citômetro de fluxo FACSCalibur por meio do sistema Cell Quest Pro (Becton Dickinson, San Jose, CA) para três cores.

O painel mínimo de anticorpos utilizado para o diagnóstico dos tipos de síndromes linfoproliferativas crônicas compreendeu a combinação de tríades dos seguintes anticorpos comerciais: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD34, CD38, CD45, CD56, CD79b, CD103, CD117, HLA-DR, anti-Kappa, anti-Lambda, FMC7 e imunoglobulinas G e M (IgG e IgM).

Resultados

Das 47 amostras analisadas, quatro foram diagnosticadas como inconclusivas para síndromes linfoproliferativas crônicas e duas foram diagnosticadas como mieloma múltiplo; 41 casos foram diagnosticados positivamente para algum dos subtipos de síndromes linfoproliferativas crônicas (Tabela 1). O subtipo leucemia linfoide crônica/linfoma linfocítico de pequenas células B foi a síndrome linfoproliferativa crônica de maior frequência (28/41; 68,29%). Esses dados foram confirmados após analise morfológica (dados não mostrados).

Quanto ao sexo, segundo a distribuição dos subtipos de síndromes linfoproliferativas crônicas, não houve diferença estatística (p < 0,05).

A análise de faixa etária (Tabela 2) mostrou que a média de idade dos pacientes diagnosticados com síndromes linfoproliferativas crônicas foi de 66,4 ± 11,51 anos (média ± desvio padrão), com mediana de 68 anos.

Discussão

Neste estudo, o método de imunofenotipagem por citometria de fluxo, ao lado da morfologia, de amostras de sangue periférico mostrou-se uma metodologia auxiliar, segura, rápida, factível e não invasiva para o diagnóstico de síndromes linfoproliferativas crônicas, além de a escolha do painel de anticorpos sugerido ter sido suficiente para a diferenciação dos subtipos de síndromes linfoproliferativas.

Esses dados são corroborados por outros autores^{(2-7, 9, 11, 14, 15)} que afirmam que a imunofenotipagem por citometria de fluxo é uma metodologia rápida e precisa e uma ferramenta extremamente útil no diagnóstico, no prognóstico e no monitoramento da terapêutica e da epidemiologia das síndromes linfoproliferativas crônicas. Ressalte-se, entretanto, que em alguns casos o diagnóstico definitivo só é possível por meio de estudo histopatológico da peça anatômica (linfonodos, tecidos linfoides associados a mucosas ou glândulas, baço).

O painel estabelecido neste estudo permitiu, inicialmente, separar as síndromes linfoproliferativas de origem B das de origem T. Apesar de estas últimas não serem tão frequentes e geralmente estarem associadas à infecção pelo vírus linfotrópico de células T (HTLV-1)^{(16, 17)}, neste estudo, foi observado apenas um caso de leucemia pró-linfocítica T.

Quanto ao diagnóstico das síndromes linfoproliferativas de origem B, em especial a leucemia linfoide crônica/linfoma linfocítico de pequenas células B (LLC-B), a presença do fenótipo aberrante CD20/CD5, associada à positividade para CD23 e monoclonalidade de baixa expressão para IgM de superfície, facilitou sua identificação. Embora se discuta na literatura a existência de casos de LLC-B com CD5 negativo, segundo dados, estas ocorreriam em apenas 2% dos casos^{(9, 11, 14, 16)}.

Outro achado importante, a partir do painel proposto neste estudo, foi a possibilidade de observação da expressão de CD38 (dados não mostrados), um marcado característico da linhagem plasmocítica que tem expressão já descrita em mais de 20% dos casos de LLC-B⁽¹¹⁾ associada à ausência de mutação somática da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e a mau prognóstico nesses pacientes; embora, neste estudo, o prognóstico nesses indivíduos não tenha sido avaliado a partir desse achado.

A leucemia pró-linfocítica B foi outro achado importante neste estudo. Mesmo sendo pouco comum e cursando com grandes linfocitoses e esplenomegalia volumosa, foi caracterizada neste estudo pela expressão forte de imunoglobulinas de superfície (IgG e IgM), além de CD20, CD22, CD79b, FMC7 e CD38 positivos, com CD5 negativo, semelhante a outros estudos da literatura⁽¹¹⁾.

O diagnóstico diferencial entre a LLC-B e o linfoma de células do manto, por sua vez, segue caracterização fenotípica já amplamente descrita na literatura com CD22 e CD20/CD5 positivos, CD23 negativo e expressão moderada de IgM^{(9, 16)}.

Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS)^{(13, 16, 17)}, as neoplasias de células B maduras compreendem mais de 85% das síndromes linfoproliferativas crônicas no mundo, com a leucemia linfoide crônica/linfoma linfocítico de pequenas células B tendo maior ocorrência principalmente em países ocidentais, fato semelhante ao observado neste estudo, em que a leucemia linfoide crônica/linfoma linfocítico de pequenas células B apresentou maior frequência (68,29%) entre as síndromes linfoproliferativas crônicas.

Quanto ao sexo e à distribuição da frequência de síndromes linfoproliferativas crônicas diagnosticados, observou-se neste estudo não haver diferença estatística entre eles. Resultado discordante de outros estudos^{(16, 17)}, que revelam uma relação (masculino/feminino) de 1,3/1. Entretanto, os dados deste estudo podem estar subestimados em função do tamanho da amostra analisada.

Quanto à maior frequência de síndromes linfoproliferativas crônicas em pessoas acima da quinta década de vida^{(12, ,17)}, esses dados estão de acordo com os encontrados neste estudo.

Conclusão

Os resultados observados neste estudo confirmaram dados da literatura sobre a frequência dos subtipos de síndromes linfoproliferativas crônicas, bem como sua distribuição em relação à faixa etária.

A citometria de fluxo demonstrou ser uma importante ferramenta no diagnóstico, na classificação e na caracterização fenotípica dos subtipos de síndromes linfoproliferativas crônicas, de forma mais rápida e precisa, e o painel de anticorpos sugerido mostrou-se minimamente suficiente para esse diagnóstico.

Primeira submissão em 28/02/11

Última submissão em 15/06/11

Aceito para publicação em 16/06/11

Publicado em 20/12/11

Suporte financeiro: Ministério da Saúde, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Governo do Estado do Pará, Secretaria de Estado de Desenvolvimento, Ciência e Tecnologia (SEDECT), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Pará (FAPESPA).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Fev 2012
• Data do Fascículo
  Dez 2011

Histórico

• Aceito
  16 Jun 2011
• Revisado
  15 Jun 2011
• Recebido
  28 Fev 2011